Synthese en karakterisering van mRNA-geladen poly (bèta-aminoesters) nanodeeltjes voor vaccinatiedoeleinden

Samenvatting

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.

Samenvatting

Vaccinatie is een van de grootste successen van de moderne samenleving en is onmisbaar bij het beheersen en voorkomen van ziekten. Traditionele vaccins waren samengesteld uit hele of fracties van het infectieuze agens. Er blijven echter uitdagingen en nieuwe vaccintechnologieën zijn verplicht. In deze context heeft het gebruik van mRNA voor immuniserende doeleinden een verbeterde prestatie laten zien, zoals blijkt uit de snelle goedkeuring van twee mRNA-vaccins die SARS-CoV-2-infectie voorkomen. Naast succes bij het voorkomen van virale infecties, kunnen mRNA-vaccins ook worden gebruikt voor therapeutische kankertoepassingen.

Niettemin maakt de instabiliteit van mRNA en de snelle klaring uit het lichaam als gevolg van de aanwezigheid van nucleasen de naakte afgifte ervan niet mogelijk. In deze context zijn nanogeneesmiddelen, en specifiek polymere nanodeeltjes, kritieke mRNA-afgiftesystemen. Het doel van dit artikel is dus om het protocol te beschrijven voor de formulering en test van een kandidaat-mRNA-vaccin op basis van de gepatenteerde polymere nanodeeltjes. De synthese en chemische karakterisering van de gebruikte poly(bèta-aminoesters)polymeren, hun complexatie met mRNA om nanodeeltjes te vormen en hun lyofilisatiemethodologie zullen hier worden besproken. Dit is een cruciale stap voor het verlagen van opslag- en distributiekosten. Ten slotte zullen de vereiste tests worden aangegeven om hun vermogen aan te tonen om in vitro transfecterende en volwassen modelleer dendritische cellen te modelleren. Dit protocol zal de wetenschappelijke gemeenschap die aan vaccinatie werkt ten goede komen vanwege de hoge veelzijdigheid die deze vaccins in staat stelt een breed scala aan ziekten te voorkomen of te genezen.

Inleiding

Infectieziekten vormen een ernstige bedreiging voor miljoenen mensen over de hele wereld en zijn nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken in sommige ontwikkelingslanden. Profylactische vaccinatie is een van de meest effectieve interventies van de moderne samenleving om infectieziekten te voorkomen en te beheersen^1,2. Deze kritieke mijlpalen van de wetenschap in de relevantie van de^20eeeuw zijn opgemerkt door de recente wereldwijde Covid-19-pandemie veroorzaakt door het SARS-CoV-2-virus³. Erkennend het belang van het hebben van efficiënte vaccins om de verspreiding van de ziekte te beperken, hebben coöperatieve inspanningen van alle biomedische gemeenschappen met succes geresulteerd in veel profylactische vaccins op de markt in minder dan een jaar⁴.

Traditioneel werden vaccins samengesteld uit verzwakte (levende, verminderde virulentie) of geïnactiveerde (doodsdeeltjes) virussen. Voor sommige ziekten zonder marge voor veiligheidsfouten zijn virale deeltjes echter niet mogelijk en worden in plaats daarvan eiwitsubeenheden gebruikt. Niettemin maken subeenheden meestal de combinatie van meer dan één epitoop / antigeen niet mogelijk en zijn adjuvantia nodig om de vaccinatiepotentie te verbeteren^5,6. Daarom is de behoefte aan nieuwe vaccintypen duidelijk.

Zoals aangetoond tijdens de huidige pandemie, kunnen nieuwe vaccinkandidaten op basis van nucleïnezuren voordelig zijn in termen van het vermijden van lange ontwikkelingsprocessen en het bieden van een hoge veelzijdigheid terwijl tegelijkertijd een vitale patiëntimmunisatie wordt geproduceerd. Dit is het geval met mRNA-vaccins, die aanvankelijk werden ontworpen als experimentele kankervaccins. Dankzij hun natuurlijke vermogen om antigeenspecifieke T-celresponsen^3,5,6,7te produceren. Omdat mRNA het molecuul is dat codeert voor het antigene eiwit en alleen hetzelfde verandert, kan het vaccin snel worden aangepast om andere varianten van hetzelfde micro-organisme, verschillende stammen, andere infectieuze micro-organismen te immuniseren of zelfs een immunotherapeutische behandeling voor kanker te worden. Bovendien zijn ze voordelig in termen van grootschalige productiekosten. MRNA heeft echter een belangrijke hindernis die hun naakte toediening belemmert: de stabiliteit en integriteit ervan worden aangetast in fysiologische media, vol met nucleasen. Om deze reden is het gebruik van een nanometrische drager die het beschermt en mRNA vectoriseert naar de antigeen-presenterende cellen vereist^2,8.

In deze context zijn poly (bèta-aminoesters) (pBAE) een klasse van biocompatibele en biologisch afbreekbare polymeren die een opmerkelijk vermogen hebben aangetoond om mRNA in nanometrische deeltjes te complexeren, dankzij hun kationische ladingen^9,10,11. Deze polymeren zijn samengesteld uit esterbindingen, waardoor hun afbraak door esterasen in fysiologische omstandigheden gemakkelijk wordt. Onder de pBAE-bibliotheekkandidaten vertoonden degenen die gefunctionaliseerd waren met end kationische oligopeptiden een hoger vermogen om kleine nanodeeltjes te vormen om cellen efficiënt binnen te dringen via endocytose en het ingekapselde genmateriaal te transfecteren. Bovendien maakt de verzuring van het endosoomcompartiment dankzij hun buffercapaciteit endosomale ontsnapping^12,13mogelijk. Namelijk, een specifiek soort pBAE, inclusief hydrofobe moieties op hun ruggengraat (de zogenaamde C6 pBAE) om hun stabiliteit en eind-oligopeptide combinatie te verbeteren (60% van het polymeer gemodificeerd met een tri-lysine en 40% van het polymeer met een tri-histidine) die selectief antigeen-presenterende cellen transfecteert na parenterale toediening en de mRNA-gecodeerde antigeenpresentatie produceert gevolgd door muizenimmunisatie is onlangs gepubliceerd¹⁴ . Bovendien is ook aangetoond dat deze formuleringen een van de belangrijkste knelpuntstappen van nanogeneeskundeformuleringen kunnen omzeilen: de mogelijkheid om ze te vriesdrogen zonder hun functionaliteit te verliezen, wat langdurige stabiliteit in zachte droge omgevingen mogelijk maakt¹⁵.

In deze context is het doel van het huidige protocol om de procedure voor de vorming van de mRNA-nanodeeltjes beschikbaar te maken voor de wetenschappelijke gemeenschap door een beschrijving te geven van de kritieke stappen in het protocol en de productie van efficiënte vaccins voor infectieziektenpreventie en tumorbehandelingstoepassingen mogelijk te maken.

Het volgende protocol beschrijft de volledige training om oligopeptide end-modified poly (beta aminoesters) - OM-pBAE polymeren te synthetiseren die verder zullen worden gebruikt voor nanodeeltjessynthese. In het protocol is ook de formulering van nanodeeltjes opgenomen. Bovendien worden ook kritieke stappen voor het succes van de procedure en representatieve resultaten gegeven om ervoor te zorgen dat de resulterende formuleringen voldoen aan de vereiste karakteriseringskenmerken voor kwaliteitscontrole om een positief of negatief resultaat te definiëren. Dit protocol is samengevat in figuur 1.

Protocol

1. Synthese van pBAE-polymeer met eind oligopeptiden (OM-pBAE)

1. Polymerisatie van C6-pBAE
   1. Voeg 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexylamine (38 mmol; MW = 101,19 Da) in een glazen kolf met ronde bodem (100 ml). Voeg vervolgens 1,4-butaandilmagalacrylaat (82 mmol; MW = 198,22 Da).
   2. Verwarm het siliconenoliebad voor op 90 °C, plaats de kolf met ronde bodem in het oliebad en roer het mengsel met behulp van een magnetische roerstaaf een nacht (~ 18 uur). Neem vervolgens het product uit de kolf met ronde bodem en plaats het in de vriezer bij -20 °C.
      OPMERKING: Het product heeft de vorm van een kleverig poeder en wordt met behulp van een spatel uit de kolf gehaald. Het is essentieel om de structuur van het verkregen polymeer te valideren door middel van ¹H-NMR. NMR-spectra werden geregistreerd in een 400 MHz-instrument (zie Materiaaltabel)met chloroform-d en D₂O als oplosmiddelen. Ongeveer 10 mg van elke poly(β-aminoester) werd ingenomen en opgelost in 1 ml van het gedeutereerde oplosmiddel.
2. Reactie met peptiden om OM-pBAE te verkrijgen
   1. Voeg 25 ml 0,1 M HCl toe aan geselecteerde peptiden, bijvoorbeeld peptide Cys-His-His-His met trifluorazijnzuur (TFA, 200 mg), in een eerder gewogen centrifugebuis van 50 ml die vriesdrogend kan weerstaan en een nacht handmatig roeren om een heldere oplossing te verkrijgen.
   2. Vries de oplossing gedurende 1 uur in bij -80 °C en vries het resulterende peptidehydrochloride af.
      OPMERKING: Controleer of het uiteindelijke gewicht overeenkomt met de theoretische waarde.
   3. Maak een oplossing van C6-pBAE (0,031 mmol) in dimethylsulfoxide. Maak ook een oplossing van het peptidehydrochloride (0,078 mmol) in dimethylsulfoxide.
   4. Meng de twee oplossingen in een schroefdopbuis en schroef de dop vast. Roer de mengseloplossing in een waterbad met een gecontroleerde temperatuur van 25 °C gedurende 20 uur met een magnetische roerstaaf.
   5. Voeg het mengsel toe aan 7:3 (v/v) diethylether/aceton. Centrifugeer de resulterende suspensie bij 25.000 x g bij 4 °C om het oplosmiddel te verwijderen. Was vervolgens de vaste stof tweemaal met 7:3 (v/v) diethylether/aceton. Droog het product vervolgens onder een vacuüm (<0,2 atm).
   6. Maak een oplossing van 100 mg/ml van het product in dimethylsulfoxide. Het resulterende product heet C6-peptide-pBAE. Het is essentieel om de structuur van het verkregen polymeer te valideren door middel van ¹H-NMR om het verdwijnen van de olefinesignalen geassocieerd met terminale acrylaten te bevestigen. Indien niet gebruikt, kan het polymeer worden ingevroren bij -20 °C.

2. Vorming van polyplexen

OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een geconditioneerde ruimte om een constante temperatuur te behouden.

1. Ontdooi de polymeren C6-peptide-pBAE en vortex de oplossing.
2. Pipetteer het polymeermengsel op en neer en bereid een oplossing van 12,5 mM (V₁) in natriumacetaat (NaAc). Draai vervolgens het mengsel en wacht 10 minuten.
3. Bereid het mRNA met 0,5 mg/ml en meng door pipetteren (V_2).
   OPMERKING: Het is cruciaal om vortexing van het mRNA te voorkomen.
4. Vortex het polymeermengsel bij de eindconcentratie om een homogene oplossing te bereiken tussen de polymeervoorraad in DMSO en de acetaatbuffer.
   OPMERKING: De uiteindelijke polymeerconcentratie is afhankelijk van de gekozen N/P-verhouding (stikstof/fosfaatgroepen). De N/P-verhouding is afhankelijk van elk specifiek te gebruiken mRNA. Voor eGFP-inkapseling werd bijvoorbeeld een verhouding van 25:1 gebruikt, zoals eerder gemeld¹⁴.
5. Meng de genetische materiaaloplossing en C6-peptidepBAE-oplossing (25x van de mRNA-concentratie) in een verhouding van 1:1 (V_i = V₁ + V₂).
   OPMERKING: C6-peptide-pBAE wordt geladen in een microcentrifugebuis waar het mRNA wordt toegevoegd door op en neer te pipetteren voor menging. Eenmaal bereid, zijn de polyplex-, het nucleïnezuur- en C6-peptide-pBAE-concentraties half verdund.
6. Incubeer bij 25 °C gedurende 30 min in een thermoblok. Precipiteer met 1:2 RNase-vrij water door het monster toe te voegen aan een vooraf geladen microcentrifugebuis met water.
7. Neem de hulpstoffen op. Voeg hetzelfde volume toe als het mengsel van mRNA en pBAE (V_i) in HEPES 20 mM en sucrose 4% door op en neer te pipetteren. Op dit punt is het monster 3x verdund.

3. Polyplexen lyofilisatie

1. Onmiddellijk invriezen bij -80 °C vriezer van de vorige polyplex oplossing gedurende 1 uur.
2. Voer de primaire droging uit door de stappen te volgen: (1) 1 uur bij -60 °C en 0,001 hPa; (2) 1 uur bij -40 °C en 0,0001 hPa; (3) 4 uur bij -20 °C en 0,0001 hPa; (4) 12 uur bij 5 °C en 0,0001 hPa.
3. Onmiddellijk bewaren bij -20 °C om rehydratatie tot gebruik te voorkomen.

4. Polyplex resuspensie

OPMERKING: Dit protocol beschrijft het proces dat wordt gebruikt om de gelyofiliseerde C6-peptide-pBAE nanodeeltjes te reconstrueren voor hun verdere gebruik voor karakterisering, in vitro of in vivo analyse.

1. Neem de gelyofiliseerde nanodeeltjes van -20 °C net op het moment van gebruik en voeg snel de overeenkomstige hoeveelheid gedepyrogeneerd (DEPC) water toe om de vaste stof opnieuw te verdelen om de gewenste concentratie te bereiken.
   OPMERKING: Het volume zal hetzelfde zijn als het oorspronkelijke volume van de nanodeeltjes als dezelfde concentratie wordt beoogd, maar dit zal voor elk experiment worden aangegeven.
2. Pipetteer voorzichtig tot volledige resuspensie en begeleid de vloeistof met de pipet.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen materiaal achterblijft op de wand van de injectieflacon.
3. Eenmaal opgelost, pipetteer krachtig op en neer, vermijd bubbels.
   OPMERKING: Het monster moet een transparant tot doorschijnend aspect hebben, dat duidelijker is bij hogere concentraties
4. Bewaar de monsters op ijs of bij 4 °C gedurende ten hoogste 24 uur na reconstitutie. Voorkom bevriezing.

5. Polyplex karakterisering

1. Dynamische lichtverstrooiing
   OPMERKING: Hydrodynamische diameter (nm), polydispersiteitsindex (PDI) en oppervlaktelading van nanodeeltjes werden gemeten bij 25 °C, 633 nm lasergolflengte en 173 ° signaaldetector, met behulp van een Zeta-potentiaalanalysator (zie Tabel met materialen).
   1. Hydrodynamische diameter (nm)
      1. Bereid de nanodeeltjes die mRNA en pBAE mengen grondig voor door het genmateriaal naar de polymeerfractie te pipetteren tot een uiteindelijke mRNAconcentratie van 0,25 mg/ml zoals hierboven beschreven (stap 2).
      2. Spoel een microcuvette voor met gefilterde verdunningsmedia om deze volledig te reinigen van onzuiverheden. Vul vervolgens de cuvette met ten minste 50 μL van de monsteroplossing en dop deze. Introduceer vervolgens het monster in het DLS-instrument en zorg ervoor dat de cel correct is ingebracht.
         OPMERKING: Het verdunningsmedium wordt gefilterd met een spuitfilter van 0,22 μm.
      3. Open het SOP-bestand (Standard Operation Procedure) dat is gemaakt en voer de gewenste voorbeeldnaam in. Selecteer Maatmeting.
         OPMERKING: Alle parameters voor het maken van een SOP voor maatmetingen zijn opgenomen in tabel 1.
      4. Voer de deeltjesgroottemeting uit met DLS door op Playte klikken.
         OPMERKING: Nadat de drievoudige pieptoon klinkt, is de analyse voltooid.
      5. Selecteer de resultaten die overeenkomen met het monster op het meetblad om de gemiddelde deeltjesgrootte, gemiddelde PDI, standaardafwijking en afbeeldingen te verkrijgen. Als u klaar bent, verwijdert u de cel uit DLS-apparatuur.
      6. Verwijder het monster, bewaar het voor zeta-potentiaalanalyse en reinig en spoel de cel met gedeïoniseerd water. Droog ten slotte de gereinigde cuvette onder een persluchtgasstroom.
   2. Oppervlaktelading (mV)
      1. Bereid de nanodeeltjes die mRNA en pBAE mengen grondig voor door het genmateriaal naar de polymeerfractie te pipetteren tot een uiteindelijke concentratie mRNA van 0,25 mg / ml zoals hierboven beschreven (stap 2, Polyplex-vorming). Vries vervolgens de oplossing in en droog deze.
         OPMERKING: In dit geval wordt voor de meting van de oppervlaktelading het vriesdrogen van het monster sterk aanbevolen voordat de maatregelen worden uitgevoerd om het monster opnieuw in de juiste buffer te verdelen, waarbij de lichaamscondities van pH- en elektrolytconcentratie worden gesimuleerd.
      2. Resuspend het gelyofiliseerde monster met behulp van water. Verdun het monster 1/10 in water (eindconcentratie 0,025 mg/ml).
      3. Spoel een wegwerp gevouwen capillaire cel (zeta potentiaal cuvette) voor met gefilterde verdunningsmedia om deze volledig te reinigen van onzuiverheden. Vul vervolgens de cuvette met verdunde nanodeeltjes met een spuit van 1 ml en dop beide zijden van de vulstoffen.
         OPMERKING: De nanodeeltjesdispersie moet het beschikbare volume in de cuvette (~ 1 ml) vullen, met speciale aandacht voor de vorming van de bel, die de metingen zou kunnen verstoren.
      4. Introduceer het monster in DLS; zorg ervoor dat de cel correct is ingebracht.
      5. Open het SOP-bestand dat is gemaakt voor zeta-potentiaalanalyse en introduceer de gewenste voorbeeldnaam. Selecteer Zeta-potentiaalmeting.
         OPMERKING: Parameters voor het maken van een SOP voor zeta potentiaalmetingen zijn weergegeven in tabel 2.
      6. Voer zeta-potentiaalmeting uit met DLS door op Playte klikken.
         OPMERKING: Na het drievoudige piepgeluid is de analyse voltooid.
      7. Selecteer de resultaten die overeenkomen met het monster op het meetblad om de gemiddelde zeta-potentiaal, standaarddeviatie en afbeeldingen te verkrijgen. Als u klaar bent, verwijdert u de cel uit de DLS-apparatuur.
      8. Verwijder het monster en bewaar het indien nodig. Reinig en spoel vervolgens de cuvettecel met gedeïoniseerd water, gevolgd door ethanol en opnieuw water. Droog ten slotte de gereinigde cuvette onder een persluchtgasstroom.
         OPMERKING: Gebruik de aanbevolen software om de gegevens te analyseren.
2. Nanoparticle Tracking Analyse (NTA)
   OPMERKING: Hydrodynamische diameter (nm) en concentratie van nanodeeltjes werden gemeten bij 25 °C, 488 nm lasergolflengte met behulp van een Nanoparticle Tracking Analyzer (zie Tabel met materialen).
   1. NTA en monstervoorbereiding
      1. Schakel de computer en de apparatuur in. Controleer eerst of alle componenten correct zijn aangesloten. Open vervolgens de aanbevolen software. De software controleert of alle accessoires correct zijn aangesloten.
      2. Sluit de bovenste plaat, hier, de O-ringcel, aan op de lasermodule.
         OPMERKING: Schroef dit onderdeel niet te veel.
      3. Laad de kamer eerst met buffer en/of gedeïoniseerd water met een spuit van 1 ml. Herhaal de procedure minstens twee keer. Vermijd het introduceren van bubbels in de kamer.
      4. Bereid het monster voor door 1/1000 in gedeïoniseerd water te verdunnen uit de concentratie die wordt gebruikt bij de DLS-maatmeting. Bereid ten minste 1 ml voor en laad het in een spuit van 1 ml, vermijd het inbrengen van bubbels.
      5. Laad de monsters in de kamer met behulp van een spuit. Sluit vervolgens de lasermodule aan op de grote NTA-kamer.
         OPMERKING: Grote kamer geeft de ruimte aan waar de kamer is geplaatst voor de meting.
   2. Beeldoptimalisatie
      1. Controleer eerst in de Hardwareof de camera en de juiste laser zijn geselecteerd.
         OPMERKING: Hier is er slechts één camera en de Blue Laser 488 nm.
      2. Begin met het cameraniveau op 0 en druk op Camera starten in het venster Vastleggen.
         OPMERKING: Pas op dit punt de volgende parameters aan. Balkpositie (deze kan op en neer worden bewogen op het scherm). Cameraniveau:vermijd oververzadigde pixels. Focus (lateraal wiel): probeer zo goed mogelijk scherp te stellen. Het is beter om deeltjes met een halo te hebben in plaats van ongerichte deeltjes. Concentratie: Pas de concentratie aan om tussen de 10 en 100 deeltjes per veld te hebben.
   3. Video-opname
      1. Ga in de software naar het venster Metingsselectie- SOP (linksonder) en selecteer Standaardmeting.
         OPMERKING: Programma om drie metingen van elk 30 s uit te voeren (om de software in staat te stellen gemiddelde en standaarddeviatieberekeningen uit te voeren). Geef een naam en een mappad op (op Basisbestandsnaam) om de records van het voorbeeld op te slaan. Wanneer de SOP-parameters correct zijn ingesteld, drukt u op Script maken en uitvoeren. Zodra de eerste replicatie is gemeten, zal het programma vragen om een nieuw monster toe te voegen. Vervolgens moet een ander deel van het monster in de kamer worden gebracht door op de zuiger van de spuit te drukken. Herhaal ten slotte een derde keer om de derde replicatie te analyseren.
   4. Videoverwerking
      1. Pas de schermversterking en detectiedrempel aan zodra de drie metingen zijn voltooid om de gemeten deeltjes te analyseren. Op dit moment moeten er ongeveer 100 deeltjes in elk frame verschijnen om de analyse uit te voeren (hoge rode kruisen en lage blauwe kruisen worden verwacht).
      2. Exporteer de resultaten in een pdf-bestand nadat de analyse is voltooid. Daarnaast is het mogelijk om te exporteren als video's en Excel-bestanden.
   5. Schoonmaken van de NTA
      OPMERKING: Sluit alle geopende metingen voordat u het volgende monster bestudeert; omdat de gegenereerde bestanden enorm zijn en afhankelijk van de computer, is het niet eenvoudig om er meer dan één open te houden.
      1. Reinig de NTA-kamer door herhaaldelijk water te spoelen voordat u de volgende meting uitvoert totdat er geen deeltjes worden waargenomen; spoel vervolgens de gebruikte buffer (PBS) door om door te gaan met de maatregelen.
      2. Spoel lucht in de kamer en droog het met papier van microscopische kwaliteit zodra de laatste meting van de dag is voltooid.
      3. Karakteriseer de grootte en vorm door Transmission Electronic Microscopy (TEM). Bereid de monsters voor. 30 μL van het uiteindelijke volume is voldoende voor TEM-karakterisering.
         OPMERKING: Zowel verse als gelyofiliseerde - na resuspensie - nanodeeltjes kunnen worden gemeten.
      4. Laat 10 μL monster vallen op een met koolstof gecoat koperen rooster. Laat het 10 min drogen. Verwijder de overtollige vloeistof, indien nodig, door zachtjes op filterpapier te tikken.
      5. Laat 10 μL uranylacetaat (2% w/v) oplossing vallen voor negatieve kleuring. Laat het 1 min drogen. Verwijder het overtollige vocht, indien nodig, door zachtjes op filterpapier te tikken.
      6. Introduceer het monster in de microscoop en scan (spanningswerking 80 kV).
         OPMERKING: Geschikte software kan worden gebruikt voor verdere analyse van de afbeeldingen.
3. Inkapselingsefficiëntie
   1. Monstervoorbereiding
      1. Bereid de nanodeeltjes voor op de gewenste concentratie en vries ze in en droog ze. Resuspend de nanodeeltjes vervolgens en verdun ze tot een eindconcentratie van 6 μg / ml.
      2. Bereid 1x TE buffer uit de 20x stock oplossing.
         OPMERKING: Vt (Totaal volume) = (aantal monsters x 100 μL x 4) (aantal monsters x 290 μL) + 2 ml.
      3. Bereid de TE-buffer met 3 μg/μL heparine uit de voorraad van 100 μg/μl.
         OPMERKING: Vt = Aantal monsters x 50 μL x 2.
      4. Bereid de normen voor
      5. Bereid een RNA-standaard voor variërend van 0,2 μg/ml tot 0,025 μg/ml in 1x Tris-EDTA (TE) buffer(tabel S1A).
         OPMERKING: Gebruik mRNA in de RNA-standaard voor het geval dat verschilt van het ribosomale RNA.
      6. Bereid RNA:pBAE standaard voor met Heparine(tabel S1B). Bereid heparine standaard (tabel S1C).
      7. Bereid een bord met 96 putten als volgt voor.
         1. Laad 295 μL TE-buffer in de eerste rijstrook van een 96-well plaat (evenals veel putten en monsters om te analyseren). Laad vervolgens 50 μL van 1x TE-buffer in de rijstroken B en C (duplicaten voor elk monster).
         2. Laad 50 μL 1x TBE-buffer met 3 μg/μL heparine in de rijstroken D en E (duplicaten voor elk monster). Laad vervolgens 100 μL van elke standaard in de rijstroken F, G en H (duplicaten voor elke standaard).
         3. Belasting 5 μL van elk monster in rijstrook A (concentratie in elke put is 0,1 μg/ml). Meng goed door te pipetteren en laad 50 μL van elk monster op de vier onderstaande putjes (twee met 50 μL buffer 1x TE en nog twee met 1x TE buffer met 3 μg/μL heparine).
      8. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 °C. Bereid RiboGreen-reagens volgens het protocol van de fabrikant (zie Tabel met materialen)in 1x TE-buffer.
         OPMERKING: Verdun 1:200 en vortex. Bescherm tegen licht. Vt = Aantal volle putten x 100 μL.
      9. Laad 100 μL RiboGreen-oplossing in elke put. Detecteer fluorescentie met behulp van de microplaatlezer met een excitatiegolflengte van 500 nm en een emissiegolflengte van 525 nm.
   2. Resultaten analyse
      1. De drie kalibratiecurven voorbereiden
         OPMERKING: Ten eerste, Ribosomale RNA-standaard. Interpoleer in deze kalibratiecurve de monsters die geen heparine bevatten. Ten tweede, mRNA:pBAE met Heparine. Interpoleer in deze kalibratiecurve het monster met heparine. Ten derde, Heparine. Wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de werkconcentratie in het lineaire bereik ligt.
      2. Bereken de inkapselingsefficiëntie (EE%) als volgt:
         

6. In vitro karakterisering

1. Fluorescentiemicroscopie voor kwalitatieve beoordeling
   1. Plaats de 96-well plaat op de microscoop na 24 uur transfectie. Begin met het visualiseren van cellen met het 10x-doel.
      OPMERKING: HeLa-cellen worden in dit geval gebruikt. Cellen worden gelokaliseerd met behulp van de transmissiemodus (helder veld) en de focus moet op dit moment worden aangepast.
      1. Pas eerst een witbalans toe om te verwijzen naar de software over de achtergrond van de voorbeelden. Verkrijg vervolgens een afbeelding om deze tijdens de analyse te bedekken met het fluorescentiebeeld.
   2. Verander de microscoopmodus in reflectiemodus (fluorescentie) en verplaats het filterwiel naar de blauwe laser (488 nm) om eGFP te visualiseren.
      OPMERKING: Op dit punt moeten de belichtingstijd en winst worden aangepast. Versterking moet worden aangepast in waarden tussen 3 en 5 om artefacten en overmaat aan achtergrondsignaal te voorkomen. De aanpassing van de belichtingstijd is afhankelijk van de transfectie-efficiëntie (van ms tot 1 s).
   3. Verkrijg afbeeldingen voor alle omstandigheden of putten met dezelfde belichtingstijd om alle monsters te vergelijken.
2. Flowcytometrie (FC) voor kwantitatieve beoordeling
   1. Gebruik een meerkanaalspipet om de 96-putplaat voor te bereiden op het flowcytometrie-experiment.
      OPMERKING: Wanneer u met semi-adherente cellen werkt, zoals in de JAWSII-cellijn, herstelt u al het mediavolume en slaat u het op in een andere 96-well-plaat. Streef niet naar dit medium, omdat het een aanzienlijk aantal getransfecteerde cellen kan bevatten.
   2. Reinig de cellen (HeLa-cellen worden hier gebruikt) met 100 μL /put van 1x PBS en streef ernaar. Voeg vervolgens 25 μL/put trypsine toe en incubeer het bij 37 °C gedurende 5 minuten.
   3. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u eerder herstelde media toe om de trypsine-actie te stoppen en de cellen te fixeren, waarbij 31,25 μL / put formaline 10% gedurende 20 minuten wordt toegevoegd (eindconcentratie 2,5%).
      OPMERKING: Op dit punt is het cruciaal om de toestand van de cellen te visualiseren door middel van microscopie om de loslating van de cellen te garanderen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om meerdere keren op en neer te pipetten om de cellen te helpen los te maken en hun agglomeratie te vermijden. Dit levert een betrouwbaar resultaat op.
   4. Schakel de flowcytometer en de software in. Stel in de software de juiste omstandigheden in voor het experiment (type plaat, monstervolume en andere parameters zoals schudden, spoelen tussen monsters.
      OPMERKING: Voor stap 6.2.5 moet het debiet 120 μL/min zijn. Meng elke 1 minuut een cyclus en spoel elke cyclus goed af. Mengen is essentieel om de cellen gedispergeerd te houden in de media en een betere analyse van individuele cellen mogelijk te maken. Bovendien is spoelen noodzakelijk om de microfluïdica van de cytometer tussen de monsters te reinigen. Controleer tot slot of er voldoende buffers zijn en of alle componenten correct zijn aangesloten.
   5. Stel de juiste parameters in om het percentage positief getransfecteerde cellen te kwantificeren.
      1. Bekijk eerst de stroomgegevens op (Forward scattered light) FSC versus SCC (Side scattered light) scatter plot om de cellen van het puin te onderscheiden. Vervolgens wordt een andere spreidingsgrafiek uitgezet waarin de amplitude (FSC-A) versus hoogte (FSC-H) wordt vergeleken om individuele cellen te gaten en te onderscheiden.
         OPMERKING: De onbehandelde populatie maakt het mogelijk om de populaties te gaten die overeenkomen met positief getransfecteerde cellen. Vervolgens wordt kwantificering van de positief getransfecteerde cellen uitgevoerd op het juiste kanaal op een histogramplot. Daarom moeten de positief getransfecteerde cellen worden weergegeven als een continuüm van gebeurtenissen op het histogram.

7. In vitro functionaliteitstests: capaciteit om modelimmuuncellen te activeren door ovalbumine (OVA) te gebruiken als antigeen modelmRNA

1. Plaat 10.000 cellen/put (JAWSII cellen worden hier gebruikt) in een 96-put plaat de dag voor transfectie.
   OPMERKING: Plaat zoveel putten als nodig is om drievoud te hebben voor elke aandoening. Laat de cellen zich minstens 12 uur aan de plaat hechten (een nachtelijke incubatie wordt aanbevolen).
2. Bereid pBAEs NP's voor zoals beschreven in de onderstaande OPMERKING om 0,6 μg mRNA per put te transfecteren.
   OPMERKING: Als een positieve controle, transfecteer de cellen met behulp van een transfectie reagens. Hier gebruikten we 0,1 μg mRNA per put en 0,25 μL van het transfectiereagens per put. mRNA-codificatie voor OVA werd gekocht (zie Tabel met materialen). Het is gepolyadenyleerd, gemodificeerd met 5-methoxyuridine en geoptimaliseerd voor zoogdiersystemen, en wordt beschermd door een end-capping met Cap1-structuur, een gepatenteerde methode van de leverancier.
3. Incubeer de 96-well plaat gedurende 24 uur in een droge luchtincubator bij 37 °C en 5% CO_2.
   OPMERKING: Streef na deze tijd niet naar de media, omdat deze een bepaald aantal cellen kunnen bevatten. Herstel de cellen en bewaar ze in een andere put of plaat.
4. Was de cellen die op de put achterblijven met 25 μL 1x PBS. Streef het vervolgens en voeg 25 μL trypsine toe en incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C om de cellen los te maken. Stop de trypsinereactie door de eerder herstelde media toe te voegen aan de correspondentput.
5. Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Streef naar de media. Voeg 50 μL/putje van een 1x PBS en 2,5% formaline toe. Incubeer het bij 4 °C gedurende 20 minuten om cellen te fixeren.
6. Herhaal stap 7.5 en 7.5.1. Voeg vervolgens 50 μL/put van 1x PBS en 3% BSA (Blocking buffer) toe en incubeer gedurende 30 min bij 4 °C. Herhaal nogmaals stap 7.5 en 7.5.1 en voeg vervolgens 50 μL/put van het primaire antilichaam (muis α-OVA) toe in 1x PBS en 3% BSA en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
7. Herhaal stap 7.5 en 7.5.1 en was de cellen vervolgens met 50 μL/putje van 1x PBS. Aspire media, en voeg vervolgens secundaire antilichamen oplossing (α-muis-AlexaFluor488/PerCP en Cy5.5-CD11b/APC-CD86) toe in 1x PBS en 3% BSA. Incubeer het gedurende 1 uur bij 4 °C.
8. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 400 x g. Was vervolgens de cellen met 50 μL/putje van 1x PBS. Vervolgens centrifugeren (400 x g gedurende 5 minuten), streven en vervolgens resuspend de cellen in 100 μL / put van 1x PBS en 2,5% formaline.
9. Analyseer het door flowcytometrie, zoals hierboven beschreven (stap 6.2).

Resultaten

Polymeersynthese en karakterisering
De OM-pBAE syntheseprocedure is weergegeven in figuur 2. Zoals figuur 2A laat zien, is de eerste stap om de OM-pBAE te verkrijgen het synthetiseren van de C6-pBAE door de amines (1-hexylamine en 5-amino-1-pentanol, verhouding 1:1) toe te voegen aan het diacrylaat (1,4-butaandioldilacrylaat). Deze reactie wordt uitgevoerd bij 90 °C gedurende 20 uur en met constant roeren. Daarna wordt een oplossing van oligo...

Discussie

Na de uitbraak van de Covid-19-pandemie vorig jaar heeft het belang van vaccins in termen van infectieziektebestrijding zich gemanifesteerd als een cruciaal onderdeel⁸. Inspanningen van wetenschappers over de hele wereld hebben de introductie op de markt van veel vaccins mogelijk gemaakt. Voor het eerst in de geschiedenis hebben mRNA-vaccins hun eerder veronderstelde succes aangetoond, dankzij hun snelle ontwerp vanwege hun vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan elk nieuw antigee...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,4-butanediol diacrylate	Sigma Aldrich	123048
1-hexylamine	Sigma Aldrich	219703
5-amino-1-pentanol	Sigma Aldrich	411744
Aceton	Panreac	141007
CD11b antilichaam	BD	550993
CD86 antilichaam	Bioligend	105007
Chloor hydroxhyde	Panreac	181023
Chloroform-d	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-His peptide	Ontores	Op maat
Cys-Lys-Lys-Lys peptide	Ontores	Op maat
D2O	Sigma Aldrich	151882
DEPC reagens voor Rnase-vrij water	Sigma Aldrich	D5758	Dit reagens is belangrijk om MilliQ-water te behandelen om alle RNases van de buffers te verwijderen
Diethyl ether	Panreac	212770
dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
mRNA EGFP	TriLink Technologies	L-7601
mRNA OVA	TriLink Technologies	L-7610
RiboGreen kit	ThermoFisher	R11490
natriumacetaat	Sigma Aldrich	71196
sucrose	Sigma Aldrich	S0389
Trifluorazijnzuur	Sigma Aldrich	302031
Trypsine-EDTA	Fisher Scientific	11570626
α-muis AlexaFluor488 antilichaam	Abcam	Ab450105
Apparatuur
Nanoparticle Tracking Analyzer	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Nucleaire magnetische resonantiespectrometer	Varian	400 MHz
ZetaSizer	Malvern Panalytical	Nano ZS	Voor zetapotentiaal en bepaling van hydrodynamische grootte
Software
NanoSight NTA-software	Malvern Panalytical	MAN0515-02-EN-00
NovoExpress-software	Agilent	Niet gespecificeerd
ZetaSizer-software	Malvern Panalytical	DTS-applicatie	Om oppervlaktelading en hydrodynamische grootten te analyseren