Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Samenvatting

Entomopathogene schimmels (EPF) zijn een van de microbiële bestrijders voor geïntegreerde plaagbestrijding. Om lokale of invasieve plagen te bestrijden, is het belangrijk om inheemse EPF te isoleren en te selecteren. Daarom werd de bodemaasmethode in combinatie met het insectenaas (meelworm, Tenebrio molitor) -systeem in deze studie met enkele aanpassingen gebruikt. De geïsoleerde EPF werd vervolgens onderworpen aan de virulentietest tegen de landbouwplaag Spodoptera litura. Bovendien werden de potentiële EPF-stammen onderworpen aan morfologische en moleculaire identificaties. Daarnaast werden de conidiaproductie en thermotolerantietest uitgevoerd voor de veelbelovende EPF-stammen en vergeleken; deze gegevens werden verder vervangen door de formule van effectief conidia-nummer (ECN) voor laboratoriumrangschikking. Het bodemaasmeelwormsysteem en de ECN-formule kunnen worden verbeterd door insectensoorten te vervangen en meer stressfactoren te integreren voor de evaluatie van commercialisering en veldtoepassing. Dit protocol biedt een snelle en efficiënte aanpak voor EPF-selectie en zal het onderzoek naar biologische bestrijders verbeteren.

Inleiding

Momenteel worden entomopathogene schimmels (EPF) veel gebruikt bij de microbiële bestrijding van landbouw-, bos- en tuinbouwplagen. De voordelen van EPF zijn het brede gastheerbereik, het goede aanpassingsvermogen van het milieu, de milieuvriendelijke aard en dat het kan worden gebruikt met andere chemicaliën om het synergetische effect voor geïntegreerde plaagbestrijding ^{aan te tonen1,2}. Voor de toepassing als ongediertebestrijder is het noodzakelijk om een groot aantal EPF te isoleren van zieke insecten of de natuurlijke omgeving.

De bemonstering van deze organismen van hun gastheren helpt bij het begrijpen van de geografische verspreiding en prevalentie van EPF in natuurlijke gastheren3,4,5. De verzameling van met schimmel geïnfecteerde insecten wordt echter meestal beperkt door omgevingsfactoren en insectenpopulaties in het ^veld4. Gezien het feit dat insectengastheren na EPF-infectie zullen sterven en vervolgens in de grond zullen vallen, kan isolatie van EPF uit bodemmonsters een stabiele hulpbron ^zijn3,6. Van saprofyten is bijvoorbeeld bekend dat ze de dode gastheer gebruiken als hun bron voor groei. De bodemaas- en selectieve mediumsystemen zijn op grote schaal gebruikt om EPF uit de bodem te detecteren en te isoleren3,4,7,8,9,10.

Bij de selectieve mediummethode wordt de verdunde bodemoplossing op een medium geplaatst dat breedspectrumantibiotica bevat (bijv. chlooramfenicol, tetracycline of streptomycine) om de groei van bacteriën te remmen2,3,9,11. Er is echter gemeld dat deze methode de diversiteit en dichtheid van de stam kan verstoren en een over- of onderschatting van veel microbiële gemeenschappen kan ^veroorzaken6. Bovendien zijn de geïsoleerde stammen minder pathogeen en concurreren ze tijdens isolatie met saprofyten. Het is moeilijk om EPF te isoleren uit de verdunde ^{bodemoplossing3}. In plaats van een selectief medium te gebruiken, isoleert de bodemaasmethode EPF van de geïnfecteerde dode insecten, die 2-3 weken kunnen worden bewaard, waardoor een efficiëntere en standaard EPF-scheidingsmethode ^wordt geboden3,4,7,6. Omdat de methode eenvoudig te bedienen is, kan men een verscheidenheid aan pathogene stammen isoleren tegen lage ^kosten4. Daarom wordt het veel gebruikt door veel onderzoekers.

Bij het vergelijken van de verschillende soorten insectenaassystemen zijn Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae de meest voorkomende EPF-soorten die worden aangetroffen in insecten die behoren tot de Hemiptera, Lepidoptera, Blattella en Coleoptera6,12,13,14. Onder deze insectenaas vertonen Galleria mellonella (orde Lepidoptera) en Tenebrio molitor (orde Coleoptera) hogere herstelpercentages van Beauveria en Metarhizium spp., in vergelijking met andere insecten. Daarom worden G. mellonella en T. molitor vaak gebruikt voor het lokken van insecten. In de loop der jaren heeft het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) een EPF-bibliotheek (Agricultural Research Service Collection of EPF-culturen, ARSEF) opgericht die een grote verscheidenheid aan soorten bevat, waaronder 4081 soorten Beauveria spp., 18 soorten Clonostachys spp., 878 soorten Cordyceps spp., 2473 soorten Metarhizium spp., 226 soorten Purpureocillium spp., en 13 soorten Pochonia spp. onder ^andere15. Een andere EPF-bibliotheek werd gebouwd door het Entomology Research Laboratory (ERL) van de Universiteit van Vermont in de Verenigde Staten voor c.a. 30 jaar. Het omvat 1345 stammen van EPF uit de Verenigde Staten, Europa, Azië, Afrika en het ^{Midden-Oosten16}.

Om lokale of invasieplagen in Taiwan te bestrijden, is isolatie en selectie van inheemse EPF vereist. Daarom hebben we in dit protocol de procedure van de bodemaasmethode aangepast en beschreven en gecombineerd met het insectenaas (meelworm, Tenebrio molitor) -^systeem17. Op basis van dit protocol werd een EPF-bibliotheek opgericht. Twee screeningsrondes (kwantificering van inenting) werden uitgevoerd voor de voorlopige EPF-isolaten. EPF-isolaten vertoonden pathogeniciteit voor insecten. De potentiële stammen werden onderworpen aan morfologische en moleculaire identificaties en verder geanalyseerd door de thermotolerantie en conidiale productietest. Verder werd ook een concept van effectief conidia-nummer (ECN) voorgesteld. Met behulp van ECN-formule en principal component analysis (PCA) werden de potentiële stammen geanalyseerd onder gesimuleerde omgevingsdruk om het proces van het opzetten en screenen van de EPF-bibliotheek te voltooien. Vervolgens werd de pathogeniciteit van veelbelovende EPF-stammen getest op de doelplaag (bijv. Spodoptera litura). Het huidige protocol integreert thermotolerantie en conidiale productiegegevens in de ECN-formule en PCA-analyse, die kunnen worden gebruikt als een standaardrangschikkingssysteem voor EPF-gerelateerd onderzoek.

Protocol

OPMERKING: Het hele stroomdiagram is weergegeven in figuur 1.

1. Isolatie en selectie van potentiële entomopathogene schimmels (EPF)

1. Verzamel het bodemmonster
   1. Verwijder 1 cm van de oppervlaktegrond en verzamel de grond vervolgens binnen de diepte van 5-10 cm met behulp van een schop van elke bemonsteringslocatie.
      OPMERKING:Bemonsteringslocaties zouden een berg, bos of dunbevolkte gebieden zijn om de besmetting van kunstmatig besproeide EPF-stammen te voorkomen. Zorg ervoor dat gebieden voor het verzamelen van bodemmonsters op het oppervlak bedekt zijn met onkruid. Droge grond of vochtige grond is niet geschikt voor dit experiment.
   2. Noteer de details van elke bemonsteringslocatie, inclusief GPS, hoogte, type veld, jaarlijkse temperatuur, jaarlijkse neerslag, verzameltijd (seizoen), bodemtype en pH-waarde.
   3. Verzamel 100 g van het bodemmonster in een plastic zak en bewaar het op kamertemperatuur als u het binnen 3 uur in het laboratorium aan het schimmelisolatieprotocol onderwerpt.
      OPMERKING: Als het monster niet binnen 3 uur kan worden gebruikt, bewaar de grond dan bij kamertemperatuur in donkere omstandigheden. Als het experiment niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, kan het bodemmonster gedurende 1 week tot het begin van het ^{protocol18,19} bij 4 °C worden bewaard.
2. Lok en isoleer de EPF met meelworm (Tenebrio molitor)
   1. Plaats 100 g van het bodemmonster in een plastic beker (dopdiameter = 8,5 cm, hoogte = 12,5 cm) en plaats vervolgens 5 meelwormen op het oppervlak van de grond bij kamertemperatuur in het donker gedurende 2 weken.
      OPMERKING: Andere soorten plastic bekercontainers kunnen ook worden gebruikt. Als de grond te droog is (gebarsten of zanderig), spuit dan gesteriliseerde _ddH2O (ongeveer 5-10 ml) op de grond. De lichaamslengte c.a. 2,5 cm (^14e instar) van T. molitor larven helpt bij schimmelisolaatschermen20.
   2. Observeer en registreer de larven dagelijks voor sterfte en mycose; bewaar de dode larven in de beker tot 2 weken voor schimmelisolatie.
      OPMERKING: De schimmel conidia-sporen in de bodemmonsters zullen zich tijdens het bovenstaande proces aan de meelwormlarven hechten. De schimmelmycose zal worden waargenomen als de schimmeldraden uit het intersegmentale membraan groeien en vervolgens zal het hele lichaam bedekt zijn met het mycelium. Sporulatie begint na 7 dagen en de kleur van de schimmelinfectie zal veranderen in de kleur van de conidia-massa.
   3. Breng de dode insecten over naar een schone bank en gebruik een steriele tandenstoker om de conidia te verzamelen. Streel ze op een kwart sterkte Sabouraud dextrose agar medium (1/4 SDA) plaat (55 mm) in het ^{laboratorium21}. Incubeer de kweekplaat bij 25 °C gedurende 7 dagen om de primaire kweek van schimmels te verkrijgen.
      OPMERKING: De 1/4 SDA-plaat wordt als volgt bereid: Meng 1,5 g Sabouraud dextrose-bouillon en 3 g agar in 200 ml _H2O en steriliseer vervolgens gedurende 20 minuten. Aliquot 1/4 SDA in elke 55 mm petrischaal voordat het stolt. De gestolde 1/4 SDA-platen worden tot gebruik bij 4 °C bewaard.
   4. Streep elke primaire cultuurschimmel opnieuw op één 55 mm 1/4 SDA-plaat in een laminaire stroom en incubeer de kweekplaat bij 25 °C gedurende 7 dagen om enkele kolonies schimmels te verkrijgen.
   5. Herhaal deze herisolatie ~ 2-3 keer en observeer onder lichtmicroscopie om enkele en zuivere morfologische schimmelkolonies te verkrijgen.
      OPMERKING: Isoleer alle EPF met behulp van T. molitor-bait en bewaar zoals beschreven in de volgende sectie. De scheiding, conservering, zuivere cultuur en strepering moeten in een laminaire stroom in de volgende secties worden uitgevoerd.
3. Bewaar de EPF-isolaten
   1. Snijd 3 van de 5 mm agarblokken aan de rand van elke geïsoleerde zuivere schimmelgekweekte plaat met een kurkboorder en plaats deze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml als één replica.
      OPMERKING: Drie replicaties voor elk schimmelisolaat worden aanbevolen voor de opslag van de EPF-stammen na de ^2e virulentietest. Moleculaire identificatie wordt ook aanbevolen als de opslagruimte beperkt is.
   2. Voeg 250 μL 0,03% oppervlakteactieve stofoplossing (materiaaltabel) en 250 μL 60% glycerol toe aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een micropipette; dan vortex gedurende 10 s.
   3. Sluit de microcentrifugebuis van 1,5 ml af met paraffinefilm en koel deze gedurende 24 uur voor in een koelkast van -20 °C. Breng vervolgens de voorgekoelde schimmelvoorraden over naar een koelkast van -80 °C voor cryopreservatie.
      OPMERKING: Extra zuivere kalkkweekplaten (afgezien van de cryo-geconserveerde monsters) werden gebruikt in rubriek 1.4.
4. 1e pathogeniteitsscreening voor schimmelisolaten
   1. Plaats vijf T. molitorlarven direct op het oppervlak van elke zuivere schimmelkweekplaat bij 25 °C.
   2. Observeer en registreer de mycose en mortaliteit gedurende 10 dagen. Selecteer het schimmelisolaat voor verdere analyse.
      OPMERKING: Schimmelisolaten die 100% sterfte veroorzaken, worden geselecteerd voor de ^2e virulentietest om hun virulentie voor T. molitorlarven te bevestigen. Als alternatief kan de onderzoeker de criteria aanpassen volgens zijn eigen studie.
5. 2e virulentietest van schimmelisolaten
   OPMERKING: Herstel op basis van het ^1e pathogeniciteitsonderzoek de geselecteerde schimmelisolaten van -80 °C voor de ^2e virulentietest. Het doel van de ^2e virulentietest is het kwantificeren van de pathogeniciteit van de geselecteerde schimmelisolaten na de ^1e screeningsronde.
   1. Oogst conidia van elk schimmelisolaat door gedurende 1 minuut te vortexen en tel het aantal conidia met behulp van een hemocytometer.
   2. Stel de conidia-suspensie in op een concentratie van 1 x ¹⁰⁷ conidia/ml in een oppervlakteactieve oplossing van 0,03% (materiaaltabel).
   3. Verdeel 10 μL van de schimmelsuspensie over 55 mm 1/4 SDA-platen en kweek gedurende 7 dagen bij 25 °C in het donker.
   4. Plaats vijf T. molitorlarven direct op het oppervlak van elke zuivere schimmelkweekplaat (c.a. 6 x ¹⁰⁷ conidia). Sluit de platen af met paraffinefilm en incubeer bij 25 °C in het donker.
   5. Observeer en registreer de mycose en mortaliteit gedurende 10 dagen.
   6. Herhaal de test (van stap 1.51 tot 1.5.5) in drievoud voor elk schimmelisolaat.
      OPMERKING: Schimmelisolaten die 100% sterfte veroorzaken, worden geselecteerd voor de ^3e virulentietest om hun virulentie te bevestigen om de plaag aan te pakken.
6. 3e virulentietest van schimmelisolaten voor doelplaag (Spodoptera litura als voorbeeld)
   1. Herhaal stap 1.5.2 tot en met 1.5.6 met geselecteerde isolaten uit de ^2e virulentie om virulentie tegen doelplaag te testen.
   2. Bereken de _LT50 van elk ^{schimmelisolaat22}.
      OPMERKING: De _LT50 van elk schimmelisolaat werd berekend door middel van gegeneraliseerde lineaire modellen (GLM's) met behulp van R studio (versie 3.4.1); de quasibinomiale foutverdeling en een loglinkfunctie kunnen worden gebruikt om rekening te houden met overdispersie.

2. Moleculaire identificatie van EPF

1. Extractie van schimmel genomisch DNA
   1. Verzamel c.a. 1 ^cm2 EPF van de 7-daagse 1/4 SDA plaat.
   2. Extraheer het schimmelgenomische DNA met behulp van een schimmelgenomische DNA-extractiekit volgens de instructies van de ^fabrikant23 (Tabel met materialen).
2. PCR-amplificatie en DNA-sequencing
   1. Versterk het ITS-gebied van Fungal met PCR van het ^{DNA-monster21} met behulp van de PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer ^set24 (tabel 1) met het volgende PCR-programma: 94 °C gedurende 1 minuut en vervolgens 35 cycli van 94 °C voor 30 s, 55 °C voor 30 s en 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging van 7 minuten bij 72 °C.
      OPMERKING: De ITS1F/ITS4R primer set is voor de identificatie op genusniveau.
   2. Sequentieer de PCR door commerciële sequencingservice.
   3. Gebruik NCBI BLAST zoeken naar vergelijkbare schimmels in de NCBI-database en selecteer de relatieve schimmeltypesoorten voor fylogenetische analyse.
      OPMERKING: De schimmelsoorten die behoren tot het geslacht Metarhizium of Beauveria moeten verder worden geïdentificeerd tot het soortniveau met tef-983F/tef-2218R primer ^set25 (herhaal stappen 2.1.1 tot 2.2.3). Voor schimmels die niet tot de geslachten Metarhizium of Beauveria behoren, kunnen andere moleculaire markers worden gebruikt om de soort te identificeren, waaronder DNA-lyase (APN2), bèta-tubuline (BTUB), RNA-polymerase II grootste subeenheid (RPB1), RNA polymerase II tweede grootste subeenheid (RPB2) en 3'-deel van translatie-elongatiefactor 1 alfa (TEF)^25,26 .
3. Fylogenetische analyse
   1. Gebruik ClustalX 2.1 ^software27 om de meerdere sequenties uit stap 2.2.2 en 2.2.3 uit te lijnen. Snijd het geconserveerde sequentiegebied handmatig bij met ^GeneDoc28.
   2. Voer de fylogenetische analyse uit met MEGA7 ^software29 op basis van de methoden minimale evolutie (ME), Neighbor-Joining (NJ) en maximale waarschijnlijkheid (ML).
      OPMERKING: Het uitvoeren van alle drie de methoden kan helpen om de classificatiestatus te bevestigen en nauwkeurig af te ronden. De schimmelisolaten gescreend door de ^1e pathogeniciteitsscreening worden gebruikt voor moleculaire identificatie op geslachtsniveau. De schimmelisolaten gescreend door de ^2e virulentietest worden gebruikt voor de moleculaire en morfologische identificatie op soortniveau.

3. Morfologische identificatie van EPF

1. Observatie van de morfologie van de schimmelkolonie
   1. Gebruik een camera om de groei van de schimmelcultuurkolonie gedurende 7 dagen vast te leggen en registreer de groei, vorm (pluizig, stevig) en kleur van de kolonies.
2. Observatie van conidia en conidioforen
   1. Schraap conidia uit de zuivere cultuurschimmelkolonie met een inentingslus en breng de sporen over naar een glasplaat met 0,1% Tween 80-oplossing. Bedek vervolgens met een coverslip voor lichtmicroscopische observatie van conidia.
   2. Gebruik een scalpel om een 5 ^mm2 agarblok van de hyphalstreng aan de rand van de schimmelkolonie te snijden en breng het agarblok vervolgens over op een glazen dia.
   3. Voer de reiniging als volgt uit: Voeg de 0,1% Tween 80-oplossing toe aan het agarblok met een plastic druppelaar en was het grootste deel van de overtollige conidia af met een pincet. Bedek het vervolgens met een coverslip voor lichtmicroscopische observatie.
      OPMERKING: 0,1% Tween 80 kan worden vervangen door een andere krachtigere oppervlakteactieve stof (Tabel van materialen), afhankelijk van schimmelsoorten en hydrofobiciteit.
   4. Meet en noteer de breedte en lengte van de conidia en conidioforen om de verschillen tussen verschillende schimmelisolaten te vergelijken.
   5. Gebruik Welch's ANOVA-test en Games-Howell-test (post-hoc test) om de conidiale breedte en lengte van elke soort te analyseren met behulp van R studio (versie 3.4.1).
      OPMERKING: Gegevensanalyse van morfologische tekens kan per geval worden aangepast. De schimmelisolaten gescreend met de ^3e virulentietest worden gebruikt voor de fysiologische karakterisering en ECN-ranking in secties 4 en 5.

4. Onderzoek naar conidiale productiviteit en thermotolerantie

1. Conidiale productietest
   1. Kweek het geselecteerde schimmelisolaat op 1/4 SDA medium bij 25 ± 1 °C in het donker gedurende 10 dagen.
   2. Bereid 1 ml van de conidiale suspensie van het schimmelisolaat in 0,03% oppervlakteactieve oplossing en pas aan tot 1 x ¹⁰⁷ conidia / ml zoals hierboven beschreven.
   3. Laat drie druppels van 10 μL conidiale suspensie vallen op 1/4 SDA en incubeer bij 25 °C in het donker gedurende 7, 10 en 14 dagen om de sporulatie van schimmels te tellen.
      OPMERKING: 10 μL is het beste volume om het blok van 5 mm te verzamelen met gelijkmatige schimmelsporulatie na schimmelgroei gedurende 7-14 dagen.
   4. Gebruik de kurkboorder om het agarblok van 5 mm los te maken van het midden van de kolonie en over te brengen in 1 ml 0,03% oppervlakteactieve oplossing (materiaaltabel) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml op elk tijdstip.
   5. Vortex de buis bij 3.000 tpm bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en gebruik een hemocytometer om het aantal conidia te tellen.
      OPMERKING: De formule die wordt gebruikt voor het tellen is het aantal conidia per 25 vierkanten van de kleinste cel (grootte = 0,025 ^mm2; kamerdiepte = 0,1 mm):
      Totaal aantal conidia op 5 vierkanten ÷ 80 × (4 × ¹⁰⁶)
   6. Herhaal dit drie keer voor elke isolatie.
2. Thermotolerance assay
   1. Kweek het geselecteerde schimmelisolaat op 1/4 SDA medium bij 25 ± 1 °C in het donker gedurende 10 dagen.
   2. Bereid 1 ml van de conidiale suspensie van schimmelisolaat in 0,03% oppervlakteactieve oplossing en pas aan tot 1 x ¹⁰⁷ conidia / ml zoals hierboven beschreven.
   3. Vortex de conidiale suspensie en verwarm deze in een droog bad van 45 °C gedurende 0, 30, 60, 90 en 120 min. Laat drie druppels van 5 μL van de conidiale suspensie vallen op 55 mm 1/4 SDA-medium op elk tijdstip na blootstelling aan hitte en incubeer bij 25 ± 1 °C gedurende 18 uur.
      OPMERKING: Vermijd het verspreiden van de schimmeldruppels om beter te kunnen focussen op het gebied.
   4. Tel het aantal gekiemde conidia-sporen met vijf willekeurig geselecteerde velden onder 200x lichtmicroscopie om de kiemkracht te bepalen.
   5. Voer drie replicaties uit voor elk isolaat.

5. Effectieve conidia nummer (ECN) ranking

1. ECN berekening
   OPMERKING: Verkrijg de conidiale productie- en thermotolerantiegegevens van elke potentiële schimmelstam voordat u het totale ^ECN21 berekent.
   1. Bereken de vouwverandering (FC) van conidiale productie op elk tijdstip:
      
      waarbij x = tijdstip voor gegevensverzameling; _ncp = aantal conidia na elke dag van groei; en I = beginnummer van gezaaide conidia.
   2. Bereken het conidiagetal onder de stressbehandeling op elk tijdstip met behulp van de volgende formule:
      
      waarbij, y = het ECN van het te behandelen tijdstip; _TT0 = de kiemsnelheid van conidia die geen hittestress ondergaan (= kiemsnelheid van 0 min warmtebehandeling); _TTz = spanningscoëfficiënt is de conidia kiemsnelheid op verschillende tijdstippen van warmtebehandeling (z).
   3. Bereken het totale ECN met behulp van de volgende formule:
      
   4. Vergelijk het ECN van elke schimmelstam.
2. Principal component analysis (PCA) van schimmelstammen
   OPMERKING:De PCA-analyse bevestigt de rangschikking van ECN en helpt bij het begrijpen van de correlatie tussen de fysiologische karakterwaarden. Vergelijk de ECN-waarden en selecteer EPF-isolaten met hogere ECN-waarden.
3. Gebruik R-software om PCA te maken door te coderen:
   #Input PCA-gegevensbestand
   a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)
   1. # Verwerking van voorbeeldgegevens
      row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
      X=rij.namen(a)
      df<- a[2:11]
   2. #PCA berekening
      pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
      vars <- (pca$sdev)^2
      pc1_percent = vars[1] / som(vars)
      pc2_percent = vars[2] / som(vars)
      waarde = pca$x
   3. #Output PCA visualisatie bestand
      png(file = 'pca.png', hoogte = 2000, breedte = 2000, res = 300)
      OPMERKING: Gebruik 7 tot 14 dagen conidiale productie en alle thermotolerantiegegevens om principal component analysis (PCA) uit te voeren voor het bevestigen van de ECN-ranking.
4. Selecteer de best presterende schimmelstammen op basis van ECN of PCA en voer de virulentietest van doelplagen uit voor verder onderzoek.

Resultaten

Isolatie en selectie van potentiële entomopathogene schimmels (EPF)
Door gebruik te maken van de Tenebrio molitor-gemedieerde Entomopathogene schimmels (EPF) bibliotheekconstructiemethode, zou het aantal schimmels zonder insectendodende activiteit worden uitgesloten; zo zou de isolatie-efficiëntie en selectie van EPF grotendeels kunnen worden verhoogd. Tijdens de toepassing van deze methode werd de informatie over bemonsteringslocaties, bodemmonsters en de ki...

Discussie

Entomopathogene schimmels (EPF) zijn gebruikt voor insectenbestrijding. Er zijn verschillende methoden om ^EPF30,31,32 te isoleren, selecteren en identificeren. Bij het vergelijken van de verschillende soorten insectenaasmethoden werden Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae vaak aangetroffen in insectenaas6,12,13,14.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar Bacteriologische kwaliteit	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	AGR001	Geschikt voor de meeste celcultuur/moleculaire, biologie toepassingen.
AGAROSE, biotechnologie kwaliteit	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	AGA001	Voor DNA elektroforese.
BioGreen Safe DNA Gel Buffer	BIOMAN	SDB001T
Koperen kurkboorders	Dogger	D89A-44001
Canon kiss x2	Canon	EOS 450D	Voor het vastleggen van de kolonie morfologie van stammen
Incubator met constante temperatuur	Yihder Co., Ltd.	LE-509RD	Schimmelbewaring.
cubee Mini-Centrifuge	GeneReach	MC-CUBEE
DigiGel 10 digitaal gel beeldsysteem	TOPBIO	DGIS-12S
Finnpipette F2 0,2 tot 2 µL Pipette	Thermo Scientific	4642010
Finnpipette F2 1 tot 10 µL Pipette	Thermo Scientific	4642030
Finnpipette F2 10 tot 100 µL Pipette	Thermo Scientific	4642070
Finnpipette F2 100 tot 1000 µL Pipette	Thermo Scientific	4642090
Finnpipette F2 2 tot 20 µL Pipette	Thermo Scientific	4642060
Finnpipette F2 20 tot 200 µL Pipette	Thermo Scientific	4642080
GeneAmp PCR Systeem 9700	Applied Biosystems	4342718
GenepHlow Gel/PCR Kit	Geneaid	DFH100
Genius Dry Bath Incubator	Major Science	MD-01N
Afgemeten cilinder Custom A 100mL	SIBATA	SABP-1195906	Meet het volume van reagentia.
Handtellingteller	SDI	NO.1055
Hemocytometer	bioman	AP-0650010	Bereken het aantal sporen
Inoculating lus	Dogger	D8GA-23000
deksel	IDEAHOUSE	RS92004
Micro dekglas	MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD	24241
Microscoop beeldsysteem	SAGE VISION CO.,LTD	SGHD-3.6C
Microscoopglaasjes	DOGGER	DG75001-07105
Mupid-2plus DNA Gel Elektroforese	ADVANCE	AD110
Nikon optisch microscoop	SAGE VISION CO.,LTD	Eclipse CI-L
Kunststof beker	IDEAHOUSE	CS60016
Presto Mini gDNA Gist Kit	Geneaid	GYBY300	Fungale genomische DNA extractie kit
Sabouraud Dextrose Bouillon (Sabouraud vloeibaar medium)	HiMedia Leading BioSciences Company	M033	Gebruikt voor de cultivatie van gisten, schimmels en zuurhoudende micro-organismen.
Scalpelmesje nr.23	Swann-Morton	310
Scalpel handgreep nr.4	AGARWAL SURGICALS	SSS -FOR-01-91
Schop	Save & Safe	A -1580242 -00
Silwet L-77	bioman(phytotech)	S7777	Oppervlakte-actieve stof
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002403
Stalen pincet	SIPEL ELECTRONIC SA	GG-SA
Steriele petrischaal	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	1621	Ondiepe cilindrische containers met passende deksels, specifiek voor microbiologie of celcultuur gebruik.
ThermoCell MixingBlock	BIOER	MB-101
Tween 80	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	164-21775
TwinGuard ULT Vriezer	Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.	MDF-DU302VX	-80°C monster opgeslagen.
Verticale vloer type kast	Chih Chin	BSC-3	Schimmelbewerkingscultivering.
Vortex Genie II	Scientific	SIG560
Ritssluiting opbergzakken	Save & Safe	A -1248915 -00
100 bp DNA Ladder	Geneaid	DL007
-20°C Vriezer	FRIGIDAIRE	Frigidaire FFFU21M1QW	-20°C monster en experimentele reagentia opgeslagen.
2X SuperRed PCR Master Mix	TOOLS	TE-SR01
50X TAE Buffer	BIOMAN	TAE501000