Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Summary

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Abstract

Tijdens de ontwikkeling van een meercellig organisme deelt een enkele bevruchte cel zich en geeft aanleiding tot meerdere weefsels met verschillende functies. Weefselmorfogenese gaat hand in hand met moleculaire en structurele veranderingen op het niveau van één cel die resulteren in variaties van subcellulaire mechanische eigenschappen. Als gevolg hiervan, zelfs binnen dezelfde cel, verzetten verschillende organellen en compartimenten zich anders tegen mechanische spanningen; en mechanotransductiepaden kunnen hun mechanische eigenschappen actief reguleren. Het vermogen van een cel om zich aan te passen aan de micro-omgeving van de weefselniche is dus deels te wijten aan het vermogen om mechanische spanningen te detecteren en erop te reageren. We hebben onlangs een nieuw mechanosensatieparadigma voorgesteld waarin nucleaire vervorming en positionering een cel in staat stelt om de fysieke 3D-omgeving te meten en de cel een gevoel van proprioceptie geeft om veranderingen in celvorm te decoderen. In dit artikel beschrijven we een nieuwe methode om de krachten en materiaaleigenschappen te meten die de celkern in levende cellen vormen, geïllustreerd op aanhangende cellen en mechanisch opgesloten cellen. De metingen kunnen niet-invasief worden uitgevoerd met optische vallen in cellen en de krachten zijn direct toegankelijk door kalibratievrije detectie van lichtmoment. Dit maakt het mogelijk om de mechanica van de kern onafhankelijk van celoppervlakvervormingen te meten en dissectie van exteroceptieve en interoceptieve mechanotransductieroutes mogelijk te maken. Belangrijk is dat het vangexperiment kan worden gecombineerd met optische microscopie om de cellulaire respons en subcellulaire dynamiek te onderzoeken met behulp van fluorescentiebeeldvorming van het cytoskelet, calciumionen of nucleaire morfologie. De gepresenteerde methode is eenvoudig toe te passen, compatibel met commerciële oplossingen voor krachtmetingen en kan gemakkelijk worden uitgebreid om de mechanica van andere subcellulaire compartimenten te onderzoeken, bijvoorbeeld mitochondriën, stressvezels en endosomen.

Introduction

Weefselmorfogenese is een complex proces waarbij biochemische signalen en fysische krachten spatiotemporaal op elkaar worden afgestemd. In het zich ontwikkelende embryo dicteren gradiënten van biochemische signaleringsfactoren de lotspecificatie en zorgen ze voor een correct ^{weefselpatroon1,2}. Tegelijkertijd spelen intrinsieke en extrinsieke krachten een rol bij het bouwen van de architectuur van het ^embryo3,4. De invloed van de celcortexmechanica in deze context is uitgebreid ^{bestudeerd5,6}. De nauwe interconnectie tussen mechano-chemische processen tijdens morfogenese is afhankelijk van de eigenschappen van afzonderlijke cellen om mechanische krachten in hun weefselmicro-omgeving te detecteren en erop te reageren. Cellen decoderen daarbij mechanische signalen via de aanwezigheid van krachtgevoelige subcellulaire en moleculaire elementen die mechanische informatie omzetten in specifieke signaalroutes die het celgedrag, het lot van cellen en celmechanica regelen.

Een kenmerk van ontwikkelingsprocessen is dat cellen zich organiseren als groepen om meercellige structuren te bouwen. Als zodanig herschikken en bewegen afzonderlijke cellen zelden alleen, maar worden ze geassocieerd in een strakke sociotoop waarin ze collectief gedrag vertonen zoals supracellulaire ^migratie7, (on)jamming ^{overgangen8,9} of blastocystverdichting10. Mechanische krachten die in en tussen cellen worden gegenereerd, dienen als belangrijke aanwijzingen om collectieve celdynamica te instrueren7,11. Maar zelfs wanneer cellen alleen bewegen, zoals voorlopercellen die zich een weg banen tussen weefselbladen of smalle weefselniches, ervaren ze uitgebreide anisotrope mechanische krachten bij het navigeren door een driedimensionale omgeving. Deze mechanische spanningen op cellen hebben ingrijpende gevolgen voor het cellulaire ^gedrag12,13. Er zijn verschillende mechanismen onderzocht die convergeren op de kern als een belangrijk mechanotransductie-element14,15, als passief of actief mechanisch element tijdens migratie binnen een dichte 3D-weefselomgeving15,16.

We hebben onlangs een mechanisme voorgesteld dat cellen uitrust om vormvervormingen te meten met behulp van de kern als een elastische intracellulaire mechano-gauge12. De kern, het grootste organel in een cel, ondergaat grote vervormingen wanneer cellen polariseren, migreren of hun vorm veranderen onder mechanische rek, opsluiting of osmotische stress16,17,18,19. We ontdekten dat nucleaire enveloppen samen met de intracellulaire positionering van de kern cellen informatie geven over de grootte en het type celvervorming (zoals celcompressie versus celzwelling). Het uitrekken van de kern wordt geassocieerd met een ontplooiing van het binnenste nucleaire membraan (INM), dat calciumafhankelijke cPLA2 (cytosolische fosfolipase A2) lipaseactiviteit bij het INM bevordert, gevolgd door de afgifte van arachidonzuur (AA) en snelle activering van myosine II in de celcortex. Dit leidt tot verhoogde celcontractiliteit en amoeboïde celmigratie boven een drempel van corticale ^{contractiliteit6}. De mechanosensieve respons op celvervorming treedt op in minder dan een minuut en is omkeerbaar bij het loslaten van de opsluiting, wat suggereert dat de kern fungeert als een rekstrook voor cellulaire proprioceptie die adaptief celgedrag onder mechanische stressomstandigheden reguleert. Deze mechanosensitieve route blijkt actief te zijn in voorloperstamcellen afgeleid van zebravisembryo's, zowel in pluripotente als afstammingsgebonden ^cellen12 en wordt geconserveerd in verschillende soorten en ^cellijnen20.

Naast de nucleaire eigenschappen als celmechanosensor, worden nucleaire architectuur en mechanica intrinsiek gereguleerd tijdens de ontwikkeling en in reactie op celbestemmingsspecificatie21, waardoor cellulaire mechano-gevoeligheid22,23 wordt afgestemd. Het gevolg kan een verandering in nucleaire naleving zijn die morfologische veranderingen en overgangen van een premigratory naar een migrerende staat mogelijk maakt en vice ^versa8.

Verschillende technieken om celkernmechanica te meten zijn toegepast, zoals atoomkrachtmicroscopie24,25, micropipette-aspiratie26,27, microfluïdische ^{technologie28} en micronaalden29. Veel van deze technieken zijn echter invasief in de zin dat de hele cel moet worden vervormd, waardoor de meting van mechanische kenmerken en krachtafhankelijke reacties van de kern zelf wordt beperkt. Om de gelijktijdige vervorming van het celoppervlak en zijn mechanosensitieve ^celcortex30 te omzeilen, werden geïsoleerde kernen bestudeerd in verschillende ^{contexten31,32}. Het kan echter niet worden uitgesloten dat nucleaire isolatie geassocieerd is met een verandering in mechanische kerneigenschappen en hun regulatie (^referentie24 en eigen ongepubliceerde waarnemingen).

Optische pincetten (OT's) zijn een veelzijdige technologie die een overvloed aan experimenten in celmechanobiologie mogelijk heeft gemaakt en een belangrijke rol heeft gespeeld in ons begrip van hoe moleculaire machines chemische energie omzetten in mechanische ^energie33,34. Een optisch pincet gebruikt een strak gerichte laserstraal om optische krachten uit te oefenen op diëlektrische deeltjes met een brekingsindex die hoger is dan het omringende ^medium33. Dergelijke krachten kunnen in de orde van grootte van honderden pico-Newtons zijn en resulteren in een effectieve opsluiting van het deeltje binnen de laservalfocus, waardoor manipulatie van het gevangen deeltje in drie dimensies mogelijk is. Het gebruik van licht heeft als belangrijk voordeel dat de meting niet-invasief kan worden uitgevoerd in levende cellen. Optische manipulaties zijn verder beperkt tot de valfocus van de laserstraal. Daarom kan de manipulatie worden uitgevoerd zonder de omliggende celmembranen te stimuleren en verstoort het de actinecortex of mechanosensitieve processen bij het plasmamembraan niet, zoals de krachtafhankelijke activering van ionkanalen.

De moeilijkheid van de optische pincetbenadering is om de krachten die op de microsfeer worden uitgeoefend nauwkeurig te bepalen met behulp van klassieke benaderingen die afhankelijk zijn van indirecte krachtkalibratie op basis van de equipartitiestelling of het gebruik van gedefinieerde Stokes-sleepkrachten om een laservermogensafhankelijke ontsnappingskracht te ^meten35. Hoewel deze methoden eenvoudig te implementeren zijn in een in vitro experiment, kunnen ze meestal niet worden vertaald naar een cellulaire omgeving. Er zijn verschillende strategieën in het veld geïntroduceerd die afhankelijk zijn van een directe krachtkalibratie, afgeleid van de eerste principes van ^{momentumbehoud36,37}. In tegenstelling tot andere krachtspectroscopiebenaderingen worden krachtmetingen afgeleid uit een lokale uitwisseling van lichtmoment met het willekeurig gevormde gevangen ^deeltje38,39. In onze experimentele opstelling worden veranderingen in lichtmoment als gevolg van optische krachten direct gemeten zonder dat in situ valkalibratie40,41,42,43 nodig is. Zo worden de metingen mogelijk in een viskeuze omgeving zoals het binnenste van de cel of zelfs in een weefsel, en kunnen krachten gemakkelijk worden gekwantificeerd tot op pN-niveau.

In dit protocol beschrijven we een test om intracellulaire organellen of structuren mechanisch te manipuleren en hun mechanische eigenschappen kwantitatief te beoordelen door middel van een optische pincetopstelling. Deze opstelling is geïntegreerd in een fluorescerende microscoop met draaiende schijf die parallelle beeldvorming van cellulair gedrag of intracellulaire dynamica mogelijk maakt. De test maakt de karakterisering van de mechanische eigenschappen van specifieke cellulaire compartimenten, zoals de kern, mogelijk, terwijl tegelijkertijd de mogelijke mechanorespons en activering van moleculaire signaalroutes als gevolg van de vervorming zelf worden bestudeerd. Bovendien zorgt optische vangst van geïnjecteerde microbeads in cellen voor een toename van de inkepingskracht dankzij een aanzienlijk hogere brekingsindex van de polystyreenkraal (n = 1,59) in vergelijking met het intrinsieke brekingscontrast44 van de kern (n ~ 1,35) versus cytoplasma (n ~ 1,38). De gepresenteerde strategie kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere intracellulaire structuren en organellen, evenals andere benaderingen met actieve microrheologie, het gebruik van meerdere optische vallen om dezelfde / verschillende subcellulaire structuren tegelijkertijd te onderzoeken, en metingen gericht op celmechanobiologie in het levende embryo.

Protocol

Alle gebruikte protocollen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Ethic Committee (PRBB-IACUEC) en geïmplementeerd volgens nationale en Europese regelgeving. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de principes van de 3V's. Zebravissen (Danio rerio) werden gehandhaafd zoals eerder beschreven.

1. Bereiding van geïsoleerde primaire embryonale zebravis voorloperstamcellen

1. Micropipette en agarose bereiding
   OPMERKING: Voor een volledig micro-injectieprotocol voor zebravissenembryo's, zie ^referentie45.
   1. Trek met een micropipette-trekker aan een glazen capillair van 1,0 mm om twee naalden te ^verkrijgen45. Bewaar de ongebruikte naalden in een petrischaaltje van 150 mm dat aan een afspeelkussen is bevestigd of in een inside-out laboratoriumtapering om de dunne punt te beschermen tegen beschadiging tijdens het transport.
   2. Smelt 1% ultrapuur agarose in E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4) in een standaard keuken/lab magnetron gedurende 10 s. Verwarm het mengsel herhaaldelijk gedurende korte perioden (enkele seconden) totdat de agarose smelt.
   3. Wanneer de agarose volledig is gesmolten, laat je hem kort afkoelen en giet je hem vervolgens in een petrischaaltje van 10 cm. Voeg langzaam de driehoekige micro-injectiemal (zie Tabel met materialen) toe aan de bovenkant van de agarose om het verschijnen van bubbels te voorkomen. Duw de mal niet, zorg ervoor dat deze op het agarose-oppervlak blijft.
   4. Wanneer de agarose volledig stolt, verwijdert u de driehoekige mal heel langzaam door een zachte kracht uit te oefenen om breuken in de agarose te voorkomen. De plaat kan ondersteboven bij 4 °C gedurende 2-4 weken worden bewaard.
   5. Haal 30 minuten voor de micro-injectie de plaat uit de koelkast en voeg E3 voorgewarmd tot 28 °C toe om het bij kamertemperatuur te laten stabiliseren.
2. Bereiding van de injectiemix
   1. Om het injectiemengsel te bereiden, verdunt u 1 μm microbeads (polystyreen, niet-fluorescerend) in een verhouding van 1:5 in RNase-vrij water.
   2. Bereid mRNA voor op voorbijgaande expressie van fluorescerende markers of expressie van recombinante genconstructen en/of co-injectie van morfolino in de gewenste concentratie.
      OPMERKING: Een typisch injectiemengsel voor de co-injectie van microbeads samen met 100 pg mRNA per embryo om te labelen, bijvoorbeeld, de kern met H2A-mCherry is: 1 μL kralen + 1 μL mRNA (stamconcentratie is 1 μg / μL) + 2,5 μL RNA-vrij water + 0,5 μL fenolrood (stamoplossing 0,5%, fenolrood is niet verplicht; het wordt gebruikt voor een betere visualisatie van de geïnjecteerde druppel, maar de niet-gelabelde injectie daling is ook zichtbaar voor een ervaren experimentator). RNA-injectie kan ook nuttig zijn om geïnjecteerde embryo's te selecteren. Fluorescerende microbeads kunnen worden geïnjecteerd, in plaats van niet-fluorescerend, om ze te visualiseren.
3. Micro-injectie naald laden en kalibreren
   1. Schakel de micro-injector in met de optie Time-Gated . Deze instelling is erg belangrijk om het injectievolume goed te kalibreren. Stel de gatingtijd in op ongeveer 500 ms.
   2. Laad 3 μL van het injectiemengsel in de naald met behulp van een pipet met microlader.
   3. Steek de naald in de micromanipulator en sluit deze goed af. Controleer of de micromanipulator zich in een goede positie bevindt en voldoende bewegingsvrijheid heeft om in x-y richting op de injectieplaat te bewegen.
   4. Meet de druppelgrootte met behulp van een micrometerschuif (5 mm /100 divisies) met een druppel minerale olie ^bovenop45 en werp een druppel van het injectiemengsel rechtstreeks in de minerale olie.
   5. Snijd de naald met een scherpe tang in een steile hoek om een scherpe punt te genereren. Stel de druppelgrootte in op 0,1 mm, wat overeenkomt met 0,5 nL geïnjecteerd materiaal.
      OPMERKING: Als door het snijden van de naald dit volume wordt overschreden, wordt aanbevolen de kalibratieprocedure opnieuw uit te voeren met een nieuwe naald. De gatingtijd van de micro-injector kan enigszins worden aangepast aan het druppelvolume; korte gattijden komen echter overeen met een grote naalddiameter, die de embryo's mogelijk beschadigt.
4. Micro-injectie van zebravisembryo's in eencellig stadium
   1. Verzamel zebravisembryo's kort na de bevruchting voor micro-injectie van het kralenmengsel rechtstreeks in het embryo van het eencellige (zygote) stadium voordat de eerste celdeling plaatsvindt.
      OPMERKING: Dit zorgt voor een goede verdeling van microsferen en een voldoende hoge opbrengst van geïsoleerde blastomeren met ten minste één microsfeer per cel in latere ontwikkelingsstadia waarin experimenten worden uitgevoerd (blastula-gastrula-stadium). Inspringingsexperimenten kunnen nog steeds worden uitgevoerd als er twee bollen in de cel zijn, maar cellen die geen kralen hebben, moeten worden uitgesloten (hoewel inspringing zonder bollen mogelijk is). AB wildtype stammen werden gebruikt in dit protocol, maar elke andere stam, bijvoorbeeld TL kan worden gebruikt.
   2. Plaats embryo's van eencellig stadium (zygote) in een voorgewarmde driehoekige 1% agarosevorm, zoals weergegeven in figuur 1A, met behulp van een plastic Pasteur-pipet.
   3. Verwijder extra medium met dezelfde pipet om te voorkomen dat de embryo's rondzweven. Duw de embryo's voorzichtig via een borstel in de driehoekige mal. Houd wat ruimte tussen de embryo's om de juiste oriëntatie te vergemakkelijken (figuur 1B).
   4. Lijn de embryo's voorzichtig uit met een borstel zodat de embryo's zijdelings georiënteerd zijn, waarbij de ene cel van de zygote duidelijk zichtbaar is, zoals weergegeven in figuur 1B. Een ideale oriëntatie voor micro-injectie wordt bereikt wanneer de ene cel van het embryo in de naaldrichting is gericht (injectie via de dierlijke pool van het embryo) of op de tegenovergestelde manier naar de dooiercel (injectie via de plantaardige pool van het embryo), zoals weergegeven in figuur 1C.
   5. Houd de schaal met één hand vast en gebruik de andere hand om de naaldpunt te positioneren met behulp van de micromanipulatorcontroller. Laat de naaldpunt naar de embryo's zakken.
   6. Doorprik het chorion en ga het eencellige embryo binnen met de naald terwijl u de procedure via de stereomicroscoop bewaakt. Zorg voor de juiste plaatsing van de naald en, na het injecteren, de juiste locatie van de geïnjecteerde druppel zoals weergegeven in figuur 1C.
   7. Herhaal voor alle embryo's: beweeg de naald omhoog, schuif de schaal met de embryo's totdat het volgende embryo gecentreerd is, laat de naald zakken en injecteer het.
   8. Zodra de hele set embryo's is geïnjecteerd, verwijdert u de embryo's uit de agarose-schimmel / petrischaal door wat E3 door te spoelen en ze in een nieuwe petrischaal te doen met behulp van een plastic Pasteur-pipet. Het wordt aanbevolen om voldoende media op de injectieplaat te plaatsen om uitdroging van embryo's tijdens de micro-injectieprocedure te voorkomen.
   9. Herhaal de procedure totdat het gewenste aantal embryo's is geïnjecteerd. Embryo's moeten zich in één celstadium bevinden om een maximale en homogene verspreiding van de kralen te garanderen.
      OPMERKING: Deze procedure is geoptimaliseerd voor vroege blastula-embryo's en moet waarschijnlijk worden geoptimaliseerd als verschillende ontwikkelingsstadia moeten worden onderzocht.
   10. Plaats de geïnjecteerde embryo's in een couveuse bij 28-31 °C gedurende ongeveer 4 uur of tot het gewenste stadium (figuur 1D) voordat u verdergaat met het protocol voor primaire celkweek.
       OPMERKING: Laat de embryo's zich eventueel verder ontwikkelen dan het blastulastadium (of het gewenste meettijdpunt) om overleving te garanderen en toxiciteitsartefacten uit te sluiten. Monteer in larvale stadia verdoofde larven met tricaïne in 0,75% agarose en beeld de verdeling van microsferen in verschillende weefsels in. Om een stamoplossing te maken, meng: 400 mg tricaïnepoeder in 97,9 ml gedestilleerd water, ongeveer 2,1 ml 1 M TRIS-base (pH 9) en pas aan tot pH 7. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 °C. Om tricaïne als verdovingsmiddel te gebruiken, verdun 4,2 ml stamoplossing in 100 ml medium van het ei (of gewenste media); in dit geval werd E3 gebruikt. Raadpleeg ^referentie46 voor meer informatie.

2. Eencellige bereiding en kleuring

1. Plaats de bolstadiumembryo's (4 hpf, uren na de bevruchting) in een glazen schaal met behulp van een plastic Pasteur-pipet. Selecteer de embryo's die positief zijn voor het signaal van de geïnjecteerde kralen en die het fluorescerende eiwit tot expressie brengen in het geval van mRNA-injectie. Sommige embryo's kunnen een hoge kraalclustering vertonen en kunnen worden uitgesloten.
   1. Dechorioneer de embryo's handmatig met behulp van een tang. Breng ongeveer 10-15 embryo's over in reactiecontainers van 1,5 ml met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
      OPMERKING: Wanneer de embryo's worden gedechorioneerd, hechten ze zich aan het plastic en is het gebruik van glaswerk vereist. Als alternatief voor de glasplaat kan een plastic petrischaaltje met een dun laagje 1% agarose worden gebruikt. Manuele dechorionatie verdient de voorkeur boven enzymatische Pronase-behandeling om proteolytische schade aan celoppervlakeiwitten en mogelijke veranderingen in mechanische cel- en weefseleigenschappen te voorkomen, waardoor langere hersteltijden worden ^voorkomen47.
2. Verwijder de E3-media en voeg 500 μL voorverwarmd _{CO2-onafhankelijk} weefselkweekmedium toe (DMEM-F12; met L-glutamine en 15 mM HEPES, zonder natriumbicarbonaat en fenolrood aangevuld met 10 eenheden penicilline en 10 mg / L streptomycine).
   OPMERKING: Gebruik geen _{CO2-afhankelijke} media tenzij een microscoopincubator wordt gebruikt. Het gebruik van bijvoorbeeld RPMI in carbonaatgebufferde omstandigheden veroorzaakt veranderingen in de pH van de media en kan de celoverleving beïnvloeden. Een ander belangrijk aspect is het vermijden van kweekmedia die serum bevatten. Serum kan Lysophosphatidic acid (LPA) bevatten, een krachtige activator van de Rho/ROCK-route, die in staat is om cellulaire contractiliteit en motiliteit in voorloperstamcellen te ^beheersen6. De osmolariteit van het medium moet op 300 mOsm worden gehouden om osmotische uitdagingen te voorkomen die de nucleaire morfologie of mechanica kunnen ^verstoren12.
3. Dissociëren cellen handmatig door de buis voorzichtig te schudden. Zorg ervoor dat de inhoud van de buis troebel wordt zonder dat er grote brokken zichtbaar zijn voor het oog. Vermijd de vorming van bubbels om de schade en het verlies van cellen te minimaliseren.
4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 min. De pellet moet duidelijk zichtbaar zijn.
5. Verwijder het supernatant en volg een van de onderstaande stappen.
   1. Als er geen kleuring nodig is, voegt u 500 μL DMEM toe. Voorzichtig resuspenderen met een pipet van 200 μL door een vloeistofstraal op de pellet te richten. Oefen geen overmatige schuifkracht uit op de cellen. Schuimvorming duidt op schade aan de cellen.
   2. Voor het labelen van de kern met DNA-kleurstoffen zoals Hoechst, meng 0,5 μL DNA-Hoechst (voorraad 2 mg / ml) in 1.000 μL DMEM om 1 μg / ml eindconcentratie te verkrijgen. Voeg 500 μL van deze kleuringsoplossing toe aan de cellen en resuspendatie voorzichtig. Incubeer gedurende 7 minuten in het donker.
   3. Om de cellen te kleuren met een fluorescerende chemische calciumindicator Calbryte-520, voegt u Calbryte-520 toe aan een concentratie van 5 μM in DMEM. Incubeer gedurende 20 minuten in het donker.
      OPMERKING: De protocollen die worden aangegeven in stap 2.5.2 en 2.5.3 zijn geoptimaliseerd voor deze specifieke producten. Andere kleuringen kunnen worden uitgevoerd met behulp van de protocollen die door de fabrikant zijn aangegeven.
6. Centrifugeer opnieuw met dezelfde instellingen als in stap 2.4; verwijder het supernatant en suspend de cellen voorzichtig (om de vorming van clusters te voorkomen) in 50 μL DMEM voor monsters in suspensie of 20 μL DMEM voor cellen in opsluiting.

3. Bereiding van optische vangkamers met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) afstand

OPMERKING: Optische krachtmetingen op basis van lichtmomentdetectie vereisen de opvang van al het licht dat uit de optische vallen ^komt40. Voor de robuustheid van de invariante kalibratiefactor α (pN/V) moet de lichtverdeling aan de achterkant van het brandpuntsvlak (BFP) van de optische krachtsensor een nauwkeurige overeenkomst vertonen met het fotonenmoment. Dit bepaalt de afstand van het oppervlak van de opvanglens tot het vangvlak tot ongeveer 2 mm, wat de maximale hoogte van de optische vangkamers is.

1. PDMS spin-coating van #1.5 glazen bodemschalen.
   OPMERKING: Het volgende recept is voorzien voor ongeveer 40 gerechten. De resulterende microkamer zal verschillende hoogtes hebben, afhankelijk van of experimenten moeten worden uitgevoerd op hangende of opgesloten cellen (figuur 1D).
   1. Meng 9 ml van het basispolymeer PDMS en 1 ml PDMS-uithardingsmiddel in een conische buis van 50 ml. Meng de twee producten actief om een goede verdeling van de uithardingsmiddel te garanderen.
   2. Ontgas het mengsel om bellen te voorkomen met behulp van een vacuümpomp. Breng de conische buis in een vacuümfles en evacueer de kamer. Wacht tot er geen bubbels in het mengsel aanwezig zijn.
      OPMERKING: Open het vacuüm langzaam om schuimvorming en morsen van de PDMS uit de valkbuis te voorkomen.
   3. Plaats de glazen bodemschaal op de spin-coater klauwplaat (figuur 2A). Wees voorzichtig om niet te krabben, vingerafdrukken te nemen of het vaat vies te maken. Bescherm de spin-coater box tegen PDMS-lekken met aluminiumfolie.
   4. Voor OT-kamers voor experimenten op cellen in suspensie, voegt u ongeveer 250 μL PDMS-mengsel toe in het midden van de onderste schotel en draait u het gedurende 1 minuut op 750 tpm. De hoogte van de PDMS-laag zal ongeveer 50 μm ^zijn48.
   5. Voeg voor OT-kamers voor experimenten op opgesloten cellen een kleine druppel PDMS (ongeveer 50 μL) toe en draai deze gedurende 5 minuten op 4.000 tpm. De hoogte van de PDMS-laag zal ongeveer 10 μm zijn. Voor een gedetailleerd protocol over het verkrijgen van verschillende PDMS-diktes, zie ^referentie48.
   6. Laat de PDMS-gecoate glazen bodemschalen 1 uur uitharden bij 70 °C.
   7. Knip met een scalpel een vierkant van 1 x 1 cm op de PDMS-laag en pel deze af met een pincet (figuur 2C). In het geval van opgesloten cellen, was PDMS-vuil met isopropanol.
2. Kamercoating voor experimenten met licht bevestigde cellen in suspensie
   1. Voeg 100 μL Concanavalin A (ConA) toe aan 0,5 mg/ml om het gehele oppervlak van de vierkante holte te bedekken en laat het gedurende 30 minuten incuberen.
      OPMERKING: ConA is een lectine dat zich bindt aan suikers aan het celoppervlak en individuele cellen koppelt aan het oppervlak van de afdekglas.
   2. Verwijder de ConA-druppel en spoel het oppervlak zorgvuldig af met DMEM-medium zonder krassen op het met ConA behandelde oppervlak.
   3. Voeg 30 μL van het eerder bereide monster (stap 2.6) toe aan de put en resuspend voorzichtig om eventuele celclusters te verwijderen.
   4. Sluit de holte door voorzichtig een 22 x 22 mm #1.5 afdekglas bovenop de PDMS velgen te plaatsen (laat het niet abrupt vallen, gebruik indien mogelijk een tang, figuur 2B, C).
      OPMERKING: Elke dikte van de afdekplaat zou werken voor de bovenste glazen afdekking (de opvanglens heeft een werkafstand van 2 mm).
3. Kamervoorbereiding voor experimenten met cellen in opsluiting
   1. Plaats een druppel van 10 μL met cellen (stap 2.6) in de vierkante holte (figuur 2B).
   2. Sandwich het monster heel voorzichtig met een dekglas van 22 x 22 mm, zodat de druppel zich in het hele gebied verspreidt en er geen bubbels worden waargenomen. Nogmaals, het is handig om een tang te gebruiken, zoals weergegeven in figuur 2C, om te voorkomen dat het dekglas abrupt valt.

4. Alternatieve opties voor OT-kamerafstand

OPMERKING: Deze stappen kunnen worden gevolgd als er geen microfabricagewerkplaats of spincoater beschikbaar is.

1. Kamervoorbereiding voor experimenten met cellen in suspensie
   OPMERKING: Als er geen spincoater beschikbaar is, kan een afstandhouder worden gemaakt met behulp van normale, dubbelzijdige scotch tape (ongeveer 100 μm hoog).
   1. Knip een stuk dubbelzijdige scotch tape met een vierkant gat van ongeveer 10 cm x 10 cm in het midden (dezelfde afmetingen als in PDMS, figuur 2B).
   2. Verwijder een van de beschermende lagen van de tape door deze af te pellen en plaats de onbedekte kant van de tape in het midden van een schaal met glazen bodem van # 1,5 H. Druk zachtjes om al het oppervlak aan het glas te hechten terwijl luchtbellen worden vermeden en verwijder vervolgens de resterende beschermende laag van de tape door deze af te pellen.
   3. Volg de instructies in stap 3.2.
2. Kamervoorbereiding voor experimenten met cellen in opsluiting
   OPMERKING: Om cellen nauwkeurig op te sluiten, kunnen monodisperse microdeeltjes met een bekende diameter worden gebruikt als afstandhouders tussen de twee afdekglazen.
   1. Voeg 10 μm polystyreenparels toe aan gesuspendeerde cellen in een concentratie van ¹⁰⁴ kralen/μL.
   2. Plaats een druppel van 10 μL oplossing met cellen en kralen op een dekglas van 22 x 60 mm.
   3. Sandwich het monster heel voorzichtig met nog eens 22 x 60 mm dekglas, zodat de druppel zich in het hele gebied verspreidt en er geen bubbels worden waargenomen. Om het bovenste afdekglas voorzichtig te positioneren (vermijd dat het abrupt naar beneden valt), is het handig om een tang te gebruiken.
   4. Omdat het monster kan uitdrogen, wordt aanbevolen om de voorbereiding snel uit te voeren.

5. De optische val instellen voor intracellulaire metingen

OPMERKING: De volgende stappen zijn geoptimaliseerd voor een commercieel optisch pincetplatform bestaande uit een optische micromanipulatiemodule op basis van acousto-optische doorbuiging (AOD) en een optische krachtsensor op basis van directe detectie van lichtmomentveranderingen (Figuur 2, referentie12,40,49). Details en optische componenten van de opstelling zijn te vinden in figuur 2F. Om door kracht geïnduceerde vervorming tijdens de optische pincetmanipulaties te observeren, wordt een Nipkow spinning-disk confocale microscoop gekoppeld aan de linkerpoort van de omgekeerde microscoop voor beeldvorming van twee kleurenfluorescentie. Zonder het gebrek aan algemeenheid kan dit protocol worden toegepast met elk dynamisch OT-systeem dat is uitgerust met directe krachtmetingen op basis van lichtmomentdetectie. Gedetailleerde stapsgewijze procedures zijn beschikbaar voor het bouwen van zelfgebouwde optische gradiëntvallen voor in vivo ^{toepassingen50}. Die op basis van AOD-modulatie vallen op door eventuele experimenten met meerdere vallen en snelle ^{metingen51,52}. Verschillende protocollen om een op lichtmoment gebaseerd instrument te construeren bestaan in de literatuur36,39,40,53, en elke andere beeldvormingsmodaliteit (differentieel interferentiecontrast, widefield fluorescentie, enz.) kan worden gebruikt.

1. Opstarten van een optisch pincet
   1. Om de stabiliteit van het uitgangsvermogen te optimaliseren, schakelt u de laser ten minste 30 minuten voor het experiment in bij een aanzienlijk hoog vermogen (bijv. 3 W).
   2. Schakel de elektronicamodule van de optische micromanipulatie- en krachtmeeteenheden in.
      OPMERKING: Pas alle laserveiligheidsmaatregelen toe en gebruik alleen apparatuur die is goedgekeurd door het institutionele bestuur. Gebruik nooit de oculairs van de optische microscoop wanneer de laser aan staat. Gebruik altijd een goedgekeurde IR-beschermingsbril (OD7 in het bereik van 950-1080 nm), blokkeer het IR-laserlicht met de sluiter in de epifluorescentiepoort 2 en voer de optische vangsoftware niet uit totdat de uitlijning van de optische krachtsensor na stap 5.3 is voltooid. Gebruik over het algemeen geen sterk reflecterend monster, omdat de rugreflectie schade aan de laser kan veroorzaken.
   3. Regel het valvermogen met het roterende HWP (figuur 2F) bij de ingang van de optische micromanipulatiemodule.
      OPMERKING: De commerciële optische micromanipulatiemodule die in dit protocol wordt gebruikt, bevat deze functie al. Voor zelfgebouwde optische vangsystemen integreert u deze tool voor vermogensregeling, zodat hogere en stabielere laservermogens kunnen worden gebruikt.
2. Gebruik een lege microkamer voor kalibratie
   1. Knip een vierkant van 1 x 1 cm op een dubbelzijdige scotch tape en bevestig deze op een 1 mm dikke microscoopglaasjes.
   2. Voeg water toe aan het vierkant en sluit het vanaf de bovenkant af met een #1,5 dekglas (22 x 22 mm). Het toevoegen van een iets groter volume water, bijvoorbeeld 30-40 μL, wordt geadviseerd om bellen in de overdekte kamer te vermijden. Veeg de kalibratiekamer voorzichtig af in geval van water dat eruit morst.
3. Uitlijning van de optische krachtsensor
   1. Zet een druppel water op de 60x/1.2 waterdompelingsdoelstelling. Plaats de kalibratiekamer op het podium met het #1.5 afdekglas naar het objectief gericht. Focus op het onderste oppervlak, waar de celmonsters uiteindelijk zullen zijn.
   2. Voeg een druppel dompelolie toe bovenop de bovenste glasplaat die het monster bedekt (figuur 2D). Laat de opvanglens van de krachtsensor voorzichtig zakken totdat deze in contact komt met de oliedruppel.
      OPMERKING: De druppel moet groot genoeg zijn zodat deze de hele lens bedekt die het laserlicht verzamelt dat uit de vallen komt. Meestal is 200 μL voldoende om het hele oppervlak te bedekken en een stabiel onderdompelingscontact te bieden. Wees voorzichtig en vermijd overvulling omdat het in het monster kan lekken.
   3. Volg het protocol van de fabrikant voor de uitlijning van de optische krachtsensor en bekijk het voorbeeldvlakbeeld op de hulpcamera die zal worden gebruikt om de OT's te positioneren (AUX, figuur 2F). Laat de optische krachtsensor heel voorzichtig zakken totdat de veldstop (FS, figuur 2F-G) geconjugeerd op het monstervlak verschijnt. Dit zorgt voor de juiste directe krachtmetingen van monsterinvariante detectie van ^{lichtmomentveranderingen40}.
      OPMERKING: Sluit de FS voldoende zodat de afbeelding kleiner wordt dan het gezichtsveld (FOV), dus zichtbaar. Wees extra voorzichtig en duw de opvanglens van de optische krachtsensor niet tegen het monster. De verticale positie van de optische krachtsensor kan ook worden bepaald door analyse van de vanglichtverdeling op de BFP voor lichtkegels met gedefinieerd numeriek diafragma (NA).
   4. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oliedruppel zitten; deze kunnen direct van invloed zijn op de krachtmetingen. Om te controleren op luchtbellen, plaatst u de Bertrand-lens op zijn plaats (BL, figuur 2G) en observeert u het beeldvormingspad door het oculair. Als er vuil of luchtbellen zichtbaar zijn of als er meer olie nodig is (figuur S1A), reinigt u de lens en kamer met stofvrij lensweefsel en herhaalt u de procedure in de stappen 5.3.2 en 5.3.3. Een onbelemmerd optisch pad is afgebeeld in figuur S1B.
   5. Gebruik de laterale schroeven die op de houder van de optische krachtsensor zijn geplaatst, centreer de FS in de FOV. Open voor de nauwkeurigheid de FS zodat deze bijna de FOV vult die zichtbaar is op de hulpcamera (AUX, figuur 2F).

6. Optische pincet optimalisatie

OPMERKING: De directe krachtmeting is uitsluitend gebaseerd op de verandering van het lichtmoment als gevolg van de kracht die op het gevangen deeltje wordt uitgeoefend, en dus hoeft de valstijfheid, in tegenstelling tot indirecte methoden, niet voorafgaand aan elk experiment te worden gekalibreerd. De instrumentspecifieke omzetting van de afbuigings-/krachtfactor (α; pN/V, ^referentie41) wordt door de fabrikant gekalibreerd en is dus experimentinvariant. Omdat de laserspot echter wordt gemanipuleerd over een gebied van 70 μm x 70 μm, zijn stappen 6.2-6.5 van cruciaal belang om optimale vang- en stroomstabiliteit te garanderen. De volgende stappen worden geleverd in de software van de fabrikant, zodat de OT's op een semi-automatische manier over het werkgebied worden geoptimaliseerd.

1. Start de OT-software en de acquisitiesoftware voor camera AUX.
2. Trek de initiële spanningsbasislijn af door te klikken op stap 1: Elektronica offset in het submenu Systeemkalibratie van de optische pincetbesturingssoftware.
3. Om het valvermogen af te vlakken over het OT-werkgebied, stelt u het valvermogen in op de helft van het maximum door het HWP dienovereenkomstig te roteren. Verander het valvermogen niet door de laseruitgang te veranderen, maar met het roterende HWP (figuur 2F). Klik op Stap 2: Power om de geautomatiseerde routine voor trap power flattening te starten.
   OPMERKING: Dit is een cruciale stap om de variatie van het valvermogen in het werkgebied van de OT's te compenseren (figuur S1D). Een succesvolle routine brengt de variatie in valvermogen terug tot 2% over het werkgebied van de OT's en convergeert na 2 minuten.
4. Als u de kalibratie van de valpositie wilt uitvoeren, verwijdert u het IR-filter zodat het licht van de laser zichtbaar is op de camera. Zoek de IR-plek door het beeldvlak op het onderste oppervlak van de microkamer te richten. Verkrijg de kleinst mogelijke IR-spot door het beeldvlak (objectiefpositie) en het histogramcontrast af te stemmen in de AUX-acquisitiesoftware van de camera. Verminder indien nodig het vermogen van de optische val door het HWP te roteren (figuur 2F). Klik op Stap 3: Positie om de geautomatiseerde routine- of trappositioneringskalibratie te starten.
   OPMERKING: Deze routine maakt de nauwkeurige overeenstemming van de positiecoördinaten van de OT in camera AUX met de AOD-stuurhoeken mogelijk. Een succesvolle routine genereert de angle-to-position mapping in enkele seconden.
5. Initiële momentumcompensatie
   OPMERKING: De beweging van de optische val over het monster veroorzaakt variaties in de licht-momentumverdeling bij de BFP (figuur S1E, F). Dit leidt tot krachtonafhankelijke signaalveranderingen met betrekking tot de laserpositie boven het werkgebied, ook al is het valvermogen afgevlakt zoals in stap 6.3. Het gevolg is een variatie in de basislijn van de kracht als gevolg van de positie (onafhankelijk van een werkelijke kracht die inwerkt op de optisch gevangen kraal) die voorafgaand aan elk experiment moet worden gecorrigeerd.
   1. Stel het valvermogen in dat in de experimenten zal worden gebruikt door het HWP te roteren (figuur 2F).
   2. Klik op de optie Algemene verschuiving in het submenu Gereedschappen . Hiermee wordt de Offset Cancel-assistent van de optische pincetsoftware geopend die de initiële momentumbasislijn corrigeert.
   3. Klik op Offset | Compenseer om het initiële momentum van de positievariant te corrigeren.
      OPMERKING: Als er gedurende de lopende weken geen wijziging van invloed is op het optische pad, blijven de trap power flattening (stap 6.3) en positie (stap 6.4) kaarten invariant. We raden daarom aan om altijd dezelfde combinatie van optische elementen (dichroïsche spiegels, filters, enz.) te gebruiken die het laservalpad kunnen beïnvloeden of om een nieuwe afvlakkingsroutine voor valvermogen uit te voeren. Met betrekking tot de initiële momentumcompensatie (stap 6.5) biedt de fabrikant van het OTS-platform een on-the-fly kalibratie die moet worden gewijzigd voor elke nieuwe vangkracht en experimentele sessie. De stappen 6.3 en 6.4 moeten worden uitgevoerd op de lege kalibratiedia die in stap 5.2 wordt beschreven. In een monster dat cellen of andere voorwerpen bevat, moet stap 6.5 worden uitgevoerd zonder voorwerpen die de lichtverstrooiing in het werkgebied van de OT's kunnen veranderen.
6. Optioneel, vang een microsfeer en verplaats de val met een bekende snelheid terwijl u het krachtsignaal registreert. Stel bijvoorbeeld de val in om een driehoekige oscillatie uit te voeren: het opgenomen krachtsignaal is een vierkant signaal.
   OPMERKING: De krachtwaarde moet lineair toenemen met de snelheid, afhankelijk van de weerstandskracht die op de kraal inwerkt. Deze test dient als een positieve controle dat krachtmetingen correct worden ^uitgevoerd38. Als alternatief kan de optische krachtsensor worden gebruikt om de optische vangstijfheid, κ [pN/μm], en de positiekalibratiefactor, β [μm/V], te verkrijgen uit vermogensspectrale ^analyse35. Bij de juiste uitlijning is de door de fabrikant verstrekte invariante kalibratiefactor α = κ·β [pN/V].
   1. Start een real-time krachtmeting door te klikken op Plot 1 in het submenu Maatregelen in de software van de fabrikant. Dit geeft een aflezing van de huidige optische vangkracht en -vermogen.
   2. Open het dialoogvenster Oscillatieparameters in het submenu Gereedschappen . Stel een driehoekige golfvorm in in de keuzeringen Vorm en Type. Stel bijvoorbeeld een amplitude in van 10 μm en een frequentie van 3 Hz. Dit resulteert in een viskeuze kracht van ongeveer 1 pN op een microbead met een diameter van 1 ^μm38.
   3. Klik in het AUX-venster van de camera met de rechtermuisknop op de microbead en selecteer Oscillateren starten. De krachtmeting wordt een vierkant krachtsignaal met plateaus bij ±1 pN.
   4. Klik met de rechtermuisknop op de microbead en selecteer Stop Oscillating.

7. Spinning disk confocale microscopie

1. Schakel de confocale microscoop en accessoireapparatuur met draaiende schijf, de geïntegreerde lasermotoren en de acquisitiecamera's in.
2. Start de beeldbewerkingssoftware.
3. Stel beeldkanalen in voor Hoechst-kleuring van de kern en GFP voor het celplasmamembraan.
   1. Activeer de 405 nm en 488 nm excitatielaserlijnen.
   2. Voeg een multiband dichroic toe om de excitatie aan het monster te reflecteren en die het uitgezonden licht naar de camera's laat gaan.
   3. Splits de fluorescentie-emissie met een dichroïsche spiegel van 500 nm lange passrand.
   4. Gebruik de EMISSIEFILTERS DAPI/BFP (~445 nm) en GFP (~521 nm) voor respectievelijk de twee acquisitiecamera's. Zie figuur 2F,G.
   5. Stel de belichtingstijd in op 100 ms voor elk kanaal.
   6. Stel de laseremissie in om een vermogen van 5 mW op het monstervlak te verkrijgen. Om het vermogen te meten, gebruikt u een commerciële vermogensmeter.
4. Stel het imagingprotocol in. Om te voorkomen dat spectrale afloop van het Hoechst-kanaal naar het GFP-kanaal gaat, moeten de twee kleurstoffen achtereenvolgens in beeld worden gebracht.
   OPMERKING: Als er een hardwaresynchronisatie bestaat tussen de AOD's van de optische val en de camera-acquisitie, controleert u of de triggerpolariteit correct is ingesteld. Neem bij twijfel contact op met uw facility manager of microscoopfabrikant.

8. Uitvoeren van de nucleus indentatie experimenten

OPMERKING: Schakel altijd de optische vallen uit - zowel met behulp van software als het sluiten van de sluiter op epifluorescentiepoort 2 - bij het optillen van de krachtsensormodule en het vervangen van het monster. Zo niet, dan kan ernstige schade aan optische elementen en de experimentator optreden. Wees voorzichtig met de zijdelingse afstand tussen de lenshouder en de onderste schotelrand bij het zoeken naar cellen om te voorkomen dat de lens in het podium / de kweekschaal botst (figuur 2).

1. Plaats het monster in de microscoop en volg stap 5.3 van dit protocol.
2. Stel met behulp van het roterende HWP (figuur 2F) het valvermogen in op 200 mW als startwaarde als de stijfheid van de onderzochte kern of intracellulaire structuur niet bekend is. Vertaal het WERKGEBIED van de OT's (met behulp van de microscoopfase) naar een plaats zonder cellen om de initiële momentumbasislijn door stap 6.5 te compenseren.
   OPMERKING: Afhankelijk van de stijfheid van de subcellulaire structuur moet de waarde van het valvermogen worden aangepast aan lagere of hogere waarden om een vergelijkbare indrukdiepte te verkrijgen.
3. Zoek met behulp van de microscooptrapsoftwarecontroller naar een cel met een of twee kralen via overgedragen brightfield-microscopie (figuur 3A).
4. Definieer een valtraject.
   1. Open het dialoogvenster Traject in het submenu Gereedschappen en kies Verplaatsing in de selectiering Trajecttype .
   2. Schrijf in het numerieke blad de verplaatsing en tijd van elke volgende trajectstap. Hier zijn twee voorbeelden.
   3. Voor een stressontspanningsexperiment programmeer je trapeziumbelastingen, zoals weergegeven in figuur 3B. In tabel S1 werden twee trapeziumvormige inkepingen toegepast met een reisafstand van 5 μm; snelheid van 5 μm/s; wachttijd voor terugtrekking: 10 s.
   4. Voor een repetitief inkepingsexperiment met een constante snelheid om een driehoekige routine te verkrijgen zonder verblijftijd op de kern, stelt u de trajectamplitude in, bijvoorbeeld 5 μm, en de tijd voor de stap, bijvoorbeeld 2 s voor een snelheid van 2,5 μm / s. In tabel S2 wordt dit achtmaal toegepast met dezelfde snelheid.
      OPMERKING: Deze waarden moeten voor elk celtype en experiment worden bepaald, maar de volgende parameters van een trapeziumvormige routine leggen de belangrijkste dynamiek vast in het hier gepresenteerde experiment. De wachttijd moet voldoende zijn voor de kern om zijn volledige spanningsontspanning na inkeping te tonen
5. Een microsfeer vangen
   1. Plaats het beeldvlak iets boven de kraal met de microscooptrapsoftwarecontroller.
   2. Activeer vallen met behulp van de OT-software en klik op de kraal in het AUX-beeldvenster van de camera (gekalibreerd na stap 6.4). Succesvolle opsluiting van de kraal door de optische val zal de beweging van de kraal sterk verminderen.
   3. Klik en sleep de kraal over het cytoplasma en plaats deze op een afstand van ~2 μm van de nucleaire envelop (figuur 3A). Zorg ervoor dat het traject zo is ingesteld dat de inkeping van de kraal loodrecht op het kernmembraan staat.
6. Optioneel, indien nodig voor positiemetingen van de kraal ten opzichte van de val, scant u de val over de kraal om de overvangstijfheid te bepalen, k [pN/μm]⁵⁴, waardoor Δxbead = -F/k (zie Discussie). De optische micromanipulatiemodule die in dit protocol wordt gebruikt, heeft hiervoor een ingebouwde routine.
   1. Open het dialoogvenster Deeltjesscan in het submenu Gereedschappen .
   2. Selecteer de trap die u wilt scannen en Hoge frequentie als scanmethode. Selecteer de richting (x of y) van het inspringingstraject voor de meting van het scannen van kralen.
   3. Er verschijnt een venster met de meting van de vangstijfheid. Sleep in de grafiek de twee cursors om het lineaire overvulgebied te selecteren dat overeenkomt met F = -kx. De lineaire aanpassing aan het geselecteerde gegevensgedeelte wordt automatisch vernieuwd.
      OPMERKING: Stel de beginpositie van de kraal ver van het celmembraan in (~ 5 μm), omdat licht-momentumafbuigingen op de medium-celinterface de geschiktheid van krachtmetingen beïnvloeden. Als de kern zich te dicht bij het celmembraan bevindt, probeer dan de kern vanaf de tegenovergestelde plaats in te schakelen. Gooi de cel weg als dat niet mogelijk is.
7. Start de beeldacquisitie door op de acquisitieknop in de beeldvormingssoftware te klikken.
8. Start de trappositie en forceer het opslaan van meetgegevens door op Data | Opslaan in het real-time force reading venster (geopend als in stap. 6.6.1).
   OPMERKING: De optische val is uitgerust met een triggeringang die kan worden aangesloten op de timinguitgang van de camera. Zo worden beeld- en krachtgegevens hardware-gesynchroniseerd en kan de elektronica de valcycli in kaart brengen met het aantal frames van de afbeeldingen tijdens de acquisitie.
9. Start het eerder geladen traject door met de rechtermuisknop op de kraal te klikken en Traject starten te selecteren.
10. Wacht tot het traject klaar is en het systeem stabiliseert.
11. Stop het opslaan van meetkrachtmetingen. Er verschijnt een dialoogvenster voor het opslaan van gegevens.
    OPMERKING: Om de gegevensopslag te optimaliseren, kunnen gegevens worden gedecimeerd door de parameter decimeren in dit dialoogvenster te selecteren (10, 100 of 1000).
12. Stop beeldacquisitie en plot de resultaten in de nabewerkingssoftware van de keuze van de gebruiker.
13. Als de microsfeer tijdens de routine verloren gaat en de kern niet kan worden ingesprongen (figuur S2), gooi dan de meting weg en verhoog het vermogen. Houd er rekening mee dat stap 6.5 moet worden herhaald. In onze handen wordt ten minste 95% van de routines met succes voltooid zonder de kraal uit de val te verliezen.

Results

Micro-injectie van vangkralen:
Microsferen geïnjecteerd in het eencellige zebravisembryo verspreidden zich tijdens morfogenese over de hele dierkap. Voor een duidelijkere visualisatie herhaalden we het injectieprotocol met rode fluorescerende microbeads en namen we volumetrische beelden met onze confocale microscoop in verschillende ontwikkelingsstadia. In figuur 4A-D worden geïnjecteerde kralen gevisualiseerd in het cytoplasma van voorloperstamcellen in vivo bij 5 hfp. Later verschenen microsferen verspreid over het hele embryo bij 24 hpf (figuur 4E). Embryo's in beide stadia ontwikkelden zich normaal en de overlevingskansen waren vergelijkbaar met niet-geïnjecteerde of nagebootste embryo's (zie figuur S3). Dit komt overeen met andere studies die onverstoorbare overleving van kralen geïnjecteerde zebravissen tot 5 dagen na de bevruchting ^melden55.

Onze confocale microscoop met draaiende schijf is compatibel met meerkanaals fluorescentiemicroscopie. In figuur 5A tonen we geïsoleerde stamcellen met één of twee kralen in het cytoplasma. Meerdere fluorescerende labels kunnen worden gebruikt om verschillende aspecten van de cel te onderzoeken (figuur 5B). Nucleaire morfologie kan worden gevolgd met een Hoechst-kleurstof of met behulp van een H2A::mCherry mRNA-expressie, terwijl het binnenste kernmembraan kan worden geanalyseerd met Lap2b-eGFP12. Dynamica van de actomyosine cortex, evenals intracellulaire calciumspiegels, kan worden waargenomen met respectievelijk een My12.1::eGFP transgene ^lijn56 en Calbryte-520 incubatie. Het protocol dat hier is beschreven, is bedoeld om de celkernmechanica van geïmmobiliseerde wildtypecellen te vergelijken op kleefsubstraten (later suspensie genoemd) en in mechanische opsluiting. Geïsoleerde stamcellen opgesloten in microkamers van 10 μm hoogte vertoonden gedeeltelijke ontplooiing van het binnenste kernmembraan (INM) en een daaropvolgende toename van actomyosinecontractiliteit12. In figuur 5C zijn opgesloten cellen met één of twee kralen in het cytoplasma weergegeven. Succesvolle opsluiting zal zichtbaar zijn via afgeplatte, uitgebreide cellen met een bredere doorsnede van de kern. Het kernmembraan wordt verder uitgevouwen in opgesloten cellen en zou gladgestreken moeten lijken in vergelijking met cellen in suspensie (figuur 5C).

Kracht-tijd en kracht-vervorming analyse
De analyse van de verkregen resultaten hangt sterk af van het onderzochte specimen en de vraag van belang en daarom kunnen ze hier niet worden gegeneraliseerd. Een veelgebruikte manier om inkepingsmetingen te analyseren, is bijvoorbeeld het extraheren van een Young's modulus door een aangepast Hertz-model aan te passen aan de kracht-indentatiegegevens57. De aanname voor een dergelijke behandeling moet echter zorgvuldig worden beoordeeld en kan niet altijd naar behoren worden gemotiveerd (zoals dat de onderzochte structuur isotroop, homogeen, met lineaire elasticiteit en inkepingen kleiner zijn dan de kraalstraal). We beschouwen hier dus alleen modelonafhankelijke metingen die het mogelijk maken het mechanische gedrag van de onderzochte structuur te vergelijken tussen verschillende experimentele scenario's.

Als uitgangspunt biedt het meten van de helling van de krachtverplaatsingscurve op een bepaalde indrukdiepte een maat voor een modelonafhankelijke structurele ^stijfheid58 van de kern. Deze waarde kan vervolgens worden verzameld uit meerdere monsters en worden vergeleken tussen verschillende experimentele instellingen en steekproefverstoringen.

Inspringingsmeting
In de volgende regels richten we ons op de mechanische respons van de celkern tijdens celvervorming in opsluiting. Experimenten in stap 8 van dit protocol leiden doorgaans tot krachtpieken tot 200 pN voor inkepingsdieptes van ongeveer 2-3 μm. Deze waarden kunnen echter grotendeels verschillen, afhankelijk van het celtype en de experimentele omstandigheden, waarbij zachtere kernen leiden tot een lagere kracht voor een bepaalde inkeping. Het is daarbij nodig om de nucleaire vervorming nauwkeurig te meten, samen met kracht, voor een nauwkeurige mechanische karakterisering van de celkern. In deze sectie zullen we de celkernstijfheid verkrijgen uit representatieve krachtinspringingsmetingen.

In figuur 6 tonen we de vervormingen van de distale en proximale zijden van een kern in een zwevende en opgesloten cel. Er kan een rijk mechanisch gedrag worden waargenomen. In een typische hangende cel op een kleefsubstraat was de kern sterk ingesprongen door de kraal, maar ook enigszins verplaatst bij repetitieve duwgebeurtenissen. We maten de inkeping van de kraal op de kern door de kymografen te analyseren die werden verkregen uit fluorescentiebeeldvorming van Hoechst-gekleurde celkernen. Kymografen werden eenvoudig berekend met behulp van Fiji's Multi Kymograph-plug-in langs de inspringingsrichting (figuur 6A, B) en geïmporteerd in Matlab (versie 2021, Mathworks) voor verdere verwerking. Op het ruwe intensiteitsprofiel werd een stapfunctie aangebracht met als doel de afbakeningsranden van de kern langs het traject van de inkepingsroutine te volgen. Zoals te zien is, bevat het nauwkeurige informatie over de kernverandering in vorm (figuur 6 en figuur S2). We gebruikten de volgende dubbel-sigmoïde curve als een analytische versie van een stapfunctie:

(Vergelijking 1)

Hier geven _x1 en _x2 de distale en proximale randen van de kern aan, terwijl A en B de maximale en achtergrondgrijze waarden zijn van het blauwe kanaal (Hoechstkleurstof) van de afbeelding (figuur 6B). Er is rekening gehouden met de randbreedte (_e0 = 0,25 mm). Terwijl de ingesprongen, proximale kernrand (_x2) het traject volgde dat werd toegepast door de optische valroutine na het contact tussen microsfeer en kern, vertoont de tegenovergestelde, distale rand (_x1) ontspanningsdynamiek zoals verwacht voor een visco-elastisch materiaal zoals het cytoplasma (figuur 6D). Kernen in cellen die zijn opgesloten in microkamers van 10 μm vertonen daarentegen niet zo'n translocatiegedrag van de kern bij inkeping in de cel (figuur 6B,D). Ook weergegeven in figuur 6D, blijven de achterranden van de kernen ongewijzigd door de kraal die van de proximale zijde duwt, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van sterkere krachten als gevolg van celcontractiliteit en wrijving die tegen de indrukkingskracht inwerken. Om de juiste vervormingsdiepte te krijgen, werd de verplaatsing x1 afgetrokken van de ingesprongen maat x2: Δx = x2 - _x1 (zie ook figuur 6D).

Force data analyse
De kracht die nucleaire vervorming veroorzaakt, werd gemeten aan de hand van de verandering in lichtmoment dat ontstond bij de optisch gevangen microbead (figuur 7A). De kracht bij het toepassen van trapeziumvormige trajecten (stap 8.4.3, figuur 7B) nam aanvankelijk lineair toe totdat de val stopte met bewegen, maar ontspande vervolgens tot een steady state-waarde. Dit gedrag duidde op een visco-elastisch materiaal dat verlies- en opslagmodulus vertoonde. Direct na de inkepingsgebeurtenis bereikte de kracht een piekwaarde, Fp, gevolgd door een spanningsontspanning (figuur 7C):

(Vergelijking 2)

waarbij F0 de opgeslagen kracht is voor de elastische component en f(t) een dimensieloze relaxatiefunctie. We hebben dit gedrag op drie manieren geanalyseerd:

1. Uitgaande van een standaard lineaire vaste stof met een exponentiële spanningsrelaxatie, d.w.z. f(t) = ^e-t/τ, schematisch weergegeven in figuur 7C inzet.

2. Met behulp van een algemeen, dubbel exponentieel verval:
F(t) = A + B1e-t^/τ1 + ^B2e-t/τ2.

3. Het gebruik van een machtswet gevolgd door een exponentieel ^verval59:
f(t) = ^t-pe-t/τ, gemonteerd in figuur 7C.

Hoewel de pasvorm voor model 1 eenvoudig kan worden uitgevoerd, raden we aan om de eerste gissingen voor (τ1, τ2) en (p, τ) voor respectievelijk model 2 en 3 te schatten. Dit kan respectievelijk worden uitgevoerd door lijnen op de gegevens aan te brengen in logaritmisch-versus-lineaire (figuur 7D, links) en logaritmische-versus-logaritmische (figuur 7D, rechts) schalen. Tabel S3 geeft een overzicht van de resultaten voor het in figuur 7 geanalyseerde voorbeeld. In de volgende sectie zullen we de combinatie van een machtswet en een exponentiële wet voor de karakterisering van de celkernmechanica beschouwen.

Krachtverplaatsingsrelatie
Evenzo kan de beschreven experimentele opstelling worden gebruikt om de kracht-verplaatsingsrelatie van meerdere indrukkingsgebeurtenissen te verkrijgen. Door driehoekige routines uit te voeren (stap 8.4.4, figuur 8A), is het mogelijk om de kracht te relateren aan de vervorming en een kracht-inspringingscurve uit te zetten. Een voorbeeldige uitkomst is weergegeven in figuur 8B, waarbij een vlakke basislijn soepel van helling veranderde zodra de kraal in contact kwam met de kern. Het identificeren van het echte contactpunt in de luidruchtige gegevens is een uitdaging en er moet voor worden gezorgd dat het contactgebied geschikt is voor elastische ^modellen60. In dit specifieke experiment kon ook worden gezien dat de daaropvolgende inkepingen resulteren in curven met diepere contactpunten, indicatief voor een te langzaam herstel van de nucleaire vorm na het intrekken van de kralen en een verandering in de hysteretische cyclus gedefinieerd door de nucleus visco-elastische materiaaleigenschappen (figuur 8C). De onderzoeker moet dus op de hoogte zijn als dit gebeurt en dit opnemen in de analytische pijplijn, of het aantal volgende metingen zodanig beperken dat dit effect de meting niet wijzigt.

Kernmechanica in cellen in suspensie en opsluiting van minder dan 10 μm
De bovengenoemde benadering werd gebruikt om de dynamiek van nucleus stress ontspanning in hangende cellen op kleefsubstraten en opgesloten cellen te analyseren. Onze resultaten laten zien dat de opsluiting resulteert in een uitbreiding van het geprojecteerde gebied (figuur 9A), maar een onbeduidende verandering in nucleaire stijfheid (figuur 9B). We maten een vergelijkbare relaxatie met τ = 6,08 ± 1,1 s (niet-gedefinieerd) en τ = 4,00 ± 0,6 s (confinement), wat wijst op snelle visco-elastische dissipatie, gevolgd door een opgeslagen krachtwaarde die overeenkomt met de elastische modulus van de kern. Om rekening te houden met experimentele variaties, die kunnen worden geproduceerd door verschillende beginomstandigheden in de indrukkingsroutines, werden de gemeten opgeslagen krachten genormaliseerd tot de indrukkingsdiepte, zoals . Deze parameter houdt rekening met de kernstijfheid en beschrijft de kracht, of de spanning, die nodig is voor een bepaalde inkeping. We verkregen vergelijkbare stijfheid onder opsluiting en in niet-gedefinieerde cellen: = respectievelijk 20,1 ± 12,6 pN/μm en = 24,6 ± 13,6 pN/μm (gemiddelde ± standaardafwijking).

Figuur 1: Micro-injectie van zebravisembryo's in eencellig (zygote) stadium. (A) Injectieplaat: voor de injectie wordt een driehoekige injectieplaat gebruikt. De plaat is gemaakt van 1% ultrapure agarose in E3 (Egg's medium). Bovenaan- en zijaanzichten worden aan de rechterkant weergegeven. B) Embryopositionering: richt de embryo's voorzichtig met een borstel en oriënteer ze zodanig dat de eencellige duidelijk zichtbaar en gemakkelijk toegankelijk is met de naald. We stellen voor om de embryo's te oriënteren met de cel aan de andere kant van de naald, zoals te zien is in de schets. C) Injectieprocedure in het embryo van het eencellige stadium: doorprik het chorion rond het embryo en de eencellige cel met de naald. Zorg ervoor dat de punt van de naald zich in de cel bevindt en laat de druk los om te injecteren. D) Incubeer de embryo's bij 28-31 °C totdat zij zich ontwikkelen tot aan het blastulastadium (bolstadium) (4 hpf). Voer het celisolatieprotocol en de celkleuring uit (stap 2) en bereid de optische vangkamer voor met geïsoleerde cellen in suspensie en/of opsluiting in combinatie met de overeenkomstige substraatoppervlakcoating (stap 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbereiding van het optische pincet. (A) Spin-coatinglagen van PDMS met een bepaalde hoogte op glazen bodemschalen. De PDMS-druppel zal zich gelijkmatig verspreiden door de middelpuntvliedende kracht. (B) Voorbereiding van de monsterkamer uit de PDMS-laag. 1: snijd een vierkant met een scalpel, 2: bedek de binnenput met concanavaline A (ConA), was en zaadcellen; 3: dek af met een glazen schuif of afdekslip om de put af te dichten. (C) Afbeelding van het vierkant snijden met een scalpel en het verwijderen van de PDMS-put met een tang. (D) Montage van de opvanglens van de optische krachtsensor over de vangkamer. Een druppel dompelolie dient als onderdompelingsmedium tussen de opvanglens en de bovenste glazen afdekking. Schematisch niet op schaal. Wees voorzichtig bij het verlagen van de opvanglens om de glazen afdekking van de monsterschaal niet aan te raken. (E) Afbeelding van de krachtdetectie-eenheid die in contact komt met het monster. (F) Schematiek van de experimentele opzet. De optische micromanipulatiemodule maakt gebruik van een continue golflaserstraal (5W, λ = 1064 nm) met vermogensregeling via een halvegolfplaat (HWP) en een polariserende bundelsplitser (BS). Na te zijn gemoduleerd met een paar AOD's, is het gekoppeld aan de bovenste epifluorescentiepoort van een omgekeerde microscoop. De laserstraal wordt vervolgens gereflecteerd door een 950 nm kortdoorlaat dichroïsche spiegel (IR-DM), waardoor fluorescentie-excitatie en -emissie kunnen worden doorgegeven. De vanglaser wordt naar de achterste, epifluorescentiepoort van de microscoop geleid (bovenste torentje). De OT's worden gemaakt op het brandpuntsvlak van een water-immersie objectief (60x, NA = 1,2). De optische krachtsensor wordt onderworpen door de microscoopkoepel en vangt het laserlicht op dat uit de OT's komt met een hoge NA, olie-onderdompelingslens. Tegelijkertijd maakt de krachtsensor heldere veldverlichting mogelijk. De confocale eenheid van de draaiende schijf is gekoppeld aan de linkerpoort. Het is uitgerust met twee geïntegreerde lasermotoren (ILE) die zeven fluorescentie-excitatielasers en twee verlichte sCMOS-camera's aansturen, waardoor dubbele fluorofoorbeeldvorming parallel mogelijk is Abb: TI, Transilluminator; FS, veldstop; AOD, acustooptische deflector; HWP, halve golfplaat; CAM, camera (G) Foto van de optische vangapparatuur. Rode cirkel geeft de Bertrand-lens aan, die handmatig in het optische pad kan worden geschakeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De juiste monsters en parameters kiezen. (A) Representatief beeld van een geïsoleerde zebravisvoorloperstamcel met een enkele microsfeer die dicht genoeg bij de kern is geplaatst om het inkepingsexperiment uit te voeren. Schaalbalk = 10 μm. (B) Voorbeeldig valtraject; inkepingsdiepte 5 μm; inkepingssnelheid = 5 μm/s; ontspanningstijd 10 s. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Microbead lokalisatie in zebravisembryo's tijdens de ontwikkeling. 0,5 nL van 1 μm rode fluorescerende kralen worden geïnjecteerd samen met GPI-GFP mRNA (100 pg / embryo, plasmamembraan) in WT-embryo's om kraallokalisaties te visualiseren. (A-D) Verdeling van de microsfeer 5 uur na injectie in een embryo gemonteerd in 0,75% agarose. (A) Brightfield en fluorescentiebeeld. De kralen zijn homogeen verspreid over het embryoweefsel zoals te zien is in een confocale micrograaf. (B) Maximale projectie van confocale fluorescentie z-stack. De kralen hebben een kleurcode van paars tot geel volgens hun z-positie in de beeldstapel. Paars/magenta komt overeen met de meest buitenste kralen/cellen (EVL; epitheliale omhullende laag; of voorloperstamcellen die zich dicht bij het EVL-oppervlak bevinden), geel komt overeen met binnenste kralen (voorloper diepe cellen), zoals weergegeven in de schets aan de rechterkant. (C) Knip en maximale projectie van een substapel van (B) die overeenkomt met het gebied in de oranje doos: een groot deel van de diepe cellen bevat 1-2 kralen. (D) Knip en maximale projectie van een substapel van (B) die overeenkomt met magenta box: sommige EVL-cellen bevatten 1-2 kralen. (E) Brightfield-beeld en maximale projectie van een z-stack van een 24 hpf-embryo gemonteerd in 0,75% agarose en verdoofd met tricaïne. Embryo's werden gedurende 15 minuten geprecubeerd met tricaïne. Van links naar rechts: microsferen (1 μm diameter), GPI-GFP en beeldoverlapping. De kralen verdeelden zich over het hele lichaam van het embryo. Schaalbalkdimensie aangegeven in elk deelvenster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Geïsoleerde zebravis voorloper stamcellen met verschillende etikettering. (A) Transmissielichtmicroscopiebeeld van suspensiecellen met 1 (boven) of 2 (onder) geïnjecteerde kralen. Cyaan pijlen wijzen naar kralen. (B) Fluorescerende confocale beelden van suspensiecellen met verschillende kleuringen. Linksboven: Lap2b-eGFP (binnenste kernmembraan, 80 pg/embryo) en H2A-mCherry. Rechtsboven: GPI-GFP (plasmamembraan, 100 pg/embryo) en DNA-Hoechst (gekleurd zoals beschreven in rubriek 2). Linksonder: MyI12.1-eGFP (transgene lijn) en DNA-Hoechst. Rechtsonder: Calbryte488 en DNA-Hoechst (gekleurd zoals beschreven in rubriek 2). (C) Transmissielichtmicroscopiebeeld van opgesloten cellen met 1 (boven) of 2 (onder) geïnjecteerde kralen. Cyaan pijlen wijzen naar kralen. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Schatting van de kernvervorming door draaiende schijffilms. (A,B) Time-lapse van een inkepingsexperiment van de kern in (A) een zwevende cel en (B) een opgesloten cel. Schaalbalk 10 μm. Representatieve snapshots van een Hoechst-gelabelde kern worden 5 s voor, tijdens en 5 s na inspringing getoond met een optisch gevangen microsfeer (witte pijlpunt). Kymografen langs het inspringingssegment (rode lijn, rechterpaneel). _x1 en _x2 zijn de distale en proximale (dicht bij de kraal) grenzen van de kern tijdens het inspringingsexperiment geëxtraheerd uit de pasvorm van het intensiteitsprofiel met vergelijking 1. (C) Intensiteitsprofielen langs het inspringingssegment voor drie verschillende frames (voor, tijdens en na inspringing) en aangepast aan vergelijking 1 om de distale, _x1 en proximale, _x2, posities van de kernranden te beoordelen. (D) Representatieve trajecten van _x1(t) in blauw en _x2(t) in oranje tijdens een inspringingsexperiment van gesuspendeerde en opgesloten cellen (10 μm). Gearceerde gebieden geven de inkeping aan, de afstand tussen _x1 en _x2 geeft de kerndiameter aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Krachtsignaalverwerking. (A) Schematiek van een optisch gevangen microsfeer die de celkern vervormt bij inspringing. Kernmembraan en optische krachten worden aangegeven door de zwarte pijlen. De verandering in bundelmoment wordt aangegeven door de groene pijl _Pout. (B) Valtraject (boven) en kracht (onder) ervaren door de optisch gevangen microsfeer tijdens een herhaald nucleair inkepingsexperiment. (C) Krachtontspanningsverval na de krachtpiek op de maximale inkepingsdiepte. Inset toont een schema van standaard lineaire vaste stof waarvan de dynamica de fenomenologische waarnemingen hier benadert. (D) Links: logaritme van de genormaliseerde kracht versus tijd. De beschaduwde gebieden geven het gegevensgedeelte aan dat wordt gebruikt om het dubbele exponentiële verval (rode lijnen) te passen. Rechts: logaritme van de genormaliseerde kracht versus de logaritme van de tijd. Het schaduwgebied geeft het gegevensgedeelte aan dat wordt gebruikt om in de machtswet te passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Krachtinspringingsroutine met driehoekige valverplaatsingen. (A) Representatief traject van _x1(t) in blauw en _x2(t) in barnsteen tijdens een driehoekig inspringingsexperiment genomen op een cel met een opsluitingshoogte van 10 μm. Boven: Trap positie. Midden: Kernvormanalyse. De afstand tussen _x1 en _x2 geeft de kerndiameter aan. Onder: Forceersignaal. (B) Kracht versus overvulpositie gedurende acht opeenvolgende inspringingen. (C) Evolutie van de dissipatie, afgeleid van de hysterese tussen het naderings- en onttrekkingsgedeelte van de f-d-curve, van de kern voor elke volgende inspringingsgebeurtenis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9. Nucleaire eigenschappen van cellen in suspensie (kleefoppervlak) en opsluiting van trapeziumvormige routines. (A) Geprojecteerd gebied van de kern van cellen in suspensie en onder 10 μm opsluiting. Zwarte balk vertegenwoordigt de mediaan. (B) Nucleaire stijfheid van cellen in suspensie en onder opsluiting. Zwarte balk vertegenwoordigt de mediaan. P-waarden afgeleid van Kruskal-Wallis test met behulp van MatLab. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Trapeziumvormig traject gedefinieerd door de optische pincetsoftware. De eerste (tweede) rij is de x (y) afstand dat de val lineair wordt verplaatst. Op de derde rij wordt de duur van een bepaalde stap ingesteld in seconden. Dit traject bestaat uit zeven punten en komt overeen met het trapezium dat twee keer tegen de kern wordt geladen in figuur 7B. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Driehoekig traject gedefinieerd door de optische pincetsoftware. Analoog aan tabel 2 bestaat dit traject uit 16 punten, overeenkomend met acht inspringingsgebeurtenissen op een diepte van 5 μm en een snelheid van 2,5 μm/s. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Aanpassingsparameters voor de gegevens in figuur 7. IG: eerste gok. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Uitlijning van optische krachtsensor en basislijncompensatie van het momentum. (A) Veldstop afgebeeld bij de hulpcamera (AUX, figuur 2) door de Bertrand-lens. In de dompelolie verschijnt een luchtbel zichtbaar, die niet zichtbaar is door het oculair. (B) Schoon optisch pad. Voor een nauwkeurige uitlijning opent u de veldstop en laat u deze samenvallen met de NA = 1,2 lichtkegel. (C) Afbeelding van het monstervlak. Het rode vierkantje geeft het OT-werkgebied aan. Schaalbalk: 20 μm. (D) Trapvermogen gemeten over de FOV, langs witte dubbele pijlen aangegeven in C. In rood, trap power variatie wanneer er geen correctie wordt toegepast. In blauw, valkracht gecorrigeerd over het hele gezichtsveld. (E) X-component van de momentumbasislijn langs hetzelfde bereik. In rood, niet-gecorrigeerd spoor. In blauw, traceer gecorrigeerd voor valvermogen. In het groen, traceer gecorrigeerd voor momentumbasislijn met behulp van Global Offset Compensation in de software van de fabrikant. (F) Hetzelfde als in E, voor de Y-component. Merk op dat bij normaal gebruik de gearceerde componenten worden gebruikt voor mechanica en krachtmetingen, bijvoorbeeld x-krachtcomponent tijdens beweging langs de x-coördinaat en de y-krachtcomponent tijdens beweging langs de y-as. Nadat alle correcties zijn doorgevoerd, wordt een RMSD-ruis van <0,5 pN verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Een mislukte routine als gevolg van zwakke vallen. (A) Kymograaf die een nucleus-inkeping van een mislukte routine laat zien. Alleen korte, voorbijgaande vervormingen zijn zichtbaar als gevolg van een ontsnapping van de kraal uit de val. Belangrijk is dat de vanglaser nog steeds zonder kraal beweegt om het vooraf gedefinieerde traject (groene stippellijn) te voltooien. Schaalbalk = 10 μm. (B) Boven: Overvulpositie versus tijd. Midden: Edge tracking resultaat van de ingesprongen proximale en distale nucleus rand. Merk op dat de distale rand niet beweegt zonder de inkeping zoals vaak wordt waargenomen bij voltooide routines op geïsoleerde cellen op kleefsubstraten. Onder: Kracht versus tijd die het verlies van de microsfeer laat zien, aangegeven door een vermindering van thermische ruis en een plotselinge daling tot nulkracht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Overleving van geïnjecteerde embryo's. Embryo's geïnjecteerd met 1 μm kralen en 100 pg /embryo van mRNA in concentraties beschreven in het protocol werden vergeleken met niet-geïnjecteerde embryo's en vertonen geen significante verschillen 24 uur na de bevruchting. Gemiddelde en standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten met N > 21 embryo's per aandoening voor elk experiment. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In dit protocol beschrijven we een unieke methode om de mechanische eigenschappen van de celkern in de levende cellen te ondervragen. Anders dan andere krachtspectroscopietechnieken, stelde niet-invasieve optische trapping ons in staat om de bijdrage van het celmembraan en cytoskelet los te koppelen van de celkernstijfheid. Belangrijk is dat optische micromanipulatie compatibel is met multimodale microscopie, waardoor de experimentator verschillende processen kan bestuderen die betrokken zijn bij de celkernmechanobiologie. Als representatief resultaat gebruikten we DNA-Hoechst-kleuring om de kernvervorming bij inkeping te meten, uitgevoerd door krachten in de orde van enkele honderden picoNewton.

Mogelijke toepassingen van onze methode die verder gaan dan de voorbeelden die in dit protocol worden beschreven
De mogelijkheid om kwantitatieve mechanische informatie te extraheren uit metingen in levende cellen zonder externe verstoringen maakt een overvloed aan ongekende mogelijkheden mogelijk die net beginnen te worden verkend. Zo kan het gepresenteerde protocol van ons optische micromanipulatieplatform worden uitgebreid naar complexere experimenten met een grote veelzijdigheid. Acousto-optische deflectoren (AOD) kunnen meerdere optische vallen genereren voor synchrone krachtmetingen op verschillende cellocaties, en kunnen worden gebruikt voor actieve microrheologie in een breed ^{frequentiebereik51,61}. Zoals gezegd kan de krachtrespons bij inspringing de maximale vangkracht overwinnen, wat leidt tot een ontsnapping van de kraal uit de optische val. In dit geval kan een force feedback worden geconfigureerd met de AOD om de optische kracht te klemmen. Al met al kunnen meerdere microrheologische benaderingen, zoals de stressontspanning beschreven in dit protocol, maar ook actieve microrheologie of kruipcompliance, experimenteel worden verkregen met dit platform en grondig worden geanalyseerd door nieuwe softwarepakketten61,62,63,64,65 . Bovendien is de toepassing van krachten niet beperkt tot de kern, maar zou deze in principe kunnen worden uitgevoerd om diverse intracellulaire structuren en in complexe weefsels te meten, zoals aangetoond voor het vangen van stromende rode bloedcellen in intacte ^{bloedvaten66,67} of het vangen en vervormen van chloroplasten en mitochondriën68 . De kalibratie van het lichtmoment is onafhankelijk van de vorm en grootte van het ingesloten object, waardoor directe krachtmetingen mogelijk zijn op elke krachtsonde met willekeurige ^vorm38,39. Het gebruik van geïnjecteerde microsferen stelde ons in staat om hoge krachten op de kern uit te oefenen met een relatief laag laservermogen in vergelijking met directe manipulatie van cellulaire structuren69,70,71. Bij een voldoende hoog brekingsindexverschil is echter geen extern toegepaste krachtsonde nodig en kunnen intracellulaire organellen direct worden gemanipuleerd zonder geïnjecteerde kralen (ongepubliceerde waarnemingen en ^referentie70).

Mogelijke aanpassingen van onze methode om de toepassingen uit te breiden
Verschillende groottes van microbeads kunnen worden geïnjecteerd, afhankelijk van het experiment, maar de relatieve controles moeten worden uitgevoerd. Om cellen in latere stadia te bestuderen, kunnen bijvoorbeeld kleinere kralen worden geïnjecteerd. Dit vermindert de maximale kracht die kan worden uitgeoefend door de optische val (zoals weergegeven in ^referentie55). Grotere kralen kunnen worden geïnjecteerd om hogere krachten uit te oefenen, maar deze kunnen de ontwikkeling van het embryo beïnvloeden, afhankelijk van hun grootte of interessegebied. In experimenten waar microbead-injectie geen optie is, kunnen verschillende organellen die refractieve indices vertonen verschillen ten opzichte van die van het cytoplasma nog steeds optisch worden gemanipuleerd, wat aanleiding geeft tot optische krachten die meetbaar zijn uit lichtmomentveranderingen42. Zoals hierboven vermeld, zijn deze methoden gebruikt door Bambardekar et al. om cel-cel juncties in het Drosophila-embryo ^{te vervormen70}. Evenzo heeft de celkern een lagere brekingsindex dan het omringende ^medium44, wat parelvrije inkeping mogelijk maakt (ongepubliceerde waarnemingen en ^referentie72), hoewel met een lagere vangsterkte. De kern kan dus niet gemakkelijk worden gevangen en ontsnapt aan de val.

De spin-gecoate PDMS-afstandhouder wordt vervaardigd via een handige en snelle methode, maar is mogelijk buiten bereik voor laboratoria zonder toegang tot een micro- / nanofabricagefaciliteit of technische laboratoria. Zo kan de afstandhouder eenvoudig worden gemonteerd uit laboratoriumtape of parafilm (stap 4). Het protocol kan ook worden aangepast door microfluïdische kanalen te produceren die de levering van afzonderlijke cellen in vooraf gedefinieerde meetputten of in een kamer met een gedefinieerde hoogte automatiseren om het opsluitingseffect binnen hetzelfde monster te schatten. Dergelijke microfluïdische apparaten moeten echter zo zijn ontworpen dat zij passen in de ruimte tussen het microscoopobjectief en de opvanglens van de optische krachtsensor van ongeveer 2 mm (zie stap 3). Merk op dat de optische krachtsensor op de juiste hoogte moet worden geplaatst, zodat geen optische aberraties door onscherpte de meting van het fotonmoment beïnvloeden.

Andere wijzigingen kunnen de verandering van biologische verslaggevers zijn. We ontdekten dat Hoechst fluorescentie spectraal in het GFP-kanaal bloedt en we geven dus de voorkeur aan de combinatie met mCherry-gelabelde histon als een nucleaire marker voor gelijktijdige meting in twee fluorescerende kanalen. Als alternatief kan nucleaire vervorming eenvoudig worden gevolgd met een label gericht op het binnenste kernmembraan, zoals Lap2b-GFP (figuur 2).

De inkeping op de celkern was in de orde van grootte van 2-3 micron, die we nauwkeurig konden meten door beeldanalyse van diffractie-beperkte draaiende schijf confocale microscopie. Voor het geval van stijvere kernen of kleinere krachten zal de inkeping met deze benadering nauwelijks meetbaar zijn. Het absolute krachtgekalibreerde optische pincet kan echter ook worden gekalibreerd voor positiemetingen van de gevangen kraal in situ met behulp van BFP-interferometrie met nanometernauwkeurigheid51. Met behulp van deze benadering kunnen het spanningssignaal en de optische krachtsensor worden vertaald in de positie van de gevangen sonde door middel van parameter β [nm / V], terwijl de invariante parameter α [pN / V] krachtwaarden oplevert door de bovengenoemde lichtmomentkalibratie41 (zie hieronder voor details).

Probleemoplossing
We ontdekten dat de volgende uitdagingen zich tijdens het experiment konden voordoen:

Er wordt geen stabiele val gevormd en de microsfeer ontsnapt gemakkelijk
Vuil op het microscoopobjectief of een verkeerd uitgelijnde correctiekraag kan leiden tot het falen van een stabiele val. Als er geen onmiddellijke oplossing wordt gevonden, meet dan de puntspreidingsfunctie van de objectieflens. Als het monster van belang zich diep in een optisch dicht weefsel bevindt, kan de laserfocus ernstige optische aberraties ervaren die leiden tot onstabiele beknelling (dit effect is meestal verwaarloosbaar in geïsoleerde cellen, maar wordt duidelijker in dikkere weefsels). Bij hoge stijfheid kan de herstellende kracht van de kern de ontsnappingskracht van de val overschrijden, zodat de microsfeer verloren gaat en de inkepingsroutine faalt. Aanvankelijk wordt de kernmembraanrand proximaal aan de optische val nauwelijks ingesprongen (figuur S2A). Wanneer dit gebeurt, wordt de vanglaser niet langer beïnvloed door kracht en Brownse beweging, wat leidt tot een krachtdaling tot nul en een afname van de signaalruis (figuur S2B). In het geval dat dit gebeurt, kan het laservermogen worden verhoogd om een sterkere val te hebben, kan de amplitude van het trapeziumvormige traject dat de kraal in de kern duwt worden verminderd, of kan de beginpositie van de gevangen microbead verder van de kern worden ingesteld.

De cel beweegt tijdens de stimulatie
Als cellen niet voldoende zijn bevestigd, zal de optische gradiëntval de cellen verplaatsen tijdens het uitvoeren van de intracellulaire inkepingsroutine, zodat de krachten en onderliggende mechanica van de kern artefactueel zijn. Om verplaatsing van de hele cel te voorkomen, raden we aan om de concentratie van celadhesiemoleculen op het oppervlak te verhogen, bijvoorbeeld ConA.

Initiële momentumcompensatie
Als er geen initiële momentumcompensatieroutine beschikbaar is in het OT-platform (stap 6.5), moet een kunstmatig, krachtonafhankelijk basislijnsignaal worden gecorrigeerd. Dit is zichtbaar als een helling op de krachtcurve, zelfs zonder kraal gevangen (figuur S1E). Om de correctie uit te voeren, moet hetzelfde traject worden uitgevoerd zonder een kraal, buiten de cel op precies dezelfde positie. Verplaats hiervoor de cel uit de buurt van de val met behulp van de fasebesturing. Ter referentie, de kracht offset verandert 5 pN over de FOV bij 200 mW in ons systeem; zo wordt het verwaarloosbaar voor korte trajecten. Als alternatief kan een piëzo-scanfase worden gebruikt om de cellen op het monster te verplaatsen, waardoor de laserpositie constant blijft.

Kritieke stappen van het gepresenteerde protocol
Microsferen moeten worden geïnjecteerd in het juiste, 1-celstadium om een maximale verdeling over het embryo te garanderen. Kralen mogen niet fluorescerend zijn, zodat er geen licht lekt in de fluorescerende kanalen die worden gebruikt voor beeldvorming. Zelfs typische rood-fluorescerende kralen zijn bijvoorbeeld duidelijk zichtbaar in het blauwe kanaal dat wordt gebruikt voor het afbeelden van de celkern na Hoechst-kleuring vanwege hun helderheid (excitatie: 405 nm; emissie: 445 nm). Stabiele bevestiging van de cel aan het substraat is van cruciaal belang om laterale verplaatsing tijdens de inkepingsroutine te voorkomen. Als de cel tijdens de routine beweegt, worden de krachten onderschat. Mocht dit vaak gebeuren, optimaliseer dan het bevestigingsprotocol. Voor weefselkweekcellen leiden andere celadhesie-eiwitten, zoals fibronectine, collageen of poly-L-lysine tot bevredigende hechting (ongepubliceerde waarnemingen). Tijdens de opsluiting worden cellen blootgesteld aan een plotselinge en ernstige mechanische belasting. Dit kan schade aan de cellen veroorzaken en vaak zal de experimentator gebarsten cellen tegenkomen als de procedure niet zorgvuldig wordt uitgevoerd. Ook als de opsluitingshoogte te klein is, zullen alle cellen last hebben van nucleaire envelopbreuk of onomkeerbare schade. Om deze te verminderen, verlaagt u de bovenste coverslip langzamer en/of vergroot u de afstand tussen de coverslip.

Beperkingen van de techniek en suggesties om ze te overwinnen
Een duidelijke beperking van de techniek is de penetratie van het laserlicht in diepe delen van het weefsel, wat leidt tot aberraties en onstabiele vallen. Een ondergrens van de penetratiediepte hangt dus af van de helderheid van het monster, de aberratiecorrectie die kan worden ^toegepast73 en het toegepaste laservermogen. Er moet rekening mee worden gehouden dat een hoger laservermogen leidt tot thermische excitatie van het monster in de buurt van de microsfeer. De verwarming van het monster afkomstig van de 1064 nm golflengtelaserspot wordt echter geminimaliseerd om plausibele hittegerelateerde stress op onze biologische monsters te ^voorkomen74.

Een andere beperking is de maximale kracht die gemeten kan worden. Hoewel directe lichtmomentdetectie krachtmetingen mogelijk maakt die veel verder gaan dan het lineaire responsregime van de optische ^val40,41, ligt de maximaal uitgeoefende kracht in de orde van grootte van enkele honderden picoNewtons. Dit wordt beperkt door laservermogen en de gevolgschadedrempel van zacht biologisch materiaal en de brekingsindexverschillen, die normaal gesproken niet groter zijn dan 0,1 of ^0,344. Er zijn verschillende methoden voorgesteld om de krachtdetectielimiet te verhogen, bijvoorbeeld met behulp van gestructureerd ^licht75, antireflectiecoating ^{microsferen76}, deeltjes met een hoge brekingsindex77 of sterk gedopeerde quantum ^dots78.

OT's kunnen worden gebruikt voor positiemetingen op nanometerschaal door middel van BFP-interferometrie, zodat de positie van de kraal in de val Δx = β _Sx is, waarbij _Sx het spanningssignaal van de sensor is en β [μm / V] on-the-fly kan worden gekalibreerd volgens verschillende ^{protocollen35,54}. Voor een optische krachtsensor kan worden aangetoond dat de spanning-naar-kracht invariante conversiefactor α [pN/V] rechtstreeks verband houdt met β en de valstijfheid, k [pN/μm], door middel van α = kβ ³⁷) In experimenten met parelverplaatsingen die te klein zijn om te worden gedetecteerd uit optische beeldvorming, kan deze strategie worden gebruikt om krachtmetingen aan te vullen met detectie van kleine posities. Een voorbeeld is de toepassing van de hier gepresenteerde experimentele routines op zeer stijve kernen, waarvoor krachten met redelijke laservermogens (200-500 mW) niet voldoende zijn om inkepingswaarden te induceren die groot genoeg zijn. In dat geval moet de kraal in contact worden gebracht met de kern en moet de vangstijfheid voorafgaand aan de meting worden gekalibreerd (stap 8.6). De inkeping d van de kern als functie van de kracht kan indirect worden bepaald als:

d = _xtrap - F/k

waarbij xtrap de trappositie is. Anders dan de invariante lichtmomentfactor α [pN/V], moet factor β [μm/V] voorafgaand aan elk experiment worden gekalibreerd, omdat deze afhankelijk is van vele lokale variabelen die de vangdynamiek bepalen, zoals de deeltjesgrootte, optische vangpuntgrootte en relatieve brekingsindices.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 22 mm cover glasses	Ted Pella	260148
#1.5 22x60 mm Coverglasses	Ted Pella	260152
#1.5H glass bottom dishes	Willco	GWST-5040
10-um beads	Supelco	72986
1-mm glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0020 GC100F-15
1-um polystyrene microbeads	Sigma	89904
1-um red-fluorescent beads	ThermoFisher	F8816
Agar	ThermoFisher	16500500
Aqcuisition cameras sCMOS	Andor	Sona-4BV11-UNI
Auxiliary camera (Figure 3, AUX)	Blackfly, FLIR	BFS-U3-200S6M-C
Calbryte 520	AAT Bioquest	520 AM
Centrifuge	Eppendorf	5453000011
Concanavalin A	Sigma	C5275
DMEM	Sigma	D2906
DNA-Hoechst	ThermoFisher	33342
Double scotch tape	Biesse Adesivi
E3	5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4
Eclipse Ti2	Nikon
Forceps	Fine Science Tools	11252-20
GPI-GFP
H2A-mCh
Image acquisition software	Fusion-Andor
Immersion Oil	Cargille	Type B: 16484
IR protection googles	Thorlabs	LG1
Lap2b-eGFP
Micro loader pipette	Eppendorf	GELoader
Microinjector	World Precision Instruments	SYS-PV820
MicroManager 2.0
Micromiter slide	ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions
Mineral oil	Sigma	M3616
Motorized stage	ASI
Needle puller	Sutter instrument Co.	Model P-97
Optical tweezers platform	Impetux Optics	Sensocell
OTs software (LightAce)	Impetux Optics
PDMS	Sigma	Sylgard 184
PDMS Curing agent	Sigma	Sylgard 184
Post processing software (Matlab)	Mathworks
RNAse free water	Thermofisher	AM9937
Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)	Semrock	FF01-950/SP-25
Spin-coater	Specialty Coating Systems	Spincoat G3P-8
Spinning-disk confocal microscope	Andor	DragonFly 502
Stereomicroscope	Leica M80
Triangular microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU1
Universal oven	Memmert	UNB 200
Water immersion objective	Nikon	MRD07602