Productie van gehumaniseerde muis via transplantatie van thymus niercapsules, injectie van CD34+ -cellen en cytokinetoediening

Samenvatting

Gehumaniseerde muismodellen bieden een nauwkeurigere weergave van de menselijke immuunmicro-omgeving. Dit manuscript beschrijft het proces waarin deze modellen worden gemaakt door middel van een niertransplantaat van menselijke thymus, injectie van menselijke CD34⁺ -cellen en de gerichte toediening van menselijke cytokinetransgenen om de proliferatie en differentiatie van CD34⁺ -cellen te bevorderen.

Samenvatting

Diermodellen zorgen voor een essentiële vertaling tussen in vitro en in vivo biomedisch onderzoek. Gehumaniseerde muismodellen vormen een brug in de representatie van menselijke systemen, waardoor een nauwkeurigere studie van pathogenese, biomarkers en vele andere wetenschappelijke vragen mogelijk is. In deze beschreven methode worden immuundeficiënte NOD-scid IL2Rγnull (NSG)-muizen geïmplanteerd met autologe thymus, geïnjecteerd met van de lever afgeleide CD34⁺ -cellen, gevolgd door een reeks geïnjecteerde cytokineafgiften. In tegenstelling tot andere modellen van vergelijkbare aard, bevordert het hier beschreven model een verbeterde reconstitutie van immuuncellen door cytokines en groeifactoren af te leveren via transgenen die zijn gecodeerd in AAV8 of pMV101 DNA-gebaseerde vectoren. Bovendien biedt het stabiliteit op lange termijn met gereconstitueerde muizen met een gemiddelde levensduur van 30 weken na CD34⁺ -injecties. Door middel van dit model hopen we een stabiele en impactvolle methode te bieden voor het bestuderen van immunotherapie en ziekten bij de mens in een muizenmodel, en zo de noodzaak van voorspellende preklinische modellen aan te tonen.

Inleiding

Hoewel diermodellen een dieper begrip van cellulaire en moleculaire systemen hebben gecreëerd, blijft de uitdaging het ophelderen van de fijne kneepjes van soortspecifieke systemen, zoals immuniteit, fysiologie en andere gebieden van pathologie. Niet-menselijke primaten (NHP), zoals chimpansees, zijn van oudsher gebruikt om de ontbrekende hiaten in het modelonderzoek te compenseren; het NHP-model kan echter behoorlijk duur en ontoegankelijk zijn, vooral omdat het gebruik ervan in Europa¹ verboden is.

Na een succesvolle entprocedure repliceert het muizensysteem het menselijke immuunsysteem, zoals blijkt uit de herbevolking van de lymfoïde organen. De ontwikkeling van muizen met een functioneel humaan immuunsysteem biedt de mogelijkheid om translationeel onderzoek te doen naar de menselijke immuniteit in verschillende contexten. Immunodeficiënte muizen geënt met menselijke cellen en weefsels die met succes een operatief menselijk immuunsysteem kunnen repliceren, vergemakkelijken de studie van hematopoëse, immuniteit, gentherapie², infectieziekten³, kanker⁴ en regeneratieve geneeskunde⁵. Onze groep en enkele van onze medewerkers hebben resultaten gepubliceerd met behulp van dit model dat preklinische modellen van huidmelanoom⁶ demonstreert. Dit model is veelzijdig genoeg om te worden toegepast op talloze gebieden buiten de context van onderzoek naar melanoom en immunotherapie.

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) worden vaak gebruikt voor humanisering, omdat ze resulteren in een robuuste reconstitutie van T-cellen, die een gevestigde rol spelen bij immuuntolerantie; vanwege hun lage mate van zelfvernieuwing en hun hoge percentage rijpe, aan de afstamming gecommitteerde cellen, worden PBMC's echter vaak vervangen door producten op basis van menselijke stamcellen (HSC), die kunnen worden afgeleid van foetale lever⁷. In combinatie met deze afgeleide HSC-producten creëert de toevoeging van het implanteren van de menselijke thymus onder de niercapsules van NSG-muizen een systeem dat in staat is om de ontwikkeling van menselijke T-cellen te ondersteunen. Dit model, bekend als de beenmerg-lever-thymus (BLT), is zeer voordelig omdat het hematopoëse met meerdere afstamming, T-celeducatie in de autologe thymus en HLA-beperking⁸ mogelijk maakt.

Het model dat in dit manuscript wordt voorgesteld, is een aangepast BLT-model met extra cytokineafgifte. Van pro-inflammatoire cytokinen is aangetoond dat ze de capaciteiten van effector-immuuncellen versterken, met name door middel van op IL-15 gebaseerde immunotherapieën⁹. CD45⁺ -lymfocyten worden ongeveer 8-12 weken na injectie van menselijke CD34⁺ -cellen waargenomen in het perifere bloed van gehumaniseerde muizen (Hu-muizen), met een duidelijke toename van de reconstitutie in vergelijking met circulerend bloed van reguliere NSG-muizen. Door de Adeno-geassocieerde vector te gebruiken om menselijke IL-3, IL-7 en GM-CSF af te leveren, namen de niveaus van menselijke CD45⁺ -cellen in circulatie toe in vergelijking met muizen die de cytokines niet ontvangen. De toevoeging van de DNA Combo II-cytokines (SCF, FLT3, CKIT en THPO) verbetert de differentiatie van T-cellen en myeloïde cellen¹⁰. De toevoeging van cytokineafgifte onderscheidt deze methode van de andere Hu-mice-modellen, zoals wordt ondersteund door gepubliceerde gegevens¹⁰.

De ontwikkeling van dit model met een aangeboren en adaptieve menselijke immuunrespons heeft het mogelijk gemaakt om gegevens te publiceren over therapieresistentie en de micro-omgeving van de tumor¹⁰. Op voorwaarde dat laboratoria toegang hebben tot weefselmonsters om deze methode te gebruiken; dit Hu-mice-model heeft een groot potentieel voor andere laboratoria om vergelijkbare gebieden te bestuderen en uit te breiden naar andere gebieden van immunotherapie en preklinische studies.

Protocol

Alle protocollen met betrekking tot het gebruik van dieren worden nauwlettend gevolgd door het Institutional Animal Care and User Committee (IACUC) van het Wistar Institute. Het laboratorium houdt zich aan de richtlijnen van deze commissie en de behandelende dierenarts om de gezondheid, veiligheid en het welzijn van de betrokken dieren te waarborgen. Voorafgaand aan het volgen van dit protocol is goedkeuring van een dierenarts en IACUC vereist, en individuen kunnen variaties hebben in de specifieke chirurgische technieken en omgang met dieren in vergelijking met het protocol volgens het advies van de bovengenoemde partijen die betrokken zijn bij dierenwelzijn.

OPMERKING: Weefselmonsters kunnen worden ingevroren tot ze klaar zijn voor gebruik. Bovendien kan CD34⁺ -isolatie dezelfde dag of de volgende dag worden uitgevoerd als de niertransplantaatoperatie. Aan de hand van deze informatie wordt meegedeeld wanneer Busulfan zal worden geïnjecteerd: als u van plan bent een operatie uit te voeren op dezelfde dag als de isolatie, moet Busulfan preventief worden geïnjecteerd ter voorbereiding op het ontvangen van weefsel. Behandel dertig vrouwelijke NSG-muizen van 5-7 weken oud met 30 mg/kg (100 μL, PBS 1x) van een vers gemaakt myelo-depletend medicijn; Busulfan injecteerde IP 24 uur voor de operatie.

1. CD34⁺ cellen isolatie

1. Bereid de digestieoplossing voor door 100 mg Collagenase/Dispase op te lossen in 50 ml RPMI1640. Gebruik een vacuümfilter van 0,22 μm om de digestieoplossing te steriliseren.
2. Foetale lever (>20 weken oud) wordt geleverd in 50 ml RPMI1640 medium. Zuig de media op en gooi ze weg, zodat er 10 ml in de buis met de lever zit.
3. Was de tissue twee keer met 45 ml RPMI1640 + 100 μg/ml van het antibioticum Primocin in een conische tube van 50 ml, waarbij u het medium tussen elke wasbeurt opzuigt. Zorg ervoor dat het weefsel op de bodem van de buis zakt voordat u het medium opzuigt.
4. Plaats een steriele weefselzeef in een steriel bekerglas van 200 ml.
5. Giet de foetale lever door de zeef en gebruik het uiteinde van een steriele plastic spuit van 10 ml om het weefsel te vermalen.
6. Spoel de levercellen die in de zeef achterblijven met 50 ml RPMI1640 + 100 μg/ml van het antibioticum Primocine, gevolgd door 50 ml RPMI1640 collagenase/dispase-media (2 mg/ml). Het bekerglas van 200 ml bevat nu de RPMI1640 met Primocine, RPMI1640 collagenase/dispase en gehomogeniseerde lever.
7. Verdeel het mengsel in vier conische buizen van 50 ml en incubeer ze gedurende 1 uur in een waterbad (37 °C). Schud de conische buizen elke 15 min.
8. Voeg 15 ml Ficoll toe in vier conische tubes van 50 ml.
9. Leg de gehomogeniseerde leveroplossing er voorzichtig op en verdeel ongeveer 35 ml over elke buis. Verstoor de interface niet.
10. Plaats de buizen in de centrifuge en draai gedurende 1 uur op 800 x g met minimale acceleratie/rem.
11. Haal de buisjes uit de centrifuge en verzamel de cellen van de interface (10-15 ml) in twee conische buisjes van 50 ml.
12. Voeg PBS 1x tot 50 ml toe om de pellet te wassen en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten. Gooi het bovenstaande weg.
13. Resuspendeer de pellet in 10 ml ACK (ammoniumchloride-kalium) lysisbuffer en incubeer gedurende 5-10 minuten. Vul de tube met 1x PBS.
14. Tel de cellen handmatig onder de microscoop met behulp van trypan blue en een hemocytometer. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 min.
    OPMERKING: De mononucleaire levercellen kunnen desgewenst direct van hieruit worden geïnjecteerd, bijvoorbeeld als het celgetal lager is dan 50 miljoen cellen.
15. Vacuüm de PBS af en suspendeer de celpellet opnieuw in 300 μL van de scheidingsbuffer (2 mM EDTA, 5 μg/ml BSA in 1x PBS) voor 100 x 10⁶ cellen of minder. Gebruik voor meer dan 100 x 10⁶ cellen een verhouding op basis van de bovenstaande hoeveelheid cellen om de hoeveelheid buffer te bepalen (d.w.z. dubbel de cellen, verdubbel de buffer).
16. Voeg 100 μL FcR-blokkerend reagens toe en incubeer 2-5 min.
17. Voeg 100 μL CD34-microbead-antilichamen toe, meng goed en incubeer 30 minuten op ijs; Mechanisch met de hand schudden na 15 min.
18. Voeg 7-10 ml van de scheidingsbuffer toe en filtreer door 100 μm, 70 μm en 40 μm celzeven in die volgorde.
19. Plaats een celscheider op basis van kolommen in een magnetische scheider. Plaats een conische buis van 15 ml onder de separator om de doorstroming en buffer op te vangen.
20. Vul de kolom met 500 μL van de scheidingsbuffer.
21. Giet de celsuspensie door de kolom.
22. Vul de kolom met de doorstroming en buffer die in de conische buis is opgevangen.
23. Was de kolom 3 keer met 500 μL van de scheidingsbuffer.
24. Gooi de doorstroom weg en vervang de buis door een buis van 15 ml polystyreen.
25. Vul de kolom met 1 ml van de scheidingsbuffer, verwijder de kolom uit de magneet en spoel de plunjer in één druk naar beneden.
26. Tel de cellen en resusinfecteer in 1x PBS voor injectie. Leg op ijs tot gebruik.

2. Verwerking van de thymus

1. Was de autologe thymus (>20 weken oud) door 5-8 ml RPMI1640 toe te voegen, laat het weefsel bezinken. Verwijder het medium voorzichtig door vacuüm te zuigen en vermijd contact met de thymus. Herhaal dit nog een keer.
2. Suspendeer in 10 ml kamertemperatuur RPMI1640 met Primocin (100 μg/ml).
3. Breng de thymus over naar een met weefsel behandeld petrischaaltje. Zorg ervoor dat de thymus volledig bedekt is met Primocin-media.
4. Incubeer gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur.
5. Stofzuig de Primocin-media eraf. Was de thymus met 5-8 ml RPMI1640, verwijder het medium door vacuüm te verwijderen en herhaal dit nog een keer.
6. Suspendeer de thymus in 5-8 ml RPMI1640.
7. Bereid de geïncubeerde thymus voor op het enten door segmenten van 1 mm x 2 mm te snijden met behulp van twee scalpels.
   LET OP: Dit wordt geënt op de muizen; zorg er daarom voor dat de plakjes thymus relatief gemakkelijk zowel in als uit de spuit en de bijgevoegde 22 G Hamilton-naald kunnen worden gezogen.

3. Subrenale capsuletransplantatie en injectie van CD34-cellen

1. Onderzoek de muizen voor de operatie op hun algemene gezondheid. Scheer de muizen om een gebied (ongeveer 3 "x 2") op het linker zijlichaam bloot te leggen.
2. Verdoof de muizen via isofluraan (inductie 5%, onderhoud 2%-3%) in de kamer en breng vervolgens individuele muizen over van de kamer naar een chirurgisch stadium met een neuskegel.
3. Ontsmet het geschoren gebied met chloorhexidine en alcoholdoekjes. Zorg voor individuele verdoving via een knijptest.
4. Maak een grote incisie (5-7 mm) naar achteren, lateraal van de ruggengraat van de muis, en vouw de huid terug.
5. Zorg ervoor dat op dit punt de milt zichtbaar is onder de fascia. Maak een kleinere incisie van ~2 mm in de fascia. Zorg ervoor dat de incisie zo klein mogelijk is en dat de nier volledig kan worden blootgesteld.
6. Bepaal de locatie van deze incisie, identificeer de milt visueel en gebruik deze als een markering voor de nier, die niet zichtbaar is.
   OPMERKING: De nier van de muis bevindt zich achter een groep vet in het noordoostelijke kwadrant van de milt.
7. Plaats vanaf hier de hand (chirurg) onder de zijkant van de muis tegenover de incisie en duw om de nier bloot te leggen. Verplaats al het vet om de nier volledig bloot te leggen.
8. Gebruik de vingers van dezelfde hand om de blootgestelde nier te stabiliseren. Gebruik indien nodig steriel 1x PBS om de blootliggende nier te smeren.
   OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat de chirurg andere vingers moet gebruiken dan die welke de zijkant van de muis hebben gehanteerd om de nier vast te houden om de steriliteit te behouden. Overleg met de dierenarts van het instituut over het juiste onderhoud van de steriliteit.
9. Laat de assistent tegelijkertijd een stompe spuit klaarmaken met het foetale thymusweefsel. Zuig voorzichtig 2-3 middelgrote stukjes thymus (1 mm x 2 mm) met een minimum aan media op tot aan de punt van de naald en geef deze vervolgens aan de chirurg om de procedure uit te voeren.
   OPMERKING: Het aantal stukjes thymus is afhankelijk van de grootte van het weefsel, meestal zijn 2 stukjes voldoende om gehumaniseerde muizen te krijgen.
10. Laat de chirurg de naald door het caudale uiteinde van het nierkapsel steken totdat het distale uiteinde is bereikt (~2 mm), tot het punt waar de naald zichtbaar is, maar deze breekt niet door de schedelzijde van het nierkapsel. Laat de assistent de spuit dompelen.
11. Plaats de nier, samen met eventueel blootliggend vet, terug in het buikvlies. Plaats een resorbeerbare hechtdraad (maat 4) en sluit de oppervlakkige incisie af met een dierenartslijm.
12. Postoperatief een dosis van het pijnstillende geneesmiddel, 25 μl buprenorfine met verlengde afgifte (1 mg/ml) toedienen via subcutane injectie (1 mg/kg).
13. Controleer of de muizen binnen 5 minuten na de operatie beginnen te herstellen.
14. Verwissel tussen de kooien de handschoenen en steriliseer de instrumenten in een sterilisator met glazen kralen.
15. Injecteer 1-3 uur na de operatie 100 μL menselijke CD34⁺ -cellen (ongeveer 100.000 cellen) in de muis door middel van intraveneuze (IV) injectie.
16. Voer een algemene gezondheidscontrole uit op de muizen na het beëindigen van de operatie (meestal 2 uur na de eerste kooi), daarna 24 uur en 48 uur daarna.
17. Als er afwijkingen in de dispositie of vitale functies zijn, controleer de muizen dan verder. Zodra ze die controlepunten hebben gewist, houd je de muizen minder streng in de gaten (2x-3x per week).
18. Een week na de operatie worden de muizen geïnjecteerd (IV) met 100 μL AAV8 humaan cytokine (IL-3, IL-7 en GM-CSF; 2 x 10⁹ genoomkopieën/ml).
19. Voer twee weken na de operatie IM-injecties van het plasmide DNA Combo II uit.
    1. Gebruik een elektroporatiemachine om IM-injecties van plasmide-DNA Combo II uit te voeren: SCF, FLT3, CKIT en THPO. Combineer voor elke muis 25 μl SCF (2 mg/ml), 25 μl THPO (2 mg/ml), 25 μl FLT3 (2 mg/ml) en 25 μl CKIT (10 mg/ml).
    2. Voer één injectie per achterbeen uit, d.w.z. twee in totaal, met 50 μl per poot, gevolgd door elektroporatie op elke injectieplaats.

Resultaten

Na een succesvolle operatie en geschikte postoperatieve injecties kan CD34⁺ -differentiatie worden bevestigd via flowcytometrie. Ongeveer 8 weken na de operatie worden muizen uitgebloed ter voorbereiding op FACS, waarbij ze elke 2 weken terugkeren totdat een specifieke drempel van menselijke immuuncellen is bereikt, zoals eerder beschreven¹⁰. In het kort werd 100 ml bloed verzameld in bloedafnamebuisjes bedekt met lithium en heparine. Na de lysis van ro...

Discussie

Dit manuscript beschrijft hierin het genereren van gehumaniseerde muizen via menselijke foetale thymus geënt onder het nierkapsel en de daaropvolgende CD34⁺ -injectie om een menselijk immuunsysteem na te bootsen.

Hoewel het protocol functioneert om het best mogelijke model te creëren, zijn bepaalde stappen essentieel voor de levensvatbaarheid. Tijdens de CD34⁺ -isolatie is het bijvoorbeeld essentieel dat men door de microscoop kijkt CD34<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ACK lysis buffer	Life Technologies Corporation
BD Microcontainer	BD		bloedopnamebuisjes
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Bestraling geneesmiddel; licht gevoelig
CD34 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-046-702	antilichaam kralen kit; bewaard bij 4 °C
CKIT	Aldevron	aangepast	cytokine; bewaard bij -20 °C
Collagenase/Dispase	Roche Diagnostics	11097113001	Bewaard bij 4 °C
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	130-046-702	antilichaam kralen kit; bewaard bij 4 °C
Foetaal weefsel (lever en thymus)	Advanced Bioscience Resources		Wordt dezelfde dag of 's nachts geleverd
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Bewaard bij kamertemperatuur
FLT3	Aldevron	125964	cytokine; bewaard bij -20 °C
Pincetten	Verschillend	Verschillend
Hamilton-spruitspuitnaald	Verschillend	Verschillend	22 G; 3 punts; 2" lengte
Hemostaten	Verschillend	Verschillend
MS kolommen	Miltenyi Biotec	130-042-201	magnetische separator
PBS	Gibco	14190-136	Bewaard bij kamertemperatuur
Primocin	Invivogen	amt-pm1	antibioticum; bewaard bij 4 °C
RPMI	Corning	10-040-CM	Bewaard bij 4 °C
SCF	Aldevron	125962	cytokine; bewaard bij -20 °C
Chirurgische schaar	Verschillend	Verschillend
THPO	Aldevron	125963	cytokine; bewaard bij -20 °C
In tissue treated petrischaal	Corning	430167
VetBond lijm	3M	1469SB	lijm
Visorb naald	Stoelting Co	5046	Absorbeerbare naald, maat 4, 19 mm snijden