Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Entomopathogene schimmels (EPF) zijn een van de microbiële bestrijders voor geïntegreerde plaagbestrijding. Om lokale of invasieve plagen te bestrijden, is het belangrijk om inheemse EPF te isoleren en te selecteren. Daarom werd de bodemaasmethode in combinatie met het insectenaas (meelworm, Tenebrio molitor) -systeem in deze studie met enkele aanpassingen gebruikt. De geïsoleerde EPF werd vervolgens onderworpen aan de virulentietest tegen de landbouwplaag Spodoptera litura. Bovendien werden de potentiële EPF-stammen onderworpen aan morfologische en moleculaire identificaties. Daarnaast werden de conidiaproductie en thermotolerantietest uitgevoerd voor de veelbelovende EPF-stammen en vergeleken; deze gegevens werden verder vervangen door de formule van effectief conidia-nummer (ECN) voor laboratoriumrangschikking. Het bodemaasmeelwormsysteem en de ECN-formule kunnen worden verbeterd door insectensoorten te vervangen en meer stressfactoren te integreren voor de evaluatie van commercialisering en veldtoepassing. Dit protocol biedt een snelle en efficiënte aanpak voor EPF-selectie en zal het onderzoek naar biologische bestrijders verbeteren.
Inleiding
Momenteel worden entomopathogene schimmels (EPF) veel gebruikt bij de microbiële bestrijding van landbouw-, bos- en tuinbouwplagen. De voordelen van EPF zijn het brede gastheerbereik, het goede aanpassingsvermogen van het milieu, de milieuvriendelijke aard en dat het kan worden gebruikt met andere chemicaliën om het synergetische effect voor geïntegreerde plaagbestrijding aan te tonen1,2. Voor de toepassing als ongediertebestrijder is het noodzakelijk om een groot aantal EPF te isoleren van zieke insecten of de natuurlijke omgeving.
De bemonstering van deze organismen van hun gasthe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het hele stroomdiagram is weergegeven in figuur 1.
1. Isolatie en selectie van potentiële entomopathogene schimmels (EPF)
- Verzamel het bodemmonster
- Verwijder 1 cm van de oppervlaktegrond en verzamel de grond vervolgens binnen de diepte van 5-10 cm met behulp van een schop van elke bemonsteringslocatie.
OPMERKING:Bemonsteringslocaties zouden een berg, bos of dunbevolkte gebieden zijn om de besmetting van kunstmatig besproeide EPF-stammen te voorkomen. Zorg ervoor dat gebieden voor het verzamelen van bodemmonsters op het oppervlak bedekt zijn met onkruid. Droge grond of vochtige gr....
- Verwijder 1 cm van de oppervlaktegrond en verzamel de grond vervolgens binnen de diepte van 5-10 cm met behulp van een schop van elke bemonsteringslocatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Isolatie en selectie van potentiële entomopathogene schimmels (EPF)
Door gebruik te maken van de Tenebrio molitor-gemedieerde Entomopathogene schimmels (EPF) bibliotheekconstructiemethode, zou het aantal schimmels zonder insectendodende activiteit worden uitgesloten; zo zou de isolatie-efficiëntie en selectie van EPF grotendeels kunnen worden verhoogd. Tijdens de toepassing van deze methode werd de informatie over bemonsteringslocaties, bodemmonsters en de ki.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Entomopathogene schimmels (EPF) zijn gebruikt voor insectenbestrijding. Er zijn verschillende methoden om EPF30,31,32 te isoleren, selecteren en identificeren. Bij het vergelijken van de verschillende soorten insectenaasmethoden werden Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae vaak aangetroffen in insectenaas6,12,13,14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling bij dit werk.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar Bacteriologische kwaliteit | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Geschikt voor de meeste celcultuur/moleculaire, biologie toepassingen. |
| AGAROSE, biotechnologie kwaliteit | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | Voor DNA elektroforese. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Koperen kurkboorders | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | Voor het vastleggen van de kolonie morfologie van stammen |
| Incubator met constante temperatuur | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Schimmelbewaring. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 digitaal gel beeldsysteem | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0,2 tot 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 tot 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 tot 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 tot 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 tot 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 tot 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR Systeem 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Afgemeten cilinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Meet het volume van reagentia. |
| Handtellingteller | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Bereken het aantal sporen |
| Inoculating lus | Dogger | D8GA-23000 | |
| deksel | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro dekglas | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscoop beeldsysteem | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscoopglaasjes | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Elektroforese | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optisch microscoop | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Kunststof beker | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Gist Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungale genomische DNA extractie kit |
| Sabouraud Dextrose Bouillon (Sabouraud vloeibaar medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Gebruikt voor de cultivatie van gisten, schimmels en zuurhoudende micro-organismen. |
| Scalpelmesje nr.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel handgreep nr.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Schop | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Oppervlakte-actieve stof |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Stalen pincet | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Steriele petrischaal | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Ondiepe cilindrische containers met passende deksels, specifiek voor microbiologie of celcultuur gebruik. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Vriezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C monster opgeslagen. |
| Verticale vloer type kast | Chih Chin | BSC-3 | Schimmelbewerkingscultivering. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Ritssluiting opbergzakken | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Vriezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C monster en experimentele reagentia opgeslagen. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Referenties
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Flor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
