Verbeterde enzymbeschermingstest om staphylococcus aureus internalisatie en intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen te bestuderen

Summary

Dit protocol heeft tot doel te beschrijven hoe de mate van Staphylococcus aureus internalisatie en het vermogen om te overleven in de menselijke gastheercel kan worden bestudeerd, evenals de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen.

Abstract

Staphylococcus aureus drukt virulentiefactoren uit om de internalisatie in eukaryote cellen te activeren en te overleven in verschillende subcellulaire compartimenten. Dit artikel beschrijft een enzymbeschermingstest om de mate van S. aureus internalisatie en de intracellulaire overleving ervan in adherente niet-professionele fagocytische cellen (NPPCs) te bestuderen, evenals de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen. NPPCs worden gekweekt in een multi-well plaat totdat ze 100% confluentie bereiken. S. aureusculturen worden 's nachts gekweekt in celkweekmedium. De bacteriële suspensie wordt verdund volgens het aantal cellen per put om de cellen te enten bij een gecontroleerde veelheid van infectie. Geënt bloedcellen worden gedurende 2 uur geïncubeerd om de bacteriën te laten internaliseren door de NPPCs, waarna lysostapine wordt toegevoegd aan het kweekmedium om selectief extracellulaire bacteriën te doden. Lysostaphin is aanwezig in het kweekmedium voor de rest van het experiment.

Op dit punt kunnen de geïnfecteerde cellen worden geïncubeerd met antimicrobiële verbindingen om hun intracellulaire activiteiten tegen S. aureus te beoordelen. Vervolgens worden de cellen drie keer gewassen om de medicijnen te verwijderen en wordt de intracellulaire S. aureusbelasting vervolgens gekwantificeerd door te kweken op agarplaten. Als alternatief, voor het bestuderen van stafylokokken virulentiefactoren die betrokken zijn bij intracellulaire overleving en celtoxiciteit, kan lysostaphin worden geïnactiveerd met proteïnase K om de noodzaak van wasstappen te elimineren. Deze tip verbetert de betrouwbaarheid van de intracellulaire bacteriële belastingkwantificering, vooral als cellen de neiging hebben om los te komen van de kweekplaat wanneer ze zwaar geïnfecteerd raken vanwege de vermenigvuldiging van intracellulaire S. aureus. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met vrijwel alle soorten adherente NPPCs en met 3D-celkweekmodellen zoals organoïden.

Introduction

Staphylococcus aureus is zowel een levensbedreigende ziekteverwekker als een commensale bacterie van de huid en het slijmvlies die twee miljard mensen over de hele wereld koloniseert1. Bij mensen hebben nasale dragers van S. aureus een verhoogd risico op infectie met hun eigen stam van vervoer; de multifactoriële determinanten van S. aureus mucosale carriage zijn echter nog steeds ^{onduidelijk1,2}. Naast acute infecties kunnen patiënten ook chronische S. aureus-infecties ontwikkelen die vaak moeilijk te genezen ^zijn3. Een beter begrip van gastheer-pathogeen interacties tijdens kolonisatie en infectie is cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën en het verbeteren van het patiëntenbeheer.

In vitro kan S. aureus zijn internalisatie in gastheercellen activeren die de α5β1 ^integrin4 tot expressie brengen. De tripartiete interactie tussen de stafylokokken fibronectine-bindende eiwitten verankerd aan de celwand van S. aureus, de fibronectine en het β1-integrine tot expressie gebracht op het oppervlak van de gastheercel staat bekend als de belangrijkste route van S. aureus internalisatie in NPPCs zoals keratinocyten, osteoblasten, fibroblasten en epitheel- en endotheelcellen4. Recente studies tonen aan dat S. aureus kan worden gevonden in menselijke cellen tijdens nasale kolonisatie5,6 en ^infectie7. De rol van het intracellulaire reservoir in de pathogenese van S. aureus-infectie blijft echter onduidelijk. De gastheercellen zouden kunnen fungeren als een schuilplaats voor S. aureus, dat wordt beschermd tegen zowel het ^{immuunsysteem8} als de meeste antimicrobiële ^{verbindingen6,9}.

De lysostaphin-beschermingstest, beschreven door ^Proctor10 eerder in de jaren 1980, maakt de studie mogelijk van bacteriële en gastheerfactoren die betrokken zijn bij de internalisatie van S. aureus-isolaten . Lysostaphin is een bacteriocine geproduceerd door Staphylococcus simulans, die krachtige activiteit vertoont tegen bijna alle S. aureus-isolaten , inclusief antibioticaresistente ^stammen11. Lysostaphin is gebruikt om alleen extracellulaire S. aureus te vernietigen om het tellen van alleen levensvatbare intracellulaire bacteriën ^{mogelijk te maken12}. Deze techniek is veel gebruikt en heeft bijgedragen aan de ontdekking van verschillende virulentiefactoren van S. aureus. Gentamycine, alleen en in combinatie met lysostaphin, wordt ook veel gebruikt om intracellulaire bacteriën te bestuderen.

Een recente studie toonde echter aan dat gentamycine eukaryote cellen binnendringt en geïnternaliseerde bacteriën bereikt op een tijd- en concentratieafhankelijke ^manier13. Deze studie toonde ook aan dat lysostaphin geen eukaryote cellen binnendringt, wat bevestigt dat een op lysostaphin gebaseerde enzymbeschermingstest (EPA) de meest nauwkeurige test is voor het kwantificeren van intracellulaire S. aureusbelasting door ^cultuur13. Ongeacht welke verbinding wordt gebruikt om extracellulaire bacteriën te vernietigen (bijv. lysostaphin of gentamycine), moet het worden verwijderd door de cellen te wassen voordat intracellulaire S. aureus op agarplaten wordt geplateerd. Opeenvolgende wasbeurten kunnen resulteren in het loslaten van cellen, vooral slecht hechtende cellen (bijvoorbeeld zwaar geïnfecteerde cellen), wat zou leiden tot een onderschatting van de intracellulaire S. aureusbelasting . Dit artikel beschrijft in detail hoe EPA kan worden gebruikt om de intracellulaire S. aureusbelasting te kwantificeren en om de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen te meten met behulp van een in vitro model. Van belang is dat een eenvoudige methode is voorgesteld om de betrouwbaarheid van intracellulaire belastingkwantificering te verbeteren door intensieve wasbeurten te vermijden.

Protocol

1. Kweek van menselijke epitheelcellen

1. Bereid volledig kweekmedium met Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) hoge glucose met fenolrood, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) zonder antibiotica.
2. Kweek A549-epitheelcellen in volledig kweekmedium bij 36 ± 1 °C in 5% _CO2. Zorg ervoor dat u een kweekvat van de juiste grootte gebruikt om voldoende cellen te hebben voor de volgende stappen (zie stap 1.10).
   OPMERKING: Eén kolf van 75 ^cm2 (T-75) is voldoende om twee 24-well platen te zaaien en de cellen te subcultureren.
3. Bereid twee dagen voor infectie een enkele 24-well plaat voor.
4. Verwijder en gooi het gebruikte kweekmedium weg uit de T-75 kolf en was de cellen eenmaal met 10 ml Dulbecco′s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS).
5. Voeg 5 ml trypsine-EDTA toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 36 ± 1 °C in 5% _CO2.
6. Voeg 5 ml volledig kweekmedium toe en breng de cellen over in een buis.
7. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 × g.
8. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 10 ml vers volledig kweekmedium.
9. Tel de cellen met een automatische celteller (of een telkamer).
10. Verdun de cellen in het volledige kweekmedium om 30 ml celsuspensie te bereiden in een concentratie van 2,0 × ¹⁰⁵ cellen/ml.
11. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan elke put van een 24-putplaat, wat overeenkomt met een celdichtheid van ongeveer 1,0 × ¹⁰⁵ cel / cm² voor een putoppervlak van 2 cm².
12. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 36 ± 1 °C in 5% _CO2 totdat ze 100% samenvloeiing bereiken.
    OPMERKING: Naast de te testen omstandigheden moeten op de dag van infectie drie putjes worden gereserveerd voor het tellen van cellen (zie stap 3.1.4). Afhankelijk van het aantal te testen omstandigheden kunnen maximaal twee 24-putplaten tegelijkertijd worden bereid. De in het protocol aangegeven volumes moeten dienovereenkomstig worden verhoogd.

2. Kweek van S. aureus-stammen

1. Twee dagen voor infectie, bereid volledige infectie medium met DMEM hoge glucose zonder fenol rood, aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica.
2. Ontdooi S. aureus stammen te testen op agar platen.
3. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C.
4. Ent de dag voor de inenting één kolonie van de S. aureus-stam in om te worden getest in 10 ml volledig infectiemedium.
5. Incubeer de bacteriën gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C met schudden bij 160 tpm. Gebruik buizen van 50 ml die op 45° worden gehouden om te voorkomen dat de bacteriën bezinken.
   OPMERKING: Voordat u met een nieuwe stam begint, wordt aanbevolen om de gevoeligheid voor lysostaphin te verifiëren in dezelfde cultuuromstandigheden die zullen worden gebruikt voor verdere experimenten (media, bacteriële belastingen en lysostapineconcentratie en incubatietijd). Het is ook belangrijk om de bacteriële belasting te bepalen die overeenkomt met een _OD600nm van 0,5, omdat deze enigszins kan variëren van de ene stam tot de andere. Kweekomstandigheden van bacteriestammen kunnen worden aangepast aan het experimentele doel.

3. Infectietest met S. aureus

1. Bepaling van celdichtheid en levensvatbaarheid
   1. Verwijder en gooi het gebruikte kweekmedium weg uit de drie putten die zijn bestemd voor het tellen van A549-cellen.
   2. Voeg 1 ml volledig infectiemedium toe met 5 μg/ml Hoechst 33342 en 1 μg/ml propidiumjodide.
      OPMERKING: Hoechst 33342 is een bekend mutageen en moet met zorg worden behandeld. Propidiumjodide, een potentieel mutageen, moet met zorg worden behandeld en veilig worden verwijderd volgens de toepasselijke regelgeving.
   3. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 36 ± 1 °C in 5% _CO2.
   4. Tel het celnummer en bereken de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een wield-field fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: Als er geen fluorescentiemicroscoop beschikbaar is, kunnen de celdichtheid en levensvatbaarheid worden berekend met trypan blauwe kleuring met behulp van een celtelkamer.
2. Bereiding van de bacteriële suspensie
   1. Doseer 25 ml volledig infectiemedium in een buis en verwarm voor bij 36 ± 1 °C.
   2. Stel de S. aureus-suspensie in op _anOD600nm van 0,5 in volledig infectiemedium met behulp van een celdichtheidsmeter.
   3. Bereid 20 ml bacteriële suspensie voor celinenting voor door de 0,5 _{OD600 nm} in volledig infectiemedium te verdunnen om een multipliciteit van infectie (MOI) van 1 te bereiken, afhankelijk van het aantal cellen per put.
      OPMERKING: De MOI komt overeen met het aantal bacteriën dat per cel in elke put wordt toegevoegd. Om bijvoorbeeld een MOI van 1 met 1,0 × ¹⁰⁶ cellen per put te bereiken, bereidt u een bacteriële suspensie voor op 2,0 × ¹⁰⁶ KVE/ml, zodat ¹⁰⁶ KVE kan worden toegevoegd in een volume van 500 μL (zie stap 3.3.3). De MOI kan worden aangepast aan de te testen celtypen en bacteriestammen.
   4. Gebruik een automatische spiraalplater om de S. aureusbelasting van de verdunde bacteriële suspensie te bepalen die moet worden gebruikt voor de celinentingsstap.
   5. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C.
   6. Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de nauwkeurige MOI voor elke geteste stam te berekenen.
      OPMERKING: Als er geen automatische spiraalplater beschikbaar is, kan de bacteriële belasting worden bepaald door seriële verdunning op een agarplaat. Zie de bacteriologische analytische handleiding voor ^details14.
3. Celinenting
   1. Observeer elke put van de 24-putplaat door microscopie met lage vergroting om ervoor te zorgen dat de cellen gezond zijn en groeien zoals verwacht.
   2. Verwijder het gebruikte celkweekmedium van de 24-well plaat en gooi het weg.
   3. Voeg 500 μL van de bacteriële suspensie voor inenting toe aan elke put met 100% confluente cellen.
   4. Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij 36 ± 1 °C en 5% _CO2.
      OPMERKING: het wordt aanbevolen om drie putjes van de plaat te gebruiken voor elke te testen aandoening (drievoudig) en om ten minste drie onafhankelijke experimenten uit te voeren. De vertraging van incubatie kan worden aangepast aan het experimentele doel.
4. Kwantificering van intracellulaire bacteriën met verbeterde enzyme protection assay (iEPA)
   1. Bereid 7 ml 4x lysisbuffer met 3,5 ml 2% Triton X-100 in steriel water en 3,5 ml trypsine-EDTA.
   2. Bereid een lysostaphin stockoplossing van 10 mg /ml in acetaatbuffer en aliquot 25 μL in cryovialen. Bewaren bij -80 °C gedurende maximaal 6 maanden.
   3. Bereid 250 μL van een verse lysostaphin-werkoplossing bij 1 mg/ml door 25 μL van de lysostaphin-stamoplossing (10 mg/ml) en 225 μL van 0,1 M Tris-HCl te mengen. Bewaren bij 4 °C tot 48 uur.
   4. Bereid 6,25 ml volledig infectiemedium aangevuld met lysostaphin door 6 ml volledig infectiemedium toe te voegen aan 250 μL van de lysostaphin-werkoplossing.
   5. Voeg 250 μL volledig infectiemedium aangevuld met lysostapine toe aan elke put en roer de plaat voorzichtig door de plaat met de hand te draaien.
   6. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 36 ± 1 °C in 5% _CO2 om de lysostaphin de extracellulaire bacteriën te laten doden.
   7. Voeg aan het einde van de incubatietijd 10 μL proteïnase K bij 20 mg / ml toe aan elke put om de lysostaphin te inactiveren.
   8. Incubeer de cellen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
   9. Voeg 250 μL 4x lysisbuffer toe om de cellen te lyseren door osmotische shock.
   10. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 36 ± 1 °C.
   11. Meng grondig door tien keer op en neer te pipetteren over de bodem van de put om ervoor te zorgen dat de cellen volledig worden gelyseerd en gehomogeniseerd.
   12. Gebruik een automatische spiraalplater om de S. aureusbelasting van elke put te bepalen.
   13. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C.
   14. Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de intracellulaire S. aureusbelasting van elke put te berekenen.
5. Meting van de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen met enzyme protection assay (EPA)
   1. Bereid 25 ml 1x lysisbuffer met 3,125 ml 2% Triton X-100 in steriel water, 6,25 ml trypsine-EDTA en 15,625 ml steriel water.
   2. Bereid 250 μL van een verse lysostaphin-werkoplossing bij 1 mg/ml door 25 μL van een lysostaphin-stamoplossing (10 mg/ml) en 225 μL van 0,1 M Tris-HCl te mengen.
   3. Bereid 25 ml volledig infectiemedium aangevuld met lysostaphin door 24,75 ml volledig infectiemedium toe te voegen aan 250 μl van de lysostaphin-werkoplossing.
   4. Bereid voor elke antimicrobiële verbinding die moet worden getest 3,1 ml volledig infectiemedium, aangevuld met lysostapine en de antimicrobiële verbinding in de te onderzoeken concentratie.
   5. Verwijder het gebruikte celkweekmedium van de 24-well plaat en gooi het weg.
   6. Voeg 1 ml volledig infectiemedium toe, aangevuld met lysostapine.
   7. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 36 ± 1 °C in 5% _CO2 om de lysostaphin de extracellulaire bacteriën te laten doden.
   8. Verwijder en gooi het medium aangevuld met lysostaphin uit de 24-well plaat.
   9. Vul drie putjes met 1 ml medium aangevuld met lysostaphin plus de te testen antimicrobiële verbinding.
   10. Herhaal stap 3.5.9 voor elke antimicrobiële verbinding die moet worden getest.
   11. Vul voor de controleconditie drie putten met 1 ml medium aangevuld met lysostapine zonder antimicrobiële verbinding.
   12. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 36 ± 1 °C in 5% _CO2.
   13. Verwijder en gooi aan het einde van de incubatieperiode het gebruikte medium weg en was elke put voorzichtig driemaal met steriel DPBS met _CaCl2 en _MgCl2.
   14. Voeg 1 ml 1x lysisbuffer toe aan elke put om de cellen los te maken en te lyseren door osmotische shock.
   15. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 36 ± 1 °C.
   16. Meng grondig door tien keer op en neer te pipetteren over de put om ervoor te zorgen dat de cellen volledig worden gelyseerd en gehomogeniseerd.
   17. Gebruik een automatische spiraalplater om de S. aureusbelasting van elke put te bepalen.
   18. Incubeer de agarplaten gedurende 18-24 uur bij 36 ± 1 °C.
   19. Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de intracellulaire S. aureusbelasting van elke put te berekenen.
       OPMERKING: De intracellulaire activiteit van elke antimicrobiële verbinding moet worden berekend op basis van de bacteriële belasting van de controleconditie. Het is ook belangrijk om de cytotoxiciteit van alle antimicrobiële verbindingen te controleren om te bewijzen dat de waargenomen verschillen tussen de controle en de verbindingen niet te wijten zijn aan celdood.

Results

De resultaten van S. aureus internalisatie door A549 epitheelcellen zijn weergegeven in figuur 1A. A549-cellen werden geënt met S. aureus SF8300 WT en SF8300 ΔfnbA/B, die fibronectinebindende eiwitten A en B mist, bij een MOI van 1 gedurende 2 uur. Om extracellulaire S. aureus te vernietigen, werd lysostaphin aan het kweekmedium toegevoegd en werden de cellen gedurende 1 uur geïncubeerd. Vervolgens werd lysostaphin verwijderd door wassen voor EPA of geïnactiveerd met proteïnase K voor iEPA. Vervolgens werden de cellen verstoord in lysisbuffer en werd de bacteriële belasting gekwantificeerd door cultuur. Door epa te gebruiken, waren de gemiddelde intracellulaire belastingen respectievelijk 4,46 en 0,49 Log CFU /ml voor SF8300 WT en SF8300 ΔfnbA / B (figuur 1A, groene balken). Met behulp van iEPA waren de gemiddelde intracellulaire belastingen respectievelijk 4,53 en 0,56 Log CFU/ml voor SF8300 WT en SF8300 ΔfnbA/B (figuur 1A, rode balken). Het is interessant om op te merken dat zowel EPA als iEPA vergelijkbare resultaten vertoonden, wat kan worden verklaard door het gemak van het uitvoeren van de wasbeurten wanneer de cellen in goede conditie zijn en omdat de door S. aureus geïnduceerde cytotoxiciteit erg laag is in deze experimentele omgevingen (gegevens niet getoond).

De resultaten van intracellulaire activiteit van vancomycine, rifampicine en levofloxacine tegen S. aureus zijn weergegeven in figuur 1B. Om de intracellulaire activiteit van deze antibiotica te meten, werden HaCaT-cellen geënt met S. aureus ATCC 29213 bij een MOI van 1 gedurende 2 uur. De cellen werden gedurende 24 uur geïncubeerd met lysostapine, met of zonder de te testen antimicrobiële verbindingen. Vervolgens werden lysostaphin en de antimicrobiële verbindingen verwijderd door wassen. De cellen waren verstoord in lysisbuffer en de bacteriële belasting werd gekwantificeerd door cultuur. De gemiddelde intracellulaire belastingen waren respectievelijk 4,57, 4,51, 3,03 en 2,91 log CFU/ml voor controle, vancomycine (50 μg/ml), rifampicine (7 μg/ml) en levofloxacine (10 μg/ml) (figuur 1B).

Figuur 1: Intracellulaire Staphylococcus aureusbelasting in epitheelcellen. (A) Enzymbeschermingstest (groene balken) en verbeterde enzymbeschermingstest (rode staven) in A549-cellen geïnfecteerd met S. aureus SF8300 WT en ΔfnbA /B. (B) Intracellulaire activiteit van antimicrobiële verbindingen in HaCaT-cellen geïnfecteerd met S. aureus ATCC 29213. Staven vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten die in drievoud zijn uitgevoerd. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviaties. p < 0,0001. Afkortingen: Ctrl = control; kve = kolonievormende eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De hier beschreven testen zijn waardevol voor het bestuderen van de mate van internalisatie en de intracellulaire overleving van S. aureus in NPPCs, evenals de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen6,15,16. Sommige stappen in beide testprotocollen kunnen van cruciaal belang zijn. De gezondheidstoestand en de dichtheid van de cellen moeten perfect worden gecontroleerd en consistent zijn tussen onafhankelijke experimenten. Het bacteriële entmateriaal moet zorgvuldig worden gestandaardiseerd om een echte MOI te verkrijgen die dicht bij de beoogde theoretische MOI ligt. Over het algemeen moet ervoor worden gezorgd dat geen van de cellen wordt losgemaakt tijdens het pipetteren. De wasbeurten om lysostaphin en antibiotica te verwijderen zijn kritieke stappen in de EPA. Het gebruik van proteïnase K blijkt deze stap te verbeteren wanneer er geen antibioticum wordt gebruikt (zie hieronder). Last but not least moeten de cellen volledig worden losgemaakt in elke put en grondig worden gehomogeniseerd na de incubatie met de lysisbuffer om de intracellulaire belasting van S. aureus betrouwbaar te kwantificeren.

In sommige gevallen kunnen er problemen optreden en moeten eerst verschillende punten worden gecontroleerd. In geval van een gebrek aan reproduceerbaarheid moet er rekening mee worden gehouden dat S. aureus klonten kan vormen, waardoor kwantificering door absorptie onnauwkeurig wordt. Het klonteren van bacteriën kan worden verhoogd door centrifugerings- en wasstappen als het kweekmedium moet worden vervangen (bijvoorbeeld voor het elimineren van een uitgescheiden eiwit). De bacteriële suspensie moet snel worden gebruikt omdat bacteriën bij kamertemperatuur blijven groeien. De werkzaamheid van lysostapine kan afnemen als gevolg van onjuiste opslagomstandigheden, suboptimale pH voor enzymactiviteit in de kweekmedia, variabiliteit in de enzymatische activiteit tussen batches en providers en gebrek aan lysostapinegevoeligheid van sommige stammen in specifieke groeiomstandigheden. Fenolrood kan een licht bacteriostatisch effect hebben, vooral wanneer het kweekmedium relatief arm is aan voedingsstoffen in vergelijking met de typische bouillons die worden gebruikt voor het kweken van bacteriën. Het is dus raadzaam om een celkweekmedium zonder fenolrood te gebruiken, dat ook de microscopische waarnemingen van fluorescentie verbetert door het achtergrondgeluid te verminderen.

Hoewel deze methode een waardevol hulpmiddel is om het intracellulaire lot van verschillende stammen te bestuderen, moeten enkele grenzen van de methode worden overwogen. Het gebruik van een zeer hoge MOI kan het vermogen van internalisatie door NPPCs overbelasten en de verschillen tussen de verschillende geteste stammen nivelleren. De mate van internalisatie van de meest cytotoxische stammen kan worden onderschat omdat lysostaphin (of antibiotica) snel S. aureus vernietigt die wordt vrijgegeven door beschadigde cellen. Experimenten met langere duur (d.w.z. om intracellulaire overleving of intracellulaire activiteit van antibiotica te bestuderen) zijn dus gemakkelijker op te zetten met stammen met een lage cytotoxiciteit. Daarom moeten de incubatietijd en de MOI nauwkeurig worden aangepast aan de stamvirulentie, het celtype en het experimentele doel.

De hier beschreven methode met het gebruik van lysostaphin is betrouwbaarder dan die op basis van gentamicine omdat, in tegenstelling tot lysostaphin, gentamicine de neiging heeft om te worden geïnternaliseerd door ^{gastheercellen13}. Het andere voordeel is de mogelijkheid om de lysostaphin te inactiveren. Remming van de lysostapine-activiteit werd gemeld door Kim et ^al.13 met het gebruik van EDTA om zinkionen of 1,10-fenanthroline te cheleren; er zijn echter nog steeds intensieve wasbeurten nodig om het enzym te verwijderen voordat de bacteriën worden platgelegd. Hier maakt proteïnase K een snelle inactivatie van lysostaphin mogelijk. We zagen dat cellen de neiging hebben om los te komen van de kweekplaat wanneer ze zwaar geïnfecteerd raken vanwege de vermenigvuldiging van intracellulaire S. aureus. Door de laatste wasstap over te slaan, vereenvoudigde de iEPA-methode de technische behandeling aanzienlijk en maakte het herstel van de geïnternaliseerde bacteriën in losjes hechtende of reeds loszittende cellen mogelijk.

De meer geconcentreerde reagentia en buffers die in iEPA worden gebruikt, hielpen ook de pipetteerinspanning te verminderen en het verlies van cellen te minimaliseren. Bovendien kan iEPA worden gebruikt met cellen in suspensie, evenals met organoïden die moeilijk te wassen zijn. Kortom, enzymbeschermingstests maken de studie mogelijk van de mate van internalisatie en het intracellulaire lot van S. aureus, evenals de intracellulaire activiteit van antimicrobiële geneesmiddelen met verschillende in vitro modellen. Er moeten verbeteringen worden aangebracht om de relatie tussen internalisatie en cytotoxiciteit beter te karakteriseren om het belang van het ontwikkelen van geneesmiddelen die S. aureus in de cel kunnen bereiken, beter te begrijpen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	CORNING-FALCON	353047
A549 cell line	ATCC	CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6	Fluka	31048	Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin)	AMBI	LSPN-50	Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood	Biomerieux	43049	Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000	Biochrom Ltd.	80-3000-45	Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red	Sigma-Aldrich	D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red	Sigma-Aldrich	D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral dilute	Interscience	414000	Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum	Gibco	10270-106
HaCaT cell line	Cell lines service (CLS)	300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water	Fisher scientific	11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water	Invitrogen	P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL	Eurobio	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000	Interscience	438000	Automatic colony counter
Sterile water	OTEC	600500
T-75 culture flask	CORNING-FALCON	353136
TC20 Automated cell counter	Biorad	1450102	Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0	Invitrogen	AM9855G	Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsin - EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924	0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope	Nikon	Ti2