Bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor RNA-aptameren en riboswitches

Samenvatting

Het protocol beschrijft de vorming van robuuste en biocompatibele DNA-beladen microcapsules als gemultiplexte in vitro biosensoren die verschillende liganden kunnen volgen.

Samenvatting

We introduceren een protocol voor de bereiding van met DNA beladen zijdefibroïnemicrocapsules via de Layer-by-Layer (LbL) assemblagemethode op offerende bolvormige kernen. Na adsorptie van een eerste laag en DNA-plasmiden werd de vorming van robuuste microcapsules vergemakkelijkt door β-vellen in de secundaire zijdestructuur te induceren tijdens acute uitdroging van een enkele zijdelaag. Vandaar dat de gelaagdheid plaatsvond via meerdere waterstofbindingen en hydrofobe interacties. Na adsorptie van meerlaagse schillen kunnen de kernschilstructuren verder worden gefunctionaliseerd met gouden nanodeeltjes (AuNP's) en/of antilichamen (IgG) om te worden gebruikt voor teledetectie en/of gerichte toediening. Het aanpassen van verschillende belangrijke parameters tijdens sequentiële depositie van belangrijke macromoleculen op silicakernen, zoals de aanwezigheid van een polymeerprimer, de concentratie van DNA en zijde-eiwit, evenals een aantal geadsorbeerde lagen, resulteerde in biocompatibele, DNA-beladen microcapsules met variabele permeabiliteit en DNA-belastingen. Bij het oplossen van silicakernen toonde het protocol de vorming aan van holle en robuuste microcapsules met DNA-plasmiden geïmmobiliseerd op het binnenoppervlak van het capsulemembraan. Het creëren van een selectief doorlaatbaar biocompatibel membraan tussen de DNA-plasmiden en de externe omgeving bewaarde het DNA tijdens langdurige opslag en speelde een belangrijke rol in de verbeterde outputrespons van ruimtelijk beperkte plasmiden. De activiteit van DNA-sjablonen en hun toegankelijkheid werden getest tijdens in vitro transcriptie- en translatiereacties (celvrije systemen). DNA-plasmiden die coderen voor RNA-oplichtende aptameren en riboswitches werden met succes geactiveerd met overeenkomstige analyten, zoals werd gevisualiseerd tijdens de lokalisatie van fluorescerend gelabelde RNA-transcripten of GFPa1-eiwit in de schaalmembranen.

Inleiding

Het gebied van synthetische biologie biedt unieke mogelijkheden om detectiemogelijkheden te ontwikkelen door gebruik te maken van natuurlijke mechanismen die door micro-organismen zijn ontwikkeld om hun omgeving en potentiële bedreigingen te monitoren. Belangrijk is dat deze detectiemechanismen meestal gekoppeld zijn aan een reactie die deze micro-organismen beschermt tegen schadelijke blootstelling, genexpressie reguleert om negatieve effecten te verminderen of inname van giftige materialen te voorkomen. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om deze micro-organismen te ontwikkelen om sensoren met hele cellen te maken die profiteren van deze natuurlijke reacties, maar ze opnieuw richten om nieuwe doelen te herkennen en / of een meetbaar signaal te produceren dat kan worden gemeten voor kwantificeringsdoeleinden (meestal fluorescentie)^1,2. Momenteel wijzen zorgen over het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGO's), met name bij introductie in het milieu of het menselijk lichaam, als gevolg van lekkage van hele cellen of een deel van hun genetisch materiaal, zelfs als het is ingekapseld in een polymeermatrix, erop dat alternatieve manieren nodig zijn om deze detectiebenaderingen te benutten³.

Een krachtige aanpak om de voordelen van op micro-organismen gebaseerde detectie te benutten zonder de zorg voor de inzet van GGO's is het gebruik van in vitro transcriptie/translatie (IVTT) systemen. Vanuit een praktisch perspectief bestaan IVTT-systemen uit een mengsel dat de meeste celcomponenten in een actieve toestand bevat en dat op verschillende manieren uit cellen is "geëxtraheerd", waaronder ultrasoonapparaat, kralenkloppen of andere⁴. Het eindproduct van dit proces is een biochemisch reactiemengsel dat al is geoptimaliseerd om transcriptie en translatie uit te voeren en dat kan worden gebruikt om verschillende sensoren in een "open vat" -formaat te testen, zonder de beperkingen die gepaard gaan met het gebruik van hele cellen (membraandiffusie, transformatie-efficiëntie, celtoxiciteit, enz.). Belangrijk is dat verschillende sensorcomponenten kwantitatief kunnen worden toegevoegd en hun effect kan worden bestudeerd door verschillende optische en spectrometrische technieken, zoals we hebben aangetoond⁵. Het is opgevallen dat de prestaties van IVTT-systemen inconsistent kunnen zijn; Recente studies hebben echter benaderingen aangetoond om hun voorbereiding en karakterisering te standaardiseren, wat van grote hulp is bij het bestuderen van hun prestaties in sensorontwerp⁶. Onlangs zijn veel voorbeelden van IVTT-systemen die worden gebruikt om op papier gebaseerde assays te maken door de lyofilisatie van hun componenten in papieren matrices gedemonstreerd, waaronder detectie van zware metaalionen, geneesmiddelen, quorumdetectie-elementen en andere ^7,8,9. Een opwindende toepassingsruimte voor IVTT-gebaseerde sensoren is hun gebruik in detectietoepassingen in verschillende soorten omgevingen, waaronder bodem, water en het menselijk lichaam. Om deze IVTT-systemen in deze uitdagende omgevingen te implementeren, moet een inkapselingsbenadering worden geïmplementeerd om de IVTT-componenten te bevatten en te beschermen tegen degradatie.

De meest voorkomende inkapselingsbenaderingen voor IVTT-systemen omvatten het gebruik van lipidecapsules, micellen, polymersomen en andere nauw gesloten microcontainers^10,11,12. Een nadeel van deze aanpak is de noodzaak om passieve of actieve mechanismen in te bouwen om materialen in en uit de containers te transporteren om communicatie met de externe omgeving mogelijk te maken en detectiemogelijkheden te bieden. Om enkele van deze problemen op te lossen, rapporteert de studie hier een methode die een eenvoudige maar effectieve aanpak biedt om de coderingsmaterialen voor verschillende sensorontwerpen in te kapselen die in IVTT-systemen moeten worden uitgedrukt. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van Layer-by-Layer (LbL) depositie van een biopolymeer in de aanwezigheid van de plasmiden van belang om holle microcapsules met hoge porositeit te creëren, waardoor het beschermde genetische materiaal kan interageren met de verschillende componenten van de IVTT van keuze. De studie toonde aan dat ingekapselde plasmiden transcriptie en translatie konden sturen wanneer ze binnen deze polymere matrix werden geactiveerd, zoals blijkt uit de respons van een plasmide-gecodeerde aptamer en een riboswitch op hun overeenkomstige doelen. Bovendien beschermt deze LbL-coating de plasmiden maandenlang zonder speciale bewaarcondities.

Protocol

1. Constructie van plasmidevector.

1. Construeer een plasmidevector (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) door amplificatie van de coderende sequentie van een theofylline riboswitch (ThyRS) gekoppeld aan GFPa1 van pJ201:23976-RS-GFPa1 vector (ontworpen en gemaakt door DNA2.0) en insertie in E. coli expressievector, pSAL¹³. Gebruik voorwaartse (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') en omgekeerde (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') primers om de coderende sequentie van ThyRS in combinatie met GFPa1 te versterken en voer een PCR-reactie uit in 50 μL volume met behulp van DNA-polymerase volgens het protocol van de fabrikant¹⁴.
2. Bereid een 1% agarosegel uit 0,5 g agarose, 50 ml TAE-buffer (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA, pH 8,0) en 3 μL DNA-kleuring.
3. Meng 5 μL aliquot van het PCR-versterkte product met 5 μL RNase/DNase-vrij water en 2 μL 6x gel-loading kleurstof en analyseer door agarose-gelelektroforese. Laad een DNA-ladder (0,1-10,0 kb) als referentie. Laat de gel op 120 V lopen totdat de kleurstoflijn bijna de bodem van de gel heeft bereikt.
4. Visualiseer de DNA-fragmenten met behulp van een UV-transilluminator-beeldvormingssysteem om te controleren op de juiste grootte van DNA¹⁵.
5. Zuiver het PCR-product met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens protocol¹⁶ van de fabrikant.
6. Verwerk het PCR-product en de pSAL-expressievector met KpnI- en BlpI-restrictie-enzymen in een reactie van 15 μl, die 10 μl PCR-product of plasmidevector (concentratie 20-50 ng/μl), 1,5 μl 10x enzymbuffer, 1 μl van elk enzym en 1,5 μl RNase/DNase-vrij water bevat, bij 37 °C gedurende 2 uur.
7. Voeg 3 μL 6x gel-ladende kleurstof toe aan het reactiemengsel en scheid de verteerde fragmenten op een 1% agarose-gel zoals beschreven in stap 1.3-1.5.
8. Zuiver de DNA-fragmenten met behulp van een gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant¹⁶.
9. Ligate het verteerde PCR-product in een verteerde gelineariseerde plasmidevector, pSAL, met behulp van T4 DNA-ligase en aangevulde ligasebuffer in een 10 μL-reactie met 3-20 fmol van de verteerde vector, 9-60 fmol van het verteerde PCR-product, 2 μL ligasebuffer, 1 μL (1 eenheid) T4 DNA-ligase en DNase / RNase-vrij water. Incubeer de ligatiereactie bij 25 °C gedurende 3 uur.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het totale DNA-gehalte in het reactiemengsel 0,01-0,1 μg is.
10. Transformeer E. coli DH5α-competente cellen met 10 ng van het ligatiereactiemengsel volgens het protocol van de fabrikant¹⁷.
11. Kweek de getransformeerde cellen 's nachts bij 37 °C op LB-agarplaten aangevuld met ampicilline (100 μg/ml).
12. Pluk 3-4 bacteriekolonies van de plaat en breng elk van hen aseptisch over in 5 ml LB-media aangevuld met ampicilline (100 μg / ml). Kweek de culturen 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 225 tpm.
13. Pellet de nachtculturen door centrifugeren op 11 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
14. Gebruik een zuiveringskit om de plasmiden te zuiveren volgens protocol¹⁶ van de fabrikant.
15. Controleer de sequenties van de gezuiverde plasmiden door DNA-sequencing. De plasmidekaart en de volgorde van de resulterende constructie (pSALv-RS-GFPa1) zijn weergegeven in figuur 1.

2. Grootschalige DNA-zuivering.

1. Transformeer de plasmidevector pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (coderend voor theofylline riboswitch gekoppeld aan GFPa1 reportergen) of pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (coderend voor Broccoli aptamer) in E. coli DH5α competente cellen volgens het protocol van de fabrikant¹⁷.
2. Kweek de getransformeerde cellen 's nachts bij 37 °C op LB-agarplaten aangevuld met ampicilline (100 μg / ml) voor cellen getransformeerd met pSALv-RS-GFPa1 of kanamycine (50 μg / ml) voor cellen getransformeerd met pET28c-F30-2x Broccoli.
3. Pluk 3-4 bacteriekolonies van de plaat en breng elke kolonie aseptisch over in 5 ml LB-media aangevuld met het juiste antibioticum (100 μg / ml ampicilline of 50 μg / ml kanamycine). Kweek de culturen 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 225 tpm.
4. Gebruik 3 ml van de nachtcultuur om te enten in 150 ml LB aangevuld met het juiste antibioticum (100 μg / ml ampicilline of 50 μg / ml kanamycine) en laat de culturen 's nachts groeien bij 37 ° C in een schuddende incubator bij 225 tpm.
5. Pellet de cellen door centrifugeren bij ≥3400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
6. Gebruik een zuiveringskit om de plasmiden te zuiveren volgens protocol¹⁶ van de fabrikant.
7. Elueer het DNA met 0,5 ml zuiver DNase/RNase-vrij water. Meet de DNA-concentratie en bereid 1 ml DNA-stockoplossingen (100 ng/μL). Bewaar de buisjes met DNA bij 4 °C tot verder gebruik.

3. Extractie van zijdefibroïne en bereiding van uitgangsmaterialen.

1. Bereid een waterige oplossing van gereconstitueerd zijdefibroïne (SF) eiwit uit Bombyx mori zijderupscocons volgens de elders in detail beschreven procedure om 10% van de Silk-LiBr-oplossing¹⁸ te vertegenwoordigen.
2. Bepaal de uiteindelijke concentratie van de waterige SF-oplossing. Pipetteer 0,5 ml zijdeoplossing op een petrischaal van 60 mm, laat deze drogen bij 60 °C en meet het gewicht van droge zijdefilm. Deel het drooggewicht door 0,5 ml om het gewichtspercentage per volume te berekenen.
3. Verdun de geconcentreerde zijdeoplossing met DNase/RNase-vrij gedestilleerd water door langzaam water toe te voegen via een serologische pipet om een eindconcentratie van 1 mg/ml te verkrijgen. Bewaar de oplossing bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
4. Bereid fluorescerend gelabelde zijdefibroïne voor met behulp van een antilichaametiketteringskit. Gebruik 1 ml 2 mg / ml zijdefibroïne-oplossing om de N-terminale α-aminogroepen van het eiwit te koppelen aan een NHS-ester-geactiveerde derivatenkleurstof volgens het protocol van de fabrikant¹⁹.
5. Bereid 50 ml polyethyleenimine (PEI) waterige oplossing met een concentratie van 6 mg / ml, pas de pH aan op 4 met HCl (1 M). Filtreer de oplossing door een steriel membraan van 0,2 μm. Opslag is mogelijk bij omgevingsomstandigheden gedurende maanden.
6. Bereid SiO_2-kernen voor. Pipetteer 300 μL SiO₂ deeltjes in een 2 ml microcentrifugebuis. Was de microdeeltjes twee keer met 1 ml DNase/RNase-vrij water door centrifugeren op 0,2 x g gedurende 1 minuut.

4. Voer laag-voor-laag afzetting uit van een priemlaag, DNA-plasmiden en zijdelagen.

1. Om de PEI-primelaag op de SiO_{2-microdeeltjes} af te zetten, voegt u 1 ml PEI-oplossing toe aan de gesponnen pellet uit stap 3.6 en roert u het mengsel onder omgevingsomstandigheden op een thermomixer bij 800 tpm gedurende 15 minuten. Was de deeltjes vier keer met 1 ml DNase/RNase-vrij gedeïoniseerd water door centrifugatie op 0,2 x g gedurende 1 minuut.
2. Om de afzetting van de DNA-laag uit te voeren, voegt u 1 ml van de waterige oplossing van DNA-plasmiden uit stap 2.7 toe aan de PEI-geprimeerde microdeeltjes en roert u het mengsel voorzichtig bij 4 °C op een thermomixer bij 800 tpm gedurende 15 minuten. Om microcapsules met verschillende DNA-belastingen te bereiden, past u de concentratie DNA-plasmiden aan van 50-200 ng / μL met behulp van DNase / RNase-vrij gedestilleerd water en gebruikt u 1 ml van deze oplossingen om het DNA af te zetten. Verzamel de microdeeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 min.
3. Markeer de buizen voor DNA-plasmiden die coderen voor theofylline riboswitch in combinatie met GFPa1 als ThyRS-GFPa1 en DNA-plasmiden die coderen voor Broccoli-aptamer als BrocApt.
   OPMERKING: Bewaar de microcentrifugebuizen met DNA op ijs.
4. Verwijder het supernatant voorzichtig en was de microdeeltjes vier keer met 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water, waarbij het supernatant na centrifugatie telkens 1 minuut bij 0,2 x g wordt weggegooid. Voer alle experimenten uit bij kamertemperatuur (RT), tenzij anders aangegeven.
5. Om de afzetting van de zijdevezellaag uit te voeren, voegt u 1 ml van de gereconstitueerde waterige SF-oplossing uit stap 3.3 toe aan de DNA-geadsorbeerde microdeeltjes, vortex u voorzichtig en roert u het mengsel bij 10 °C op de thermomixer bij 750 tpm gedurende 15 minuten. Verzamel de microdeeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C, verwijder het supernatant en was ze vervolgens eenmaal met 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water. Herhaal de centrifugatie en gooi het supernatant weg.
   OPMERKING: Houd tijdens het experiment de oplossing van zijde op ijs om temperatuurgeïnduceerde gelatie te voorkomen.
6. Behandel de deeltjes geleidelijk met methanol om β-sheet vorming in zijde-eiwitstructuur te induceren. Voeg eerst 0,5 ml DNase / RNase gedestilleerd water toe, vortex de microcentrifugebuis en voeg vervolgens 0,5 ml 100% methanol toe. Schud de deeltjes op de thermomixer voorzichtig bij 10 °C gedurende 5 minuten. Verzamel de deeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 min. Verwijder het supernatant.
7. Behandel de deeltjes met methanol om de vorming van β-sheets te bevorderen en zorg voor een sterke fysieke adsorptie van de zijdelaag. Voeg 1 ml 100% methanol toe. Schud de deeltjes op de thermomixer voorzichtig bij 750 rpm gedurende 10 minuten bij 10 °C.
8. Verzamel de deeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C en was ze tweemaal met 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water elke keer, gooi het supernatant weg en draai voorzichtig voor de volgende centrifugatie.
9. Herhaal stap 4,5-4,8 20 keer om zijde meerlaagse kernschaalstructuren te verkrijgen. Gebruik voor de laatste depositiestap fluorescerend gelabelde zijde uit stap 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
10. Voer de laatste wasstap uit en bewaar de microdeeltjes in 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water onder omgevingsomstandigheden.
    OPMERKING: Om aggregatie van deeltjes tijdens afzetting van zijdelagen te voorkomen, voert u een visuele inspectie uit van de deeltjessuspensie en pipet u deze op en neer met behulp van een pipetpunt van 1 ml om de homogene deeltjesverdeling te bevorderen.
11. Bereken het aantal DNA-plasmidekopieën ingekapseld in elke microcapsule, _N-DNA met behulp van vergelijking 1:
    (1)
    Waarbij N = 6,769 × 10¹¹ - het aantal SiO 2-kernen dat wordt gebruikt voor inkapseling. Bereken het uit een standaardcurve voor bekende concentraties van silicadeeltjes met behulp van seriële verdunningen en absorptie A 320 bij λ =₃₂₀ nm;
    C- initiële concentratie van DNA gebruikt voor adsorptie
    V- het volume DNA dat wordt gebruikt voor adsorptie
    0.8- DNA-adsorptie-efficiëntie op de kernen
    M_w- Molecuulgewicht van DNA-plasmide
    N_A- Avogadro's nummer (6.022 × 10²³)

5. Oplossen van kernen om zijden microcapsules te verkrijgen.

1. Bereid 8% fluorwaterstofzuur (HF) oplossing, pH 5,5, door stockoplossing (48%) te verdunnen met gedestilleerd water. Schaf een centrifugebuis van 50 ml aan. Pipet voorzichtig 5 ml HF en voeg 25 ml gedestilleerd water toe om 8% HF-oplossing te verkrijgen.
   LET OP: HF is een zeer corrosief zuur en kan ernstige brandwonden aan de weefsels veroorzaken. Uiterste voorzichtigheid is geboden bij het hanteren en gebruiken van HF voor de experimenten. Houd u aan de Standard Operating Procedure (SOP) voor het juiste gebruik en de juiste behandeling van HF die door de organisatie is ontwikkeld om ongewenste ongevallen met morsen te voorkomen. Gebruik geen glazen containers om HF-zuur te verdunnen. Gebruik de chemische kap om deze stap van het protocol uit te voeren.
2. Los SiO_2-kernen op door 1,5 ml 8% HF-oplossing toe te voegen aan gepelleteerde kern-schil microdeeltjes uit stap 4.10. Draai zachtjes en laat kernen 's nachts oplossen onder omgevingsomstandigheden met zacht schudden bij 450 tpm.
   OPMERKING: Om morsen van HF te voorkomen, gebruikt u enttape om de microcentrifugebuis af te dichten. Gebruik een chemische kap om deze stap van het protocol uit te voeren.
3. Bereid een glazen bekerglas van 2 L gevuld met 2 L gedeïoniseerd water. Breng microcapsules-oplossing over naar dialyseapparaten (50 kDa MWCO) en dialyseer ze tegen gedeïoniseerd water met een herhaalde verandering van het water om de 3 uur gedurende de volgende 3 dagen.
   OPMERKING: Verzamel het supernatant tijdens de eerste drie uitwisselingen van water en gooi de oplossing weg volgens het vastgestelde protocol voor gevaarlijke afvalstoffen.
4. Gebruik een pipet van 1 ml om de suspensie van dialyseapparaten over te brengen naar nieuwe microcentrifugebuizen van 2 ml om de microcapsules op te vangen.
   OPMERKING: Bewaar de waterige oplossingen van microcapsules gedurende meerdere jaren onder omgevingsomstandigheden.

6. Beeldvorming van zijde fibroïne microcapsules met behulp van confocale laser scanning microscoop (CLSM).

1. Voer DNA-kleuring uit met behulp van een DNA-kleurstof.
   1. Breng 300 μL holle zijde fibroïne microcapsules over in een verse microcentrifugebuis van 1 ml. Voeg 500 μL RNase/DNase-vrij gedestilleerd water toe.
   2. Voeg 5 μL van de DNA-kleurstof toe, kort vortex, en incubeer bij RT gedurende 2 uur beschermd tegen licht.
   3. Voer vier wasstappen uit door te centrifugeren bij 0,1 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C elke keer, waarbij voorzichtig 400 μL van het supernatant wordt verwijderd en aangevuld met 400 μL RNase/DNase-vrij gedestilleerd water.
2. Voer de beeldvorming van zijden capsules uit op omgekeerde confocale systemen die zijn uitgerust met drie grote lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm) met behulp van een olie-onderdompelingsobjectief van 100x (NA 1,49). Breng 100 μL van het capsulemonster over in een enkele put van 8-goed gekamerde glasglaasjes, laat capsules 20-30 minuten bezinken voordat ze worden afgebeeld.
   OPMERKING: Kleurstoffen zijn erg gevoelig voor fotobleaching. Bescherm de monsters door de dia's af te dekken met aluminiumfolie.

7. Schatting van de permeabiliteit van holle microcapsules met behulp van de MWCO-methode (Molecular weight cut-off).

1. Bereid 2 ml elk van FITC-gelabelde dextran fluorofooroplossingen (20 μM, diH 2 O) van verschillende M_w (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa en₂MDa).
2. Pipetteer 100 μL van de suspensie van capsules in een enkele put van een glazen schuifplaat. Analyseer elk microcapsuleontwerp (PEI-concentratie, laadaantal DNA-plasmiden, de concentratie van zijdefibroïne en het aantal lagen) afzonderlijk.
3. Voeg aan elke put 300 μL van de specifieke fluorofooroplossing toe vanaf de laagste M_w tot de hoogste, zodat elke put overeenkomt met de specifieke fluorofooroplossing. Meng door op en neer te pipetteren en laat het mengsel gedurende 1 uur bij RT incuberen totdat de diffusie van fluorofooroplossingen in evenwicht is.
4. Breng de dia over naar een confocale laserscanmicroscoop (CLSM) en beeld elke put af met behulp van een olie-onderdompelingsobjectief van 100x bij excitatie λ = 488 nm.
   1. Identificeer het interessegebied door het brandpuntsvlak aan te passen om ervoor te zorgen dat de capsules verschijnen in de vorm van cirkels met de grootste diameter. Dit gebeurt meestal bij het bekijken van de monsters dichter bij de bodem van de put wanneer capsules sediment als gevolg van de zwaartekracht.
   2. Verzamel verschillende afbeeldingen van microcapsulemonsters door de dia in XY-richting te bewegen. Leg afbeeldingen vast om rekening te houden met maximaal 100-150 capsules voor elk monster.
   3. Gebruik ImageJ-software om de permeabiliteit van het membraan van de capsule in elke_M-w fluorofooroplossing te analyseren door fluorescentie-intensiteiten binnen en buiten de capsules te vergelijken. Teken daarvoor een interessegebied (ROI) in de vorm van een cirkel om de omtrek van de capsule te schetsen en klik op Analyseren / Meten om de fluorescentie-intensiteit binnenin te meten. Tabel de gegevens in een spreadsheet. Voer deze bewerking uit voor elke microcapsule voor een totaal van 200-300 capsules.
   4. Beoordeel de fluorescentie-intensiteit van buitenaf op dezelfde manier door de ROI te schetsen en de intensiteit buiten de capsules te meten. Voer 3-5 metingen uit voor statistische analyse.
   5. Om statistische analyse uit te voeren, vergelijkt u de fluorescentie-intensiteiten binnen en buiten de capsules met behulp van een gepaarde t-test (p < 0,05).
   6. Gebruik de conversietabel 2 om de permeabiliteit van microcapsules te schatten op basis van de hydrodynamische radii voor FITC-Dextran met variabele M_w.

8. In vitro activering van synthetische theofylline riboswitch in zijden microcapsules

1. Bereid 1 ml theofylline stockoplossing (100 mM, DMSO). Bereid het E. coli S30-extractsysteem voor circulair DNA door de componenten gedurende 40 minuten op ijs te ontdooien.
2. Verkrijg een 0,5 ml DNase/RNase-vrije microcentrifugebuis. Voer in vitro transcriptie/translatiereactie uit, combineer de celvrije componenten met een monster van microcapsules in de volgende volgorde (50 μL totaal volume): S30 premix zonder aminozuren (20 μL); S30-extract, cirkelvormig (15 μL); compleet aminozurenmengsel (5 μL); holle microcapsules met ThyRS-GFPa1-plasmiden uit stap 4.10 (9 μl); en theofylline, 100 mM DMSO (1 μL).
   OPMERKING: Nadat u alle componenten hebt toegevoegd, draait u de buis kort en verzamelt u het monster tijdens een korte centrifugatie bij 0,2 × g gedurende een paar seconden.
3. Incubeer de buis bij 30 °C gedurende 4 uur en controleer de fluorescentie op een plaatlezer met behulp van excitatie bij λ = 488 nm en emissie bij GFP/FITC-filter (510 nm ± 20 nm).
4. Beeld de capsules op elk LCSM-systeem met behulp van 488 nm- en 561 nm-lasers. Verkrijg beelden van de beste kwaliteit met behulp van een 100x olie-onderdompelingsobjectief en 8-goed gekamerde dia's.

9. In vitro activering van broccoli aptamer in zijde microcapsules

1. Bereid 1 ml stamoplossing van DFHBI-1T-kleurstof (30 μM, diH₂O). Bereid de PURE (eiwitsynthese met behulp van recombinante elementen) celvrije systeemreactiekit door de componenten gedurende 40 minuten op ijs te ontdooien.
2. Verkrijg een 0,5 ml DNase/RNase-vrije microcentrifugebuis. Voer in vitro transcriptiereactie uit door celvrije reactiecomponenten te combineren met een monster van microcapsules in de volgende volgorde (50 μL totaal volume): oplossing A (20 μL); oplossing B (15 μL); holle microcapsules met BrocApt-plasmiden uit stap 4.10 (14 μl); en DFHBI-1T kleurstof (1 μL).
   OPMERKING: Nadat u alle componenten hebt toegevoegd, draait u de buis kort en verzamelt u het monster tijdens een korte centrifugatie bij 0,2 × g gedurende een paar seconden.
3. Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 6 uur en controleer de fluorescentie op een plaatlezer met behulp van excitatie bij λ_ex = 470 nm en emissie bij λ_em = 510 nm ± 20 nm.
4. Beeld de capsules op elk LCSM-systeem met behulp van 488 nm- en 561 nm-lasers. Verkrijg beelden van de beste kwaliteit met behulp van een 100x olie-onderdompelingsobjectief en 8-well coverglass chambered slides.

Resultaten

Hier richt de studie zich op de functionaliteit van DNA-sjablonen die coderen voor verschillende sensorontwerpen (twee soorten RNA-gereguleerde transcriptie / translatie-elementen) na inkapseling in zijden eiwitcapsules. Microcapsules werden bereid via templated Layer-by-Layer (LbL) assemblage van de belangrijkste componenten: een prime-laag, DNA-plasmiden die sensorontwerpen coderen en zijdefibroïnebiopolymeer (figuur 2). Depositie van macromoleculen op een gelaagde manier maakt het mogelij...

Discussie

Selectief doorlatende hydrogel-microcapsules geladen met verschillende soorten DNA-gecodeerde sensorontwerpen kunnen volgens dit protocol worden bereid. Een van de onderscheidende kenmerken van de LbL-benadering is het vermogen om de complexiteit van microcapsules aan te passen tijdens de bottom-up assemblage, die meestal begint met de adsorptie van moleculaire soorten op offersjablonen. Door de concentraties van de initiële componenten, pH-omstandigheden en het aantal lagen zorgvuldig aan te passen, kunnen microcapsules...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)	Lucerna	DFHBI-1T
5x T4 DNA Ligase Buffer	ThermoFisher Scientific	46300-018
6x Blue Gel Loading Dye	New England BioLabs	B7021S
96-well plates, black circular	Corning	3601
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	BioReagent, voor moleculaire biologie, lage EEO
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	poeder of kristallen, BioReagent, geschikt voor celkweek
BlpI restrictie-enzymen	New England BioLabs	R0585S
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	FisherScientific	09-761-1
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	472301	ACS reagent, ≥99,9%
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5,4 kb), BrocApt.	Addgene	Plasmid #66788
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen)	ThermoFisher Scientific	84530
E. coli S30 extract systeem voor circulair DNA	Promega	L1020
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL	FisherScientific	14-959-53A
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL		14-432-22
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1,5 mL	FisherScientific	05-408-129
Hydrofluoric acid, HF	Sigma-Aldrich	695068	ACS reagent, 48%
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615	mengsel van Kanamycin A (hoofdcomponent) en Kanamycin B en C
KpnI restrictie-enzymen	New England BioLabs	R0142S
LB agar plate aangevuld met 100 µg/mL ampicilline	Sigma-Aldrich	L5667	voorgegoten agar platen met 100 µg/mL ampicilline
LB agar plate aangevuld met 50 µg/mL kanamycine	Sigma-Aldrich	L0543	voorgegoten agar platen met 50 µg/mL kanamycine
LB broth (Lennox grade)	Sigma-Aldrich	L3022
Lithium bromide, LiBr	Sigma-Aldrich	213225	ReagentPlus, ≥99%
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain	ThermoFisher Scientific	18258012
Methanol	MilliporeSigma	322415	watervrij, 99,8%
MilliQ-water	EMD MilliPore		Milli-Q Reference Water Purification System
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC	Sigma-Aldrich	E1769
PBS (fosfaat gebufferd zout)	ThermoFisher Scientific	10010023	1x PBS, pH 7,4
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Polyethylenimine, vertakking	Sigma-Aldrich	408727	gemiddelde Mw ~25.000
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit	New England BioLabs	E6800S
QIAEX II Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0,1-10,0 kb)	New England BioLabs	N0469S
SiO? silica microspheres, 4,0 µm	Polysciences, Inc.	24331-15	10% waterige oplossing
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3,5K MWCO, 15 mL	ThermoFisher Scientific	87724
Sodium carbonate, Na?CO?	Sigma-Aldrich	222321	ACS reagent, watervrij, ≥99,5%, poeder
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices	FisherScientific	08-607-008	Spectrum G235058
SYBR Safe DNA gel stain	ThermoFisher Scientific	S33102
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	ThermoFisher Scientific	EL0011
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633	watervrij, ≥99%, poeder
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer)	Sigma-Aldrich	T6025	Bevat 40 mM Tris-acetaat en 1 mM EDTA, pH 8,3.
UltraPure DNase/RNase-Free Gedestilleerde Water	FisherScientific	10-977-023
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit	ZymoResearch	D4202