Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

Samenvatting

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Samenvatting

Het verlies van functie van melanocyten leidt tot vitiligo, dat de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Momenteel is er geen effectieve langetermijnbehandeling voor vitiligo. Daarom is het noodzakelijk om een handige en effectieve behandeling voor vitiligo te ontwikkelen. Regeneratieve geneeskunde technologie voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten lijkt een veelbelovende nieuwe behandeling van vitiligo. Dit omvat de directe herprogrammering van de huidcellen van de patiënt in functionele melanocyten om het verlies van melanocyten bij patiënten met vitiligo te helpen verbeteren. Deze methode moet echter eerst op muizen worden getest. Hoewel directe herprogrammering veel wordt gebruikt, is er geen duidelijk protocol voor directe herprogrammering in melanocyten. Bovendien is het aantal beschikbare transcriptiefactoren overweldigend.

Hier wordt een geconcentreerd lentivirus-verpakkingssysteemprotocol gepresenteerd om transcriptiefactoren te produceren die zijn geselecteerd voor het herprogrammeren van huidcellen naar melanocyten, waaronder Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 en Snai2. Muis embryonale fibroblasten (MEF's) werden geïnfecteerd met het geconcentreerde lentivirus voor al deze transcriptiefactoren voor de directe herprogrammering van de MEF's in geïnduceerde melanocyten (iMels) in vitro. Bovendien werden deze transcriptiefactoren gescreend en werd het systeem geoptimaliseerd voor directe herprogrammering naar melanocyten. De expressie van de karakteristieke markers van melanine in iMels op gen- of eiwitniveau was significant verhoogd. Deze resultaten suggereren dat directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten een succesvolle nieuwe therapeutische strategie voor vitiligo zou kunnen zijn en het mechanisme van melanocytenontwikkeling zou kunnen bevestigen, wat de basis zal vormen voor verdere directe herprogrammering van fibroblasten in melanocyten in vivo.

Inleiding

Vitiligo is een huidziekte die de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Om verschillende redenen, waaronder metabole afwijkingen, oxidatieve stress, generatie van ontstekingsmediatoren, celloslating en auto-immuunrespons, gaan de functionele melanocyten verloren en wordt de afscheiding van melanine gestopt, wat leidt tot de ontwikkeling van vitiligo ^1,2. Deze aandoening komt veel voor en is bijzonder problematisch op het gezicht. De belangrijkste behandeling is het systemisch gebruik van corticosteroïden en immunomodulatoren. Fototherapie kan worden gebruikt voor systemisc....

Protocol

Dit werk werd goedgekeurd door het Laboratory Animal Management and Use Committee aan de Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). De experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de normen die zijn vastgesteld door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Er waren geen experimenten met mensen, dus dit werk had geen goedkeuring nodig van de ethische commissie voor menselijk onderzoek. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie over reagentia.

1. Bouw van een geconcentreerd lentivirusverpakkingssysteem voor transcriptiefact....

Resultaten

Dit artikel bevat de protocollen van een geconcentreerd lentivirusverpakkingssysteem om lentivirus van transcriptiefactoren te produceren voor directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten en protocollen voor screening op transcriptiefactoren en directe herprogrammering van melanocyten uit MEFs.

Het succes van geconcentreerde lentivirusproductie werd geëvalueerd door de fluorescentie-intensiteit van GFP (figuur 1A) of door flowcytometrie (

Discussie

De kwaliteit van het virus is cruciaal voor het succes van directe herprogrammering naar melanocyten in dit protocol. De methode voor het verpakken en concentreren van virussen in dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk te herhalen en is niet afhankelijk van een ander hulpgeconcentreerd reagens. Dit protocol kan in de meeste laboratoria met succes worden gevolgd. Om de kwaliteit van het geconcentreerde virus te waarborgen, hebben de volgende punten speciale aandacht nodig. Een daarvan is de celstatus van HEK-293T. Hoewe.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Opgeslagen bij -20 °C
0,45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyreen ronde bodembuis	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Opgeslagen bij RT
Adenine	Sigma	A2786	Voorradconcentratie 40 mg/mL Eindconcentratie 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Geit anti-Muis IgG2a	Invitrogen	A21137	Verdunning van 1:500 te gebruiken
Antibiotica(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Opgeslagen bij -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antilichaam	Millipore	MABC592	Gastheer/Isotype: Muis IgG2a Soortreektie: Muis/Mens Verdunning van 1:200 te gebruiken
Anti-TRP2/DCT Antilichaam	Abcam	ab74073	Gastheer/Isotype: Konijn IgG Soortreektie: Muis/Mens Verdunning van 1:200 te gebruiken
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Voorradconcentratie 10 mM Eindconcentratie 3 μM
Cholera toxine	Sigma	C8052	Voorradconcentratie 0,3 mg/mL Eindconcentratie 20 pM
Cy3 Geit anti-Konijn IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Verdunning van 1:500 te gebruiken
DMEM (Hoge glucose)	HyClone	SH30243.01	Opgeslagen bij 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Opgeslagen bij RT
FBS	Gibco	10270-106	Opgeslagen bij -20 °C Voor gebruik verwarmd ingeactiveerd
Gelatine	Sigma	G9391	Opgeslagen bij RT
GFP-PURO plasmiden (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 en Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Opgeslagen bij -20 °C
Hematoxyline	Abcam	ab220365	Opgeslagen bij RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Voorradconcentratie 100 μM Eindconcentratie 0,1 μM
Hydrocortison	Sigma	H0888	Voorradconcentratie 100 µg/mL Eindconcentratie 0,5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Opgeslagen bij RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfectiereagens, opgeslagen bij 4 °C
Masson-Fontana kleuringskit	Solarbio	G2032	Opgeslagen bij 4 °C
Neutrale balsem	Solarbio	G8590	Opgeslagen bij 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Opgeslagen bij RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Opgeslagen bij RT
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (TPA)	Sigma	P8139	Voorradconcentratie 1 mM Eindconcentratie 200 nM
Polybreen	Sigma	H9268	kationisch polymere transfectiereagens; Voorraadconcentratie 8 μg/µL Eindconcentratie 4 ng/µL
Puromycine	Gibco	A11138-03	Opgeslagen bij -20 °C
Recombinant humaan bFGF	Invitrogen	13256-029	Voorraadconcentratie 4 μg/mL Eindconcentratie 10 ng/mL
Recombinant humaan insuline	Sigma	I3536	Voorraadconcentratie 10 mg/mL Eindconcentratie 5 µg/mL
Recombinant humaan SCF	R&D	255-SC-010	Voorraadconcentratie 200 μg/mL Eindconcentratie 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Opgeslagen bij 4 °C
XYleen	Sigma	1330-20-7	Opgeslagen bij RT