Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nucleoside Trifosfaat Hydrolasen Test in Toxoplasma gondii en Neospora caninum voor High-Throughput Screening met behulp van een robotarm

816 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62874

⸱

22 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Infecties met Toxoplasma gondii en Neospora caninum worden aangetroffen bij mens en dier en leiden tot ernstige gezondheidsproblemen. De twee parasieten delen vergelijkbare nucleosidetrifosfaathydrolasen en spelen een belangrijke rol bij de voortplanting en overleving. We hebben een hoogwaardige test opgesteld van de enzymen die het gebruik van een robotarm vereisen.

Samenvatting

Protozoaire parasieten infecteren mensen en veel warmbloedige dieren. Toxoplasma gondii, een belangrijke protozoaire parasiet, wordt vaak aangetroffen bij HIV-positieve patiënten, ontvangers van orgaantransplantaties en zwangere vrouwen, wat resulteert in de ernstige gezondheidstoestand Toxoplasmose. Een andere belangrijke protozoa, Neospora caninum, die veel overeenkomsten vertoont met Toxoplasma gondii, veroorzaakt ernstige ziekten bij dieren, net als encefalomyelitis en myositis-polyradiculitis bij honden en koeien, met doodgeboren kalveren tot gevolg. Al deze vertoonden vergelijkbare nucleosidetrifosfaathydrolasen (NTPase). Neospora caninum heeft een NcNTPase, terwijl Toxoplasma gondii een TgNTPase-I heeft. Aangenomen wordt dat de enzymen een cruciale rol spelen bij de voortplanting en overleving. Om verbindingen en/of extracten te ontwikkelen die protozoaire infectie voorkomen, hebben we ons op deze enzymen gericht voor de ontdekking van geneesmiddelen. De volgende stap was het opzetten van een nieuwe, zeer gevoelige en zeer nauwkeurige test door een conventionele biochemische enzymtest te combineren met een fluorescerende test om het ADP-gehalte te bepalen. We hebben ook gevalideerd dat de nieuwe test voldoet aan de criteria om high-throughput screening (HTS) uit te voeren in de twee protozoaire enzymen. We voerden HTS uit, identificeerden respectievelijk 19 verbindingen en zes extracten uit twee bibliotheken met synthetische verbindingen en een extractbibliotheek afgeleid van mariene bacteriën. In dit onderzoek is een gedetailleerde uitleg gegeven over het uitvoeren van HTS, inclusief informatie over de bereiding van reagentia, apparaten, robotarm, enz.

Inleiding

Robotica is gevestigd als geavanceerde en krachtige hulpmiddelen voor het bereiken van belangrijke doorbraken op verschillende gebieden buiten de industrie en fabricagetechniek, zoals biochemie, moleculaire biologie en klinisch onderzoek, en met name HTS 1,2,3. Toxoplasma gondii is een belangrijke parasiet en een eencellige parasitaire eukaryoot4 die ernstige gezondheidsproblemen veroorzaakt bij mensen5 en veel homeotherme dieren4, resulterend in infecties die leiden tot toxoplasmose, een bijzonder ernstige aandoening bij aidspatiënten6, ontvangers van orgaantransplantaties7 en zwangere vrouwen8. Neospora caninum behorend tot Phylum Apicomplexa9 infecteert voornamelijk honden en koeien6, wat resulteert in encefalomyelitis en myositis-polyradiculitis bij honden10,11 en abortus bij koeien12,13. Verder vertoont Neospora caninum morfologische en fylogenetische overeenkomsten met Toxoplasma gondii 9,14. Bovendien hebben ze een nucleosidetrifosfaathydrolase (NTPase; EC3.6.1.15)14. De enzymen zijn heel anders dan conventionele ecto-ATPase14. Deze parasieten genereren een aanzienlijke hoeveelheid NTPase-eiwitten, 2%-8% van het totale eiwit en spelen een belangrijke rol als slapende enzymen in hun tachyzoietstadium15. Opgemerkt moet worden dat deze in dichte secretoire korrels worden gecondenseerd16 en worden uitgescheiden in de parasitofore vacuole16. Als biochemisch enzymatisch kenmerk wordt NTPase geactiveerd door dithiothreitol17. Er wordt voorspeld dat de inductoren zoals de dithiolverbinding, een niet-geïdentificeerd enzym zoals dithiol-disulfide-oxidoreductase en een ander van dezelfde aard vertonen. Ze zijn nog niet geïdentificeerd bij parasieten. Het enzym speelt echter wel een belangrijke rol bij het vrijmaken van tachyzoiet uit geïnfecteerde gastheercellen17.

Toxoplasma gondii heeft twee NTPase-isovormen18: type I enzym TgNTPase-I en type II enzym TgNTPase-II18. De eerste gebruikt bij voorkeur trifosfaatnucleosiden als substraat18. Deze laatste hydrolyseert zowel trifosfaat- als difosfaatnucleosiden18. De homologie is 97% in aminozuurniveaus18. Neospora caninum heeft ook een ortholoog van TgNTPase-I genaamd NcNTPase19. De homologie is 73% in aminozuurniveaus19. Prof. Asai en Prof. Harada genereerden recombinanten van zowel de NTPase met behulp van E. coli. en veranderden de constitutief actieve mutanten hiervan zoals eerder gerapporteerd20. Ze waren zo vriendelijk de twee actieve mutanten te schenken. Beide enzymen kunnen ATP in vitro20 omzetten in ADP. Zeer recent hebben we de activiteit van NTPase gemeten met behulp van ADP-inhoud die door de enzymen is gehydrolyseerd. Ten slotte zijn we erin geslaagd de hoogwaardige test tot stand te brengen door het proces van het bepalen van het ADP-gehalte met een combinatie van fluorescentie en enzymatische reactie, zoals eerder gerapporteerd21,22. We hebben ook high-throughput screening (HTS)22 gedaan.

Deze studie introduceert gedetailleerde procedures voor een nieuwe test met hoge nauwkeurigheid en dynamisch bereik21 en een gedetailleerde uitleg over het bereiden van reagentia om de enzymactiviteit te meten en fluorescerende intensiteit te ontwikkelen met behulp van een robotarm voor HTS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Expressie en zuivering van recombinant TgNTPase-I en NcNTPase

  1. Bereid het expressieplasmide voor en introduceer het in de E. coli. stam BL21.
    OPMERKING: Gedetailleerde informatie over constructies en procedures is weergegeven in een eerder rapport14. In deze studie werden zowel TgNTPase-I als NcNTPase constitutief actieve mutanten vriendelijk geschonken door Prof. Asai en Prof. Harada.

2. Bereiding en plaatsing van biofluorescerende reactieoplossing op de plaat

  1. Bereid 2x biofluorescerende reactieoplossing zoals beschreven in tabel 1 voor 2 ml mastermix voor een test met 400 putjes in 384-wells.
  2. Bereid voorraadoplossingen met gedestilleerd water (DW) voor elke aangegeven concentratie, met uitzondering van resazurine en N-ethylmaleimide. Los de overige twee reagentia op met DMSO in de juiste concentratie. Bewaar de reagentia vervolgens bij -30 °C tot het moment om de experimenten uit te voeren.
  3. Voeg 15 μL 2x biofluorescerende reactieoplossing toe aan elk van de 368 putjes (formaat 384 putjes).
    OPMERKING: De eerste plaat dient als reservoir om voldoende van het reagens te hebben om twee keer experimenten uit te voeren.

3. Breng teststoffen of extracten aan op de bodem van elk putje in de analyseplaat

  1. Breng 0,5 μL van elke verbinding aan op de bodem van de plaat met behulp van een robotarm van de bibliotheekmoederplaat, inclusief teststoffen.
  2. Voeg 0,5 μL DMSO toe aan zowel de negatieve als de positieve controle.

4. Bereiding van het enzymreactiemengsel en het begin van de reactie

  1. Bereid de enzymreactieoplossing zoals aangegeven in tabel 2.
  2. Voeg NTPase (eindconcentratie is 0,0002 μg/ml) toe aan 50 ml van het enzymreactiemengsel, meng snel en breng over naar een plastic reservoir.
  3. Ga verder met het gelijktijdig injecteren van 4.5 μL in elk putje, behalve de negatieve controlelijn met behulp van de robotarm.
  4. Voeg dezelfde hoeveelheid van het enzymreactiemengsel met PBS toe in plaats van het enzym voorafgegaan door de gelijktijdige injectie.
  5. Plaats de plaat gedurende 10 minuten in een broedmachine bij 37 °C.

5. Voer real-time metingen uit van enzymatische activiteiten met behulp van een microplaatlezer

  1. Voeg na 10 minuten incubatie tegelijkertijd 5 μL 2x biofluorescerende reactieoplossing toe aan elk putje, onmiddellijk met behulp van de robotarm.
  2. Stop de robotarm tijdelijk om de oplossing in elke tip boven de plaats te houden waar de plaat moet worden geplaatst.
  3. Zodra de testplaat op zijn plaats zit, start u de robotarm opnieuw op.
    OPMERKING: Om verzadiging van de gegenereerde ADP te voorkomen, meet u onmiddellijk de fluorescerende intensiteit.
  4. Draai de plaat snel (200 x g gedurende 1 min) naar beneden en plaats de plaat in de plaatlezer.
  5. Begin gedurende 1 uur elke minuut met de real-time meting van fluorescentie bij 540 nm/590 nm (excitatie/emissie).

6. Analyse van de resultaten

  1. Bereken waarden als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van de aangegeven en gerepliceerde monsters in elke experimentele groep; Repliceer experimenten om consistentie te garanderen.
  2. Voer statistische significantie uit met behulp van een t-toets van de student.
  3. Bereken waarden als statistisch significant als de P-waarden P < 0,05 zijn.
  4. Bereken de signaal-achtergrondverhouding (S/B), de signaal-ruisverhouding (S/N) en de Z'-factor met behulp van de volgende formules:
    S/B = Gemiddelde ligand/Gemiddeld voertuig
    S/N = (Gemiddelde ligand - Gemiddeld voertuig)/Standaarddeviatie voertuig
    Z'-factor = 1 - (3 x Standaarddeviatie ligand + Standaarddeviatie medium)/(Gemiddelde ligand - Gemiddeld voertuig)
  5. Zorg ervoor dat de S/B-, S/N- en Z'-factor respectievelijk meer dan 3, 10 en 0,5 zijn.
    OPMERKING: Bevestig of elk experiment voldoet aan het algemene criterium dat voldoende is om HTS uit te voeren, zoals vermeld in eerdere rapporten23,24.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een principe van de test is samengevat in aanvullende figuur 1 en gebaseerd op een eerder rapport12,18. De test is ontworpen in een formaat met 384 putjes, zoals weergegeven in figuur 1. De extreemrechtse en linkse lijnen werden op de plaat vermeden. De twee lijnen naast de uiterst linkse en rechtse lijn werden vervolgens gebruikt als respectievelijk negatieve controle en positieve c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We zijn erin geslaagd een nieuwe test met een hoog dynamisch bereik en nauwkeurigheid op te zetten met een combinatie van een klassieke enzymtest en een fluorescerende test voor ADP, het eindproduct via ATPase, inclusief Tg en Nc ATPase22. Om HTS uit te voeren, is het belangrijk dat de test betere waarden van de factor S/B, S/N en Z' heeft dan een klassieke enzymtest15,22. Bovendien resulteert het weglaten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financieel belang bij deze studie.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Platform for Drug Discovery, Informatics and Structural Life Science, een Grant-in-Aid for Scientific Research (C) van Japan Society for Promotion of Science (JSPS-21K06566). De auteurs danken Asai (Keio University School of medicine) en Harada (Kyoto Institute of Technology) en Stephen Stratton oprecht voor het schenken van respectievelijk twee NTPase actieve mutanten en zijn bijdrage aan de voorbereiding van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 stage-workstation EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXRobot arm Pippeting system
384 well tipsBiotech Co., Ltd.Op maat gemaakt
ADP-hexokinaseAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOriental Yeast, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P dehydrogenaseOriental Yeast, Co, Ltd.306-50143
GlucoseWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOriental Yeast, Co, Ltd.44332000
N-ethylmaleimideWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSMultimode microplate reader
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirsS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02

Referenties

  1. Bianca, C. B., et al. A robotic platform to screen aqueous two-phase systems for overcoming inhibition in enzymatic reactions. Bioresource Technology. 280, 37-50 (2019).
  2. Aliaksei, V., Jan, D. B. Robot-scientists will lead tomorrow's biomaterials discovery. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 74-80 (2018).
  3. Mandeep, D., Kusum, P., Dharini, P., Nikolaos, E. L., Pratyoosh, S. Robotics for enzyme technology: innovations and technological perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105, 4089-4097 (2021).
  4. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , Elsevirer. Amsterdam, The Netherlands. (2008).
  6. Schäfer, G., et al. Immediate versus deferred antiretroviral therapy in HIV-infected patients presenting with acute AIDS-defining events (toxoplasmosis, Pneumocystis jirovecii-pneumonia): A prospective, randomized, open-label multicenter study (IDEAL-study). AIDS Research and Therapy. 16, 34(2019).
  7. Ramanan, P., et al. Toxoplasmosis in non-cardiac solid organ transplant recipients: A case series and review of literature. Transplant Infectious Disease. 26, 13218(2019).
  8. Rivera, E. M., et al. Toxoplasma gondii seropositivity associated to peri-urban living places in pregnant women in a rural area of Buenos Aires province, Argentina. Parasite Epidemiology and Control. 7, 00121(2019).
  9. Donahoe, S. L., Lindsay, S. A., Krockenberger, M., Phalen, D., Šlapeta, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife. International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife. 4, 216-238 (2015).
  10. Crookshanks, J. L., Taylor, S. M., Haines, D. M., Shelton, G. D. Treatment of canine pediatric Neospora caninum myositis following immunohistochemicalidentification of tachyzoites in muscle biopsies. TheCanadian Veterinary Journal. 48, 506-508 (2007).
  11. Bartner, L. R., et al. Testing for Bartonella ssp. DNA in cerebrospinal fluid of dogs with inflammatory central nervous system disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 32, 1983-1988 (2018).
  12. Changoluisa, D., Rivera-Olivero, I. A., Echeverria, G., Garcia-Bereguiain, M. A., de Waard, J. H. Working group "Applied Microbiology" of the School of Biological Sciences and Engineering at Yachay Tech University. Serology for Neosporosis, Q fever and Brucellosis to assess the cause of abortion in two dairy cattleherds in Ecuador. BMC Veterinary Research. 15, 194(2019).
  13. Serrano-Martínez, M. E., et al. Evaluation of abortions spontaneously induced by Neospora caninum and risk factors in dairy cattle from Lima, Peru. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria. 28, 215-220 (2019).
  14. Matoba, K., et al. Crystallization and preliminary X-ray structural analysis of nucleoside triphosphate hydrolases from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 66, 1445-1448 (2010).
  15. Nakaar, V., Beckers, C. J., Polotsky, V., Joiner, K. A. Basis for substrate specificity of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase. Molecular and Biochemical Parasitology. 97, 209-220 (1998).
  16. Pastor-Fernández, I., et al. The tandemly repeated NTPase (NTPDase) from Neospora caninum is a canonical dense granuleprotein whose RNA expression, protein secretion and phosphorylation coincides with the tachyzoite egress. Parasites and Vectors. 9, 352(2016).
  17. Silverman, J. A., et al. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. Journal of Biological Chemistry. 273, 12352-12359 (1998).
  18. Olias, P., Sibley, L. D. Functional analysis of the role of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolases I and II in acute mouse virulence and immune suppression. Infection and Immunity. 84, 1994-2001 (2016).
  19. Leineweber, M., et al. First Characterization of the Neospora caninum Dense Granule Protein GRA9. BioMed Research International. 2017, 6746437(2017).
  20. Krug, U., Zebisch, M., Krauss, M., Sträter, N. Structural insight into activation mechanism of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphatediphosphohydrolases by disulfide reduction. Journal of Biological Chemistry. 287, 3051-3066 (2012).
  21. Kumagai, K., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T. Development of a highly sensitive, high-throughput assay for glycosyltransferases using enzyme-coupled fluorescence detection. Analytical Biochemistry. , 146-155 (2014).
  22. Harada, M., et al. Establishment of novel high-standard chemiluminescent assay for NTPase in two protozoans and its high-throughput screening. Marine Drugs. 18, 161(2020).
  23. Kurata, R., et al. Establishment of novel reporter cells stably maintaining transcription factor-driven human secreted alkaline phosphatase expression. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, 224-231 (2018).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Toxoplasma gondiienzymassayfluorescentieassayADP-detectiegeneesmiddelenontwikkelingrobotarmautomatiseringprotozoaire parasieten

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.