Methodenartikel

Protocol voor analyse en consolidatie van TrackMate-outputs voor het meten van tweedimensionale celmotiliteit met behulp van nucleaire tracking

DOI:

10.3791/62885

⸱

18 december 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Colorado Boulder, 2Department of Applied Mathematics, University of Colorado Boulder

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol voor high-throughput meting van celmotiliteit in HaCaT-keratinocyten beschrijft methoden voor het verzamelen en verwerken van afbeeldingen van celkernen en het uitvoeren van deeltjestracking met behulp van de ImageJ-plug-in TrackMate.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Collectieve cellulaire migratie speelt een sleutelrol in veel fundamentele biologische processen, waaronder ontwikkeling, wondgenezing en uitzaaiing van kanker. Om de regulatie van de celmotiliteit te begrijpen, moeten we deze gemakkelijk en consistent kunnen meten onder verschillende omstandigheden. Hier beschrijven we een methode voor het meten en kwantificeren van eencellige en bulkmotiliteit van HaCaT-keratinocyten met behulp van een nucleaire kleuring. Deze methode omvat een MATLAB-script voor het analyseren van TrackMate-uitvoerbestanden om verplaatsingen, motiliteitssnelheden en trajecthoeken in afzonderlijke cellen en in bulk te berekenen voor een beeldvormingssite. Dit script voor motiliteitsanalyse maakt een snelle, ongecompliceerde en schaalbare analyse van de celmotiliteitssnelheid van TrackMate-gegevens mogelijk en kan op grote schaal worden gebruikt om de regulatie van motiliteit in epitheelcellen te identificeren en te bestuderen. We bieden ook een MATLAB-script voor het reorganiseren van microscopievideo's die op een microscoop zijn verzameld en deze converteren naar TIF-stacks, die in bulk kunnen worden geanalyseerd met behulp van de ImageJ TrackMate-plug-in. Door deze methodologie te gebruiken om de rol van adherens-juncties en actine-cytoskeletale dynamiek bij het reguleren van de celmotiliteit in HaCaT-keratinocyten te onderzoeken, tonen we bewijs aan dat Arp2/3-activiteit vereist is voor de verhoogde beweeglijkheid die wordt gezien na depletie van α-catenine in HaCaT-keratinocyten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nauwkeurige, responsieve regulatie van de cellulaire motiliteit in epitheelcellen is cruciaal voor wondgenezing en voor het aanvullen van de epitheellaag. Het niet behouden van de beweeglijkheid kan leiden tot problemen met de embryonale ontwikkeling en wondgenezing1 en signalering van overactieve beweeglijkheid levert een belangrijke bijdrage aan kankermetastase2.

Inzicht in cellulaire controle van motiliteit in HaCaT-keratinocyten biedt belangrijke inzichten in deze processen. De hier beschreven procedures bieden consistente metingen en berekeningen van de gemiddelde omvang van cellulaire motiliteit op eencellig of populatieniveau. We hebben deze methode gebruikt om de motiliteit in HaCaT-keratinocyten te meten na genetische verstoring of behandeling met remmers van kleine moleculen om de celsignalering te begrijpen die de motiliteitssnelheid regelt. Het meegeleverde MATLAB-script meet zowel de gemiddelde snelheid als de gemiddelde beweeglijkheidsrichting voor elke cel.

Collectieve celmotiliteit is cruciaal voor de overgang van epitheel naar mesenchym, zowel tijdens de ontwikkeling als bij kankermetastase3. Cellen bereiken beweeglijkheid door coördinatie van adhesie, polarisatie, uitsteeksel en terugtrekking4. Deze processen zijn sterk afhankelijk van een gecoördineerde regulatie van het dynamische actine-cytoskelet. Activering van Rac1 GTPase stroomafwaarts van PI3K of verschillende receptortyrosinekinasen polariseert de cel, wat resulteert in actinepolymerisatie5. De dynamiek van het actinecytoskelet wordt gereguleerd door deze en andere Rho-gemedieerde GTPases, die worden geactiveerd door stroomafwaarts van verschillende groeifactoren. Deze Rho-gemedieerde GTPases activeren vervolgens het Arp2/3-complex dat de actinevertakking stimuleert6. De dynamiek van deze actine-cytoskeletten is nauw verwant aan een andere belangrijke regulator van motiliteit: intercellulaire juncties. We zijn vooral geïnteresseerd in hoe de adherens-juncties, die sterke verklevingen tussen cellen vormen, coördineren met het actine-cytoskelet om de weefselintegriteit te behouden7.

We hebben eerder aangetoond dat HaCaT-keratinocyten die een shRNA-gemedieerde α-catenine-knockdown tot expressie brengen, hogere motiliteitssnelheden vertonen dan die welke een niet-gerichte shRNA-controle tot expressie brengen8. We willen de door ons ontwikkelde motiliteitsanalyse-instrumenten gebruiken om het mechanisme van deze verhoogde motiliteit bij depletie van α-catenine beter te begrijpen. α-Catenin is een vereiste cytosolische component van adherens juncties9. Het neemt deel aan adherens-juncties door zijn interactie met ß-catenine, dat het bindt als een monomeer10,11. α-catenine kan echter ook dissociëren van adherensjuncties om een homodimeer te vormen dat actinefilamenten bindt en bundelt, wat de Arp2/3-activiteit remt10,11. Hoewel α-catenine geen directe interactie heeft met actine terwijl het gebonden is aan ß-catenine, kan het toch de coördinatie tussen adherens-juncties en het cytoskelet vergemakkelijken of versterken door binding aan vinculine, dat actinefilamenten stabiliseert12.

Hoewel de TrackMate-plug-in voor ImageJ een gevestigde methode is voor het volgen van deeltjes die kan worden gebruikt om celkernen te volgen, ontdekten we dat de beschikbare tools voor het parseren, analyseren en consolideren van TrackMate-uitvoer om de celmotiliteit voor meerdere beeldvormingslocaties te berekenen, niet geïntegreerd waren en een uitdaging waren om te gebruiken voor mensen zonder expertise in meerdere programmeertalen. Tinevez en Herbert bieden een inleiding over het gebruik van TrackMate, maar de sectie over de analyse van de gemiddelde kwadratische verplaatsing vereist aanzienlijke MATLAB-vaardigheid13. Bestaande methoden voor het extraheren van motiliteitssnelheden uit time-lapse-microscopievideo's bieden complexere driedimensionale analyses, maar vereisen meer programmeerexpertise14,15. Pathfinder, een software voor het volgen en analyseren van cellen die eerder in ons lab is ontwikkeld, meet de snelheid en richting van celmigratie, maar is alleen uitvoerbaar op Windows-machines en vereist een beperkende Java Runtime-omgeving16. Omdat TrackMate zo'n betrouwbare en goed gedocumenteerde tool is, hebben we een eenvoudige methode ontwikkeld voor het genereren, analyseren en organiseren van grote tweedimensionale TrackMate-datasets met behulp van MATLAB. Ons script verwijdert ook de herhaalde integer datapunten die soms voorkomen in TrackMate-uitvoer nadat een gevolgde cel de beeldvormingsplaats heeft verlaten, waardoor cellen met een hoge beweeglijkheid en/of directionaliteit in de analyse kunnen worden opgenomen zonder de opname van deze valse datapunten. We bieden ook een script voor het reorganiseren van afbeeldingen die zijn verzameld op een ImageXpress Micro XL in TIFF-stacks die in bulk kunnen worden geanalyseerd met behulp van TrackMate.

In dit protocol worden cellen gezaaid in een beeldvormingsplaat met 96 putjes. Nadat we de cellen voldoende tijd hebben gegeven om zich aan de bodem van de plaat te hechten, behandelen we ze met Hoechst-kernkleuring en eventuele kleine moleculen waarvan de effecten op de beweeglijkheid van belang zijn. We verzamelen beelden van de celkernen in de loop van vijf of meer uur, waarna de beeldsequenties met behulp van MATLAB worden verwerkt tot TIFF-stacks die op de achtergrond worden afgetrokken. Deze TIFF-stacks worden geanalyseerd met behulp van de ImageJ TrackMate-plug-in, die elke afzonderlijke cel registreert en volgt op tijdstippen17. Nadat we celsporen hebben gegenereerd voor alle beeldvormingssites, gebruiken we een aangepast MATLAB-script om valse datapunten te verwijderen die optreden nadat cellen het beeldvormingsveld hebben verlaten en om de gemiddelde motiliteitspercentages voor elke beeldvormingslocatie te berekenen. Het script analyseert alleen cellen die worden bijgehouden voor een door de gebruiker opgegeven minimum aantal tijdstippen en stelt de gebruiker in staat cellen te filteren op totale afstand en/of afgelegde richting. Het resultaat is de gemiddelde verplaatsing, de gemiddelde rijrichting, de totale verplaatsing en de algehele rijrichting voor elke cel, die worden gebruikt om de bulkgemiddelden van die waarden voor alle cellen op een beeldvormingslocatie te berekenen. Dit protocol kan in bulk worden uitgevoerd op grote beeldvormingsexperimenten, wat zich leent voor motiliteitsanalyse met een relatief hoge doorvoer (Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celcultuur en voorbereiding van beeldplaten

  1. Kweek HaCaT-cellen in celkweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline/streptomycine en 10% (v/v) foetaal runderserum) bij 37 °C en 5% kooldioxide in een bevochtigde incubator.
  2. Zaai het gewenste aantal cellen per putje (we gebruiken 5000 - 20.000 cellen/putje) in een beeldvormingsplaat met 96 putjes, zoals een microplaat van zwart polystyreen met 96 putjes. Voeg aan drie putjes alleen medium toe (geen cellen).
  3. Laat de plaat 20 - 30 minuten op een volledig vlakke ondergrond rusten, zodat de cellen zich met een gelijkmatige ruimtelijke verdeling aan de bodem van de plaat kunnen hechten.
  4. Breng de plaat gedurende 4-6 uur over in een bevochtigde celkweekbroedmachine (37 °C, 5% kooldioxide) om de cellen volledig aan de bodem van de plaat te laten hechten.
  5. Verwijder het medium van de plaat en vervang het door celkweekmedium met 2 μg/ml Hoechst-kleurstof (een verdunning van 1:5000 van 1 mg/ml stockoplossing).
  6. Plaats de plaat gedurende 2 uur terug in de bevochtigde celkweekbroedmachine (37 °C, 5% kooldioxide).
  7. Was de plaat drie keer voorzichtig met 100 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing per putje voordat u 90 μL beeldmedium (fenolroodvrije Dulbecco's Modified Eagle's Medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline/streptomycine en 10% (v/v) foetaal runderserum) aan elke put toevoegt.
  8. Als u de effecten van remmers van kleine moleculen of andere effectoren meet, behandel cellen dan onmiddellijk voor de beeldvorming.

2. Beeldvorming

  1. Stel de plaat (inclusief putten met alleen media) af met een vergroting van 10x in een microscoop met een bevochtigde klimaatkamer bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.
    OPMERKING: De analysescripts in dit protocol zijn geschreven voor gegevens die zijn verzameld op een Molecular Devices ImageXpress Micro XL breedveldmicroscoop.
  2. Verzamel afbeeldingen op basis van de tijdelijke resolutie die het experiment vereist. Noteer voor het beste resultaat minimaal 4 tijdstippen per uur gedurende minimaal 5 uur. Als u de effecten van remmers van kleine moleculen of andere perturbances op cellen meet, maak dan een beeld gedurende ten minste 5 uur na de verwachte tijd om een effect te zien. Voor onze doeleinden maken we beelden voor 100 tijdstippen van 8 minuten voor een totale beeldvormingstijd van 13 uur en 20 minuten.

3. Beeldverwerking

  1. Gebruik het meegeleverde aangepaste MATLAB-script "ImageReorganizer.m" om miniatuurafbeeldingen te verwijderen en de afbeeldingsbestanden te reorganiseren op goed in plaats van op tijdstip. De ImageXpress voert bestanden uit in deze mapindeling: "[Experimentnaam] > [JJJJ-MM-DD] > [Runnummer] > Timepoint_[Timepoint] > [Afbeeldingsbestanden]." Zodra afbeeldingen zijn gereorganiseerd, voert dit script achtergrondaftrekking uit op afbeeldingen van elk tijdstip met behulp van de gemiddelde en gaussiaanse wazige afbeeldingen van de bronnen met alleen media vanaf dat tijdstip. Dit script organiseert vervolgens de achtergrond-afgeleide afbeeldingen in een TIFF-stack voor elke beeldvormingssite. Elke TIFF-stack heeft de naam "[Well]_[Site].tif".
    1. Als het experiment zich over meer dan één dag uitstrekt, combineert u de inhoud van de mappen [Uitvoeringsnummer] voor alle dagen, zodat alle submappen 'Timepoint_[Tijdstip]' zich in dezelfde map '[Uitvoeringsnummer]' bevinden.
    2. Merk op dat dit script de MATLAB-functie int2strz18 vereist. Voer het lokale pad naar deze functie in na "addpath" op regel 2.
    3. Voer de rijen voor putten met alleen media in als "lege rijen" op regel 9 en de kolommen als "lege kolommen" op regel 10.
    4. Voer de rijen voor experimentele putten in als "rijen" op regel 15 en de kolommen als "kolommen" op regel 16. Voer het aantal beeldvormingslocaties per bron en "sites" in op regel 17.
    5. Voer de padnaam voor de map "[Run number]" in de padbalk in MATLAB in en voer het script uit.

4. Cel volgen

OPMERKING: TrackMate kan worden uitgevoerd op alle TIFF-stacks in een aangewezen directory met behulp van een licht gewijzigde versie van het Run_TrackMate_Headless.groovy-script van Tinevez et al.17 of kan handmatig worden uitgevoerd voor elke individuele TIFF-stack. We voeren FIJI handmatig uit op een paar voorbeeld-TIFF-stacks om er zeker van te zijn dat we de juiste parameters gebruiken voordat we het Groovy-script uitvoeren op alle TIFF-stacks met behulp van deze parameters.

  1. Om de TrackMate-plug-in in FIJI uit te voeren voor alle TIFF-stacks in een map, downloadt en gebruikt u het Run_TrackMate_Headless.groovy-script van Tinevez et al.17 volgens het meegeleverde protocol. We gebruiken een licht gewijzigde versie van dit script, waardoor we eenvoudig zowel de invoerbestanden als de uitvoerbestandsnamen kunnen batchen en alle parameters kunnen invoeren met behulp van één grafische gebruikersinterface voor invoer. Hieronder vindt u gedetailleerde instructies voor het gebruik van dit aangepaste script, dat hier wordt geleverd als TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    1. Open het script in FIJI door File>Open te selecteren en vervolgens naar de locatie van het TrackMate_Headless_Mod.groovy-script te navigeren.
    2. Selecteer Uitvoeren.
    3. Voer de map in waarin de TIFF-stacks zich bevinden (de standaarduitvoer van "StackGenerator.m" moet "[Experimentnaam] > [JJJJ-MM-DD] >> stapels) zijn als "Invoermap".
    4. Maak een uitvoermap en voer de padnaam in als 'Uitvoermap'. De standaardinstelling voor "Bestandsextensie moet ".tif" zijn; zo niet, voer dan ".tif" in als "Bestandsextensie".
    5. Als u TrackMate alleen wilt uitvoeren op een subset van bestanden in de map, gebruikt u de invoerruimte na "Bestandsnaam bevat" om deze op te nemen. Laat die ruimte anders leeg.
    6. Selecteer 'Mappenstructuur behouden bij opslaan'.
    7. Voer 'Spotradius', 'Kwaliteitsdrempel', 'Maximale framekloof', 'Maximale afstand koppelen' en 'Maximale afstand tussen openingen' in pixels in, afhankelijk van de gewenste instellingen. We gebruiken meestal respectievelijk 3,5, 18, 2, 15 en 40 voor HaCaT-kernen met een vergroting van 10x.
    8. Selecteer OK. Dit script moet een XML-bestand uitvoeren voor elke TIFF-stack in de aangewezen uitvoermap.
  2. U kunt ook de TrackMate-plug-in in FIJI handmatig uitvoeren voor elke TIFF-stack volgens het protocol dat wordt beschreven in Tinevez et al.13
    1. Open een TIFF-stack in FIJI en open de TrackMate-plug-in door Plugins >Tracking > TrackMate in de menubalk te selecteren.
    2. Als in een pop-upvenster de melding wordt weergegeven: "Het lijkt erop dat deze afbeelding 1 tijdstip heeft, maar [aantal tijdstippen] segmenten. Wil je Z en T verwisselen?" selecteer Ja.
    3. Gebruik in TrackMate v4.0.1 de standaardinstellingen, behalve "Geschatte blobdiameter" (we gebruiken 7.000 pixels voor HaCaT-kernen bij 10x vergroting) en drempelwaarde (we gebruiken 18.000, maar dit is afhankelijk van de gebruikte microscoop en de intensiteit van de Hoechst-kleurstof).
    4. Gebruik de voorbeeldfunctie om te zorgen voor geoptimaliseerde deeltjesdetectie en pas de instellingen voor blobdiameter en drempelwaarde indien nodig aan.
    5. Voor "Gap-closing max distance" werken standaardinstellingen vaak voor basale HaCaT-motiliteit, maar de gap-closing max distance moet mogelijk worden verhoogd tot maximaal 40,0 pixels onder omstandigheden die de motiliteit verbeteren.
    6. Controleer visueel dat de tracering is geoptimaliseerd met minimale hiaten in celsporen.
    7. Kies onder Selecteer een actie [sic] de optie Tracks exporteren naar XML-bestand en voer uit.
    8. Herhaal dit voor alle TIFF-stacks.

5. Kwantificering van de motiliteitsgraad

OPMERKING: Gebruik het meegeleverde aangepaste MATLAB-script "TrackMateAnalysis.m" om mislukte sporen te verwijderen en de beweeglijkheid voor alle TrackMate-uitvoerbestanden te kwantificeren. Het script verwijdert sporen die buiten het frame worden verplaatst (waarvan de locatie standaard wordt herleid tot gehele getallen) en sporen die worden bijgehouden voor minder dan een bepaald aantal tijdstippen. Het script verwijdert sporen die buiten het frame worden verplaatst (waarvan de locatie standaard wordt getraceerd naar gehele getallen) en sporen die worden bijgehouden voor minder dan een ontwerpbaar aantal tijdstippen. De output is de gemiddelde verplaatsing per tijdstip voor individuele cellen en alle cellen op een beeldvormingslocatie. (Voorbeeld uitvoer: 'Output.mat')

  1. Merk op dat dit script de meegeleverde MATLAB-functie "import_trackmate_xml.m." vereist. Voer het lokale pad naar deze functie in na "addpath" op regel 4.
  2. Geef op regel 7 het minimale aantal tijdstippen aan waarover een deeltje moet worden gevolgd om te worden opgenomen in uw geconsolideerde output.
  3. Geef op de regels 12 en 13 het bereik van de afgelegde afstanden (in pixels) aan die in de gefilterde analyse moeten worden opgenomen. Om alle mogelijke afgelegde afstanden op te nemen, voert u een bereik in van 0 tot de breedte van uw beeldveld.
  4. Geef op de regels 14 en 15 het bereik van trajecten (in graden) aan die in de gefilterde analyse moeten worden opgenomen. Om alle mogelijke trajecten op te nemen, voert u een bereik van 0 tot 360 in.
  5. Voer het script uit in de map met alle TrackMate-uitvoer-XML-bestanden.
    OPMERKING: Het script genereert en bewaart een MATLAB-celstructuur met alle gegevens die in deze analyse zijn gegenereerd. Tables{1,:} bevat de namen van Trackmate-uitvoer-XML-bestanden voor elke beeldverwerkingssite die door dit script wordt geanalyseerd. Tabellen{2,:} is een substructuur die de posities (pixels), verplaatsingen (pixels) en reishoeken (graden, waarbij 0° een rechtse rijrichting aangeeft binnen de beeldvormingsplaats) bevat voor alle afzonderlijke cellen op elk tijdstip. Het bevat ook de totale afgelegde afstand (pixels), de gemiddelde beweeglijkheid (pixels/tijdstip), de gemiddelde reishoek (graden) voor elke cel op alle tijdstippen, evenals de totale reishoek tussen het eerste en laatste tijdstip voor elke cel. De 3een 4erij van tabellen bevatten respectievelijk de gemiddelde en standaarddeviatiemotiliteitswaarden (pixels/tijdstip) voor alle cellen op alle tijdstippen in elke beeldvormingslocatie. De 5een 6erij bevatten respectievelijk de gemiddelde en standaarddeviatiewaarden voor de totale afgelegde afstand (pixels) door alle cellen op alle tijdstippen op elke beeldvormingslocatie. De 7een 8erij bevatten de gemiddelde en standaarddeviatiewaarden voor de totale reishoek (graden) tussen het eerste en laatste tijdstip voor alle cellen op een beeldvormingslocatie. Terwijl de rijen 3-8 van Tabellen deze waarden bevatten voor alle cellen die voldoen aan de minimale criteria voor het bijhouden van tijdstippen, bevatten de rijen 9-14 dezelfde waarden, maar alleen voor cellen die voldoen aan de door de gebruiker aangegeven filtercriteria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om ervoor te zorgen dat ons analysescript betrouwbaar en consistent was, hebben we de beweeglijkheid van HaCaT-keratinocyten gemeten in drie onafhankelijke experimenten. We ontdekten dat hoewel de standaarddeviatie van celmotiliteit variabel was tussen experimenten (mogelijk vanwege de gevoeligheid van HaCaT-cellen voor samenvloeiing en mechanische stimuli), de gemiddelde beweeglijkheid consistent werd gerepliceerd in meerdere experimenten zonder statistisch significante verschillen tuss...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hierboven beschreven methodologie en analysetools bieden een eenvoudige en schaalbare manier voor het meten en kwantificeren van de beweeglijkheid van HaCaT-keratinocyten die gebruikmaakt van MATLAB en die minimale programmeerervaring vereist. Dit protocol vereist dat de celkernen in de loop van ten minste 5 uur worden gekleurd en in beeld worden gebracht. Hoewel gegevensverzameling op elke geschikte microscoop kan worden uitgevoerd, biedt dit protocol een script voor het verwerken va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.L. en de University of Colorado Boulder hebben een financieel belang in de ontwikkeling van HDAC-remmers voor therapieën en bezitten aandelen in OnKure. X.L. is medeoprichter en lid van de raad van bestuur van OnKure, dat een licentie heeft voor eigen HDAC-remmers van de Universiteit van Colorado Boulder. OnKure is niet betrokken bij de experimentele opzet of financiering van deze studie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Daniel Messenger, Lewis Baker, Douglas Chapnick, Adrian Ramirez, Quanbin Xu en andere leden van de Liu- en Bortz-laboratoria voor hun inzicht en advies. We danken Jian Tay voor het delen van zijn MATLAB-expertise en voor het schrijven van de functie voor XML-import. We danken Joseph Dragavon van de BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core voor zijn ondersteuning bij microscopie en beeldvorming. We danken Theresa Nahreini en Nicole Kethley van de Cell Culture Core Facility voor hun ondersteuning bij celcultuur. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Cancer Institute en het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health (R01AR068254) aan X. L. en National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) R01GM126559 aan D.B. en X. L. G.E.W. en E.N.B. werden ondersteund door een predoctorale opleidingsbeurs van de NIGMS (T32GM08759). De ImageXpress Micro XL werd ondersteund door het National Center for Research Resources (S10 RR026680). FACSAria werd ondersteund door de National Institutes of Health (S10OD021601).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterileCorning3603
Dulbecco's gemodificeerd arendsmedium (hoge D-glucose)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Foetaal bovien serumSigma-Aldrich IncF0926
Fluorobrite Dulbecco's gemodificeerd arendsmedium (hoge D-glucose, 3,7 g/L natriumbicarbonaat, geen L-glutamine, geen fenol rood)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR&D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydraatInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicilline streptomycineLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Fosfaat gebufferde zoutoplossingGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
  2. Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and metastasis: insights from simple model organisms. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 296-312 (2018).
  3. Campbell, K., et al. Collective cell migration and metastases induced by an epithelial-to-mesenchymal transition in Drosophilaintestinal tumors. Nature Communications. 10 (1), 1-10 (2019).
  4. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  5. Parri, M., Chiarugi, P. Rac and Rho GTPases in cancer cell motility control. Cell Communication and Signaling. 8 (1), 23(2010).
  6. Sumida, G. M., Yamada, S. Rho GTPases and the downstream effectors actin- related protein 2/3 (Arp2/3) complex and myosin II induce membrane fusion at self-contacts. The Journal of Biological Chemistry. 290 (6), 3238-3247 (2015).
  7. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell., 4th edition. , (2002).
  8. Bunker, E. N., Wheeler, G. E., Chapnick, D. A., Liu, X. Suppression of α-catenin and adherens junctions enhances epithelial cell proliferation and motility via TACE- mediated TGF-α autocrine/paracrine signaling. Molecular Biology of the Cell. 32 (4), 348-361 (2021).
  9. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  10. Drees, F., Pokutta, S., Yamada, S., Nelson, W. J., Weis, W. I. α-Catenin is a molecular switch that binds E-cadherin-β-catenin and regulates actin-filament assembly. Cell. 123 (5), 903-915 (2005).
  11. Yamada, S., Pokutta, S., Drees, F., Weis, W. I., Nelson, W. J. Deconstructing the cadherin-catenin-actin complex. Cell. 123 (5), 889-901 (2005).
  12. Rangarajan, E., Izard, T. The cytoskeletal protein α-catenin unfurls upon binding to vinculin. The Journal of Biological Chemistry. 287 (22), 18492-18499 (2012).
  13. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO dots assembly: single-particle tracking and analysis. Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-97 (2020).
  14. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  15. Wu, P. -H., Giri, A., Wirtz, D. Statistical analysis of cell migration in 3D using the anisotropic persistent random walk model. Nature Protocols. 10, 517-527 (2015).
  16. Chapnick, D. A., Jacobsen, J., Liu, X. The development of a novel high throughput computational tool for studying individual and collective cellular migration. PloSOne. 8 (12), 82444(2013).
  17. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  18. Vargas Aguilera, C. A. int2strz.m. MATLAB Commons. , (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

TrackMate analysetweedimensionale motiliteitHaCaT keratinocytenMATLAB scriptmotiliteitskwantificeringadherens junctiesactine cytoskeletepitheliale cellen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen