Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tijd-opgeloste Förster Resonantie Energie Transfer Assays voor meting van endogene gefosforyleerde STAT-eiwitten in menselijke cellen

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62915

⸱

9 september 2021

 ,  , 
1BioAuxilium Research

In dit artikel

Samenvatting

Tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht cel-gebaseerde assay protocollen worden beschreven voor de eenvoudige, specifieke, gevoelige en robuuste kwantificering van endogene gefosforyleerde signaal transducer en activator van transcriptie (STAT) 1/3/4/5/6 eiwitten in cellysaten in een 384-well formaat.

Samenvatting

De Janus kinase (JAK)/signaaltransducer en activator of transcription (STAT) signaleringsroute speelt een cruciale rol bij het bemiddelen van cellulaire reacties op cytokines en groeifactoren. STAT-eiwitten worden geactiveerd door tyrosinefosforylering die voornamelijk wordt gemedieerd door JAKs. De abnormale activering van STAT-signaalroutes is betrokken bij veel menselijke ziekten, met name kanker en immuungerelateerde aandoeningen. Daarom is het vermogen om STAT-eiwitfosforylatie binnen de inheemse celsignaleringsomgeving te volgen belangrijk voor zowel academisch als geneesmiddelenontdekkingsonderzoek. De traditionele assayformaten die beschikbaar zijn om gefosforyleerde STAT-eiwitten te kwantificeren, omvatten western blotting en de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Deze heterogene methoden zijn arbeidsintensief, low-throughput en vaak niet betrouwbaar (specifiek) in het geval van western blotting. Homogene (no-wash) methoden zijn beschikbaar, maar blijven duur.

Hier worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor de gevoelige, robuuste en kosteneffectieve meting in een 384-well-formaat van endogene niveaus van gefosforyleerde STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) en STAT6 (Y641) in cellysaten van adherente of suspensiecellen met behulp van het nieuwe THUNDER time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET) -platform. De workflow voor de cellulaire test is eenvoudig, snel en ontworpen voor high-throughput screening (HTS). Het testprotocol is flexibel, maakt gebruik van een monster met een laag volume (15 μL), vereist slechts één reagenstoevoegingsstap en kan worden aangepast aan toepassingen met een lage doorvoer en een hoge doorvoer. Elke fosfo-STAT sandwich immunoassay wordt gevalideerd onder geoptimaliseerde omstandigheden met bekende agonisten en remmers en genereert de verwachte farmacologie en Z'-factor waarden. Omdat TR-FRET-assays ratiometrisch zijn en geen wasstappen vereisen, bieden ze een veel betere reproduceerbaarheid dan traditionele benaderingen. Samen biedt deze reeks assays nieuwe kosteneffectieve hulpmiddelen voor een uitgebreidere analyse van specifieke gefosforyleerde STAT-eiwitten na celbehandeling en de screening en karakterisering van specifieke en selectieve modulatoren van de JAK / STAT-signaleringsroute.

Inleiding

De JAK/STAT-signaleringsroute speelt een sleutelrol bij het bemiddelen van cellulaire reacties op diverse cytokines, interferonen, groeifactoren en gerelateerde moleculen1,2. De binding van deze liganden aan specifieke celoppervlakreceptoren resulteert in de activering van JAKs, die op hun beurt STAT-eiwitten activeren door fosforylering van specifieke tyrosineresiduen. STAT-fosforylering resulteert in hun dimerisatie en translocatie in de kern, waar ze hun effect uitoefenen op de transcriptie van gereguleerde doelgenen. De STAT-familie bestaat uit zeven leden: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b en STAT6. De leden spelen een complexe en essentiële rol in de regulatie van fysiologische celprocessen, waaronder proliferatie, differentiatie, apoptose, angiogenese en regulatie van het immuunsysteem. De abnormale activering van STAT-signaalroutes is betrokken bij veel menselijke ziekten, met name kanker en immuungerelateerde aandoeningen3,4. Daarom is het vermogen om STAT-eiwitfosforylatie binnen de inheemse celsignaleringsomgeving te beoordelen belangrijk voor zowel academisch als geneesmiddelenontdekkingsonderzoek.

Tot op heden zijn de conventionele methoden die worden gebruikt om intracellulaire gefosforyleerde eiwitniveaus te meten, inclusief STATs, gebaseerd op antilichamen en omvatten western blotting, ELISA en fosfoflowcytometrie. Deze heterogene methoden zijn arbeidsintensief, tijdrovend, foutgevoelig, lage doorvoer en vaak onbetrouwbaar (bijv. Specificiteitsproblemen) in het geval van western blotting5. Homogene assays vereisen daarentegen minder experimentele stappen, gebruiken kleinere steekproefvolumes en zijn vatbaar voor HTS. Er zijn vijf homogene celgebaseerde immunoassayplatforms in de handel beschikbaar die kunnen worden gebruikt om JAK-afhankelijke fosforylering van STATs in cellysaten kwantitatief te monitoren: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen en Lumit. Elk van deze platforms heeft zijn voor- en nadelen.

SureFire is gebaseerd op luminescente zuurstof channeling-technologie, die donor- en acceptorparels gebruikt die zijn gecoat om specifiek een paar antilichamen te vangen, waarvan er één is gebiotinyleerd. In aanwezigheid van gefosforyleerd eiwit brengen de twee antilichamen de donor- en acceptorparels in de nabijheid, waardoor een chemiluminescent signaal kan worden gegenereerd6. Hoewel veelzijdig en gevoelig, is deze technologie duur, wordt beïnvloed door biotine in het kweekmedium, is zeer gevoelig voor omgevingstemperatuur en licht en vereist een speciale lezer voor detectie. HTRF en LANCE zijn beide gebaseerd op TR-FRET-technologie die gebruik maakt van langlevende luminescerende lanthanide-ioncomplexen (Europium- of Terbiumchelaten of Europiumcryptaat) als donormoleculen en verrode fluoroforen als de acceptormoleculen7. Wanneer twee eiwitspecifieke antilichamen gelabeld met donor- of acceptormoleculen in de nabijheid worden gebracht, vindt FRET plaats, waardoor een toename van de fluorescentie van de acceptor en een afname van de fluorescentie van de donor ontstaat. Deze langlevende fluorescerende signalen kunnen op een tijdsgeoploeide en ratiometrische manier worden gemeten om testinterferentie te verminderen en de gegevenskwaliteit te verhogen. Andere voordelen van TR-FRET zijn dat het niet lichtgevoelig is, herhaalde metingen mogelijk maakt en een lange signaalstabiliteit vertoont. Hoewel TR-FRET op grote schaal wordt geïmplementeerd in HTS vanwege zijn veelzijdigheid, gevoeligheid en hoge robuustheid, zijn alle commerciële TR-FRET-gebaseerde testplatforms duur, waardoor de brede toepassing ervan in academische en kleine industriële laboratoria wordt uitgesloten. De LanthaScreen-test maakt ook gebruik van een op TR-FRET gebaseerde uitlezing, maar is afhankelijk van een gemanipuleerde U2OS-cellijn die stabiel groen fluorescerend eiwit (GFP) -STAT1-fusie-eiwit tot expressie brengt in combinatie met een terbium-gelabeld fosfo-specifiek STAT1-antilichaam8. Naast het feit dat deze methode beperkt is in termen van keuze van signaaleiwitten, vereist deze methode de aankoop van dure getransfecteerde cellijnen, waardoor de toepasbaarheid ervan wordt verminderd en de mogelijkheid van experimentele artefacten wordt vergroot. Lumit is een generiek bioluminescent immunoassay-platform dat secundaire antilichamen (anti-muis en anti-konijn) gebruikt die chemisch zijn gelabeld met de kleine en grote NanoBit-subeenheden van NanoLuc Luciferase9. De binding van twee primaire antilichamen aan het doeleiwit brengt de secundaire antilichamen in de nabijheid om een actief enzym te vormen dat een luminescentiesignaal genereert. Hoewel luminescentie over het algemeen een gevoelige en robuuste uitlezing is, beperkt de vereiste voor primaire antilichamen die in twee verschillende soorten zijn verhoogd de keuzes voor het ontwerp van de test. Bovendien kan het gebruik van secundaire antilichamen in complexe monstermatrixen gevoelig zijn voor assay-interferentie.

Er bestaat dus nog steeds behoefte aan een betrouwbaar, snel, maar betaalbaar testplatform op basis van cellen voor het meten van individuele gefosforyleerde en totale STAT-eiwitten op een manier die compatibel is met HTS. Om aan deze behoefte te voldoen, werd een nieuw high-throughput celgebaseerd immunoassayplatform ontwikkeld op basis van een verbeterde TR-FRET-technologie (THUNDER) en ontworpen om eenvoudige, gevoelige, robuuste en kosteneffectieve meting van endogene tot expressie gebrachte intracellulaire eiwitten (gefosforyleerd of totaal) in cellysaten mogelijk te maken. De voordelen van deze technologie komen voort uit de combinatie van een donor/acceptor FRET-paar met uitzonderlijke spectrale compatibiliteit en TR-FRET-signaal, rigoureus gevalideerde antilichamen en geoptimaliseerde lysisbuffers. Deze assays zijn geformatteerd als sandwich immunoassays en maken gebruik van een eenvoudige workflow in drie stappen (figuur 1). Cellen worden eerst behandeld om eiwitfosforylatie te moduleren en vervolgens gelyseerd met de specifieke lysisbuffer in de kit. Het doelgefosforyleerde of totale STAT-eiwit in het cellysaat wordt gedetecteerd in een enkele reagenstoevoegings- en incubatiestap met een paar fluorofoor-gelabelde antilichamen die verschillende epitopen op het doeleiwit herkennen (figuur 2). Eén antilichaam wordt gelabeld met een Europium-chelaatdonor (Eu-Ab1), terwijl het tweede antilichaam wordt gelabeld met een verrode acceptorfluoofoor (FR-Ab2). De twee gelabelde antilichamen binden zich aan het eiwit in oplossing, waardoor de twee labels dicht bij elkaar komen. Excitatie van het donor-europiumchelaat bij 320 of 340 nm activeert een FRET naar de acceptor, die een langlevend TR-FRET-signaal uitzendt bij 665 nm evenredig met de concentratie van doeleiwit (gefosforyleerd of totaal) in het cellysaat.

figure-introduction-1
Figuur 1: TR-FRET assay workflow. De workflow bestaat uit drie stappen: celbehandeling, cellysis en eiwitdetectie met BEHULP VAN TR-FRET. In het tweeplatentestprotocol worden lysaten overgebracht naar een witte 384-well detectieplaat, terwijl in het one-plate protocol alle stappen worden uitgevoerd in dezelfde witte 384-well detectieplaat (all-in-one-well protocol). Ongeacht het gebruikte testprotocol wordt eiwitdetectie uitgevoerd in hetzelfde totale volume (20 μL per put). Afkorting: TR-FRET = time-resolved Förster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-2
Figuur 2: TR-FRET sandwich immunoassay principe. Eén antilichaam wordt gelabeld met de Europium chelaatdonor (Eu-Ab1) en het tweede met de verrode kleine fluorofoor acceptor (FR-Ab2). De twee gelabelde antilichamen binden specifiek aan verschillende epitopen op het doeleiwit (gefosforyleerd of totaal) in het cellysaat, waardoor de twee fluoroforen in de buurt komen. Excitatie van het donor-Europiumchelaat bij 320 of 340 nm veroorzaakt een FRET van de donor naar de acceptormoleculen, die op hun beurt een signaal uitzenden bij 665 nm. Dit signaal is evenredig met de concentratie eiwit in het cellysaat. Bij afwezigheid van het specifieke doeleiwit zijn de donor- en acceptorfluooforen te ver van elkaar verwijderd om FRET te laten optreden. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; TR-FRET = tijd-opgeloste FRET; Ab = antilichaam; FR = verrood; Eu - Europiumchelaat; P = fosforylering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor het meten, in een 384-well-formaat, van de intracellulaire niveaus van gefosforyleerde STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) en STAT6 (Y641), samen met de totale STAT1, STAT3, STAT5 en STAT6, in cellysaten van adherent- of suspensiecellen met behulp van het THUNDER TR-FRET-platform. Deze protocollen definiëren stappen voor celbehandeling, lysis en TR-FRET-gebaseerde doeleiwitdetectie met behulp van een twee-plaat overdrachtsprotocol of een één-plaat all-in-one-well-protocol. Deze celgebaseerde assays worden toegepast voor het bepalen van het farmacologische profiel van bekende activatoren en remmers van de JAK/STAT-route. De robuustheid en geschiktheid van geselecteerde testen voor HTS worden aangetoond. Ten slotte worden belangrijke experimenten voor assay-optimalisatie besproken, samen met aanbevelingen voor het oplossen van problemen met assays.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celkweek

  1. Houd cellen in een bevochtigde 37 °C/5% CO2-incubator en kweek met DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (HeLa- en A431-cellen) of RPMI aangevuld met 15% FBS (U266B1-cellen). Kweek de cellen totdat ze 70-80% samenvloeiing bereiken, trypsiniseer ze vervolgens en passeer of gebruik ze voor de testen.
    OPMERKING: Cultuurmedia bevatten fenolrood. Er werd geen serumuithongering uitgevoerd voor een cellijn voorafgaand aan het uitvoeren van de testen.

2. Titratie van stimulator of remmers met behulp van het tweeplatentestprotocol met aanhangende cellen

OPMERKING: In deze procedure wordt beschreven hoe de potenties van stimulatoren of remmers kunnen worden bepaald door een concentratie-responscurve te genereren uit een verdunningsreeks van de teststof.

  1. Cel zaaien
    1. Doseer 50 μL cellen met de vooraf geoptimaliseerde dichtheid (40.000 HeLa-cellen / put voor zowel STAT3 als STAT6; 75.000 A431-cellen / put voor STAT5) in een 96-well weefselkweekbehandelde plaat in het juiste kweekmedium. Incubeer 's nachts bij 37 °C/5% CO2.
      OPMERKING: Optimale celdichtheid en kweekincubatietijd moeten worden bepaald.
  2. Verdunningen van teststoffen
    1. Bereid tussenliggende 2x verdunningsreeksen van teststof(en) door de verbinding(en) (halflog-intervalverdunningen) over 12 putten van een polypropyleenplaat met 96 putten serieel te verdunnen tot serumvrij medium.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een 12-punts, half-log interval concentratie-responscurve in ten minste duplicaat uit te voeren voor een nauwkeurige schatting van de EC50 of IC50.
    2. Als alternatief, voor hydrofobe, dimethylsulfoxide (DMSO)-oplosbare testverbindingen, voer de initiële verdunningen uit in 100% DMSO en verdun de verdunningsreeks van de verbinding vervolgens tot serumvrij medium.
      OPMERKING: De testtolerantie voor DMSO moet worden vastgesteld voordat een titratie van de testverbinding in een DMSO-medium wordt uitgevoerd. Het is belangrijk om gelijke oplosmiddelconcentraties te behouden tussen behandelde en onbehandelde cellen. Bovendien moeten bij het testen van seriële verdunningen van verbindingen de oplosmiddelconcentraties altijd constant blijven over de hele verdunningsreeks.
  3. Celbehandeling
    1. Voeg voor celstimulatie alleen 50 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de stimulator (2x).
    2. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij kamertemperatuur (RT) of 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min bij RT voor STAT3; epidermale groeifactor (EGF)/10 min bij RT voor STAT5; interleukine (IL)-4/20 min bij RT voor STAT6). Ga dan verder met paragraaf 2.4.
      OPMERKING: Optimale incubatietemperatuur moet worden bepaald.
    3. Voeg voor celremming alleen 25 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de remmer (4x).
    4. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (JAK-remmer 1/30 min bij RT voor STAT3 en STAT6; Erlotinib/15 min bij RT voor STAT5).
    5. Voeg 25 μL serumvrij medium alleen (onbehandelde cellen) of met de stimulator (4x) toe aan de EC80.
    6. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (dezelfde omstandigheden als voor stap 2.3.2).
  4. Cellyse
    1. Bereid de specifieke 1x supplemented Lysis Buffer van de kit voor zoals aangegeven door de fabrikant.
      OPMERKING: Het is verplicht om de 1x Lysis Buffer aan te vullen met de 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail verdund tot een eindconcentratie van 1x. De 1x Supplemented Lysis Buffer bevat 1 mM natriumfluoride, 2 mM natrium orthovanadaat en 2 mM beta-glycerofosfaat. Andere fosfataseremmers zijn niet nodig en moeten worden vermeden. Lysisbuffers en fosfataseremmers anders dan die in de kit worden niet aanbevolen omdat ze ingrediënten kunnen bevatten die de meting kunnen verstoren.
    2. Verwijder het celkweekmedium voorzichtig en gooi het weg door het supernatant op te zuigen.
    3. Voeg onmiddellijk 50 μL 1x Supplemented Lysis Buffer toe.
      OPMERKING: Het Lysis Buffer-volume (25-50 μL) kan worden geoptimaliseerd.
    4. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT onder schudden (orbitale platenschudder ingesteld op 400 tpm; matige agitatie).
      OPMERKING: De incubatietijd van Lysis (30-60 min) kan worden geoptimaliseerd. Lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor doeleiwitdetectie of worden ingevroren bij -80 °C.
  5. TR-FRET detectie
    1. Bereid de 4x Antilichaamdetectiemix voor in 1x Detectiebuffer zoals aangegeven door de fabrikant.
    2. Pipetteer in deze overdrachtsstap voorzichtig 15 μL cellysaat van de 96-well kweekplaat naar een put van een witte, low-volume 384-well microplaat.
    3. Voeg 15 μL van het Positive Control Lysate en 15 μL van 1x Lysis Buffer (negatieve controle) toe aan afzonderlijke testputten.
    4. Voeg 5 μL 4x Antilichaamdetectiemix (Eu-Ab1/FR-Ab2 voor detectie van het fosfo-eiwit of Eu-Ab3/FR-Ab4 voor detectie van het totale eiwit) toe aan elk van de testputten.
    5. Bedek de plaat met een platensealer en incubeer gedurende 1 uur tot een nacht bij RT, afhankelijk van de test (zie het bijbehorende technische gegevensblad).
      OPMERKING: Optimale leestijd moet worden geoptimaliseerd voor elke test en cellijn. De plaat kan meerdere keren worden gelezen zonder een negatief effect op de testprestaties.
    6. Verwijder de zelfklevende platensealer en lees de plaat af op een TR-FRET compatibele microplaatlezer.
      OPMERKING: Filtergebaseerde fluorometers worden aanbevolen, hoewel sommige monochromatorinstrumenten kunnen worden gebruikt. Controleer of de juiste optische module (filters en spiegel) voor TR-FRET is geïnstalleerd. Gebruik een excitatiegolflengte van 320 of 340 nm om het Europium-chelaat te prikkelen. Lees assays bij zowel 615 nm (of 620 nm) als 665 nm om zowel de emissie van respectievelijk het donor-europium als de acceptorfluoofoor te detecteren. De instellingen van het instrument zijn afhankelijk van de specifieke lezer. De hier gepresenteerde gegevens werden verkregen met behulp van lampgebaseerde excitatie, 90 μs vertraging, 300 μs integratietijd en 100 flitsen per put. De fosfo-STAT4-test werd echter gelezen met behulp van laserexcitatie om hogere signaal-achtergrondverhoudingen (S / B) te genereren.

3. Titratie van stimulator of remmers met behulp van het testprotocol met twee platen met suspensiecellen

  1. Verdunning van teststoffen
    1. Bereid tussenliggende 2x verdunningsreeksen van teststof(en) zoals beschreven in de stappen 2.2.1 en 2.2.2.
  2. Celzaaien en behandeling
    1. Doseer 20 μL cellen met de vooraf geoptimaliseerde dichtheid (200.000 U266B1-cellen / put voor STAT1; 400.000 U266B1-cellen / put voor STAT4) in een 96-well weefselkweekbehandelde plaat in het juiste kweekmedium. Ga direct over tot celbehandeling of incubeer 2-4 uur bij 37 °C, 5% CO2.
      OPMERKING: Deze stap moet worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen.
    2. Voeg voor celstimulatie alleen 20 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de stimulator (2x).
    3. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (IFNα2b/15 min bij RT voor STAT1; IFNα2b/25 min bij 37 °C voor STAT4). Ga dan verder met paragraaf 3.3.
      OPMERKING: Optimale incubatietemperatuur moet worden bepaald.
    4. Voeg voor celremming alleen 10 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de remmer (4x).
    5. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (JAK-remmer 1/30 min bij RT voor STAT1 en STAT4).
    6. Voeg 10 μL serumvrij medium alleen (onbehandelde cellen) of met de stimulator (4x) toe aan de EC80.
    7. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (dezelfde omstandigheden als voor stap 3.2.3).
  3. Cellyse
    1. Bereid de specifieke 5x Supplemented Lysis Buffer van de kit voor zoals aangegeven door de fabrikant.
      OPMERKING: Het is verplicht om de 5x Lysis Buffer aan te vullen met de 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail verdund tot een eindconcentratie van 5x. De 5x Supplemented Lysis Buffer bevat 5 mM natriumfluoride, 10 mM natriumorthopvanadaat en 10 mM bèta-glycerofosfaat. Andere fosfataseremmers zijn niet nodig en moeten worden vermeden.
    2. Voeg 10 μL 5x Supplemented Lysis Buffer toe.
    3. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT onder schudden (orbitale platenschudder ingesteld op 400 tpm; matige agitatie).
      OPMERKING: De incubatietijd van Lysis (30-60 min) kan worden geoptimaliseerd. Lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor doeleiwitdetectie of worden ingevroren bij -80 °C.
  4. TR-FRET detectie
    1. Voer na cellyse de TR-FRET-detectiestap uit zoals beschreven in rubriek 2.5 voor het 2-plaattestprotocol voor aanhangende cellen.

4. Titratie van de stimulator met behulp van het testprotocol met één plaat met aanhangende of suspensiecellen

  1. Verdunning van teststoffen
    1. Bereid tussenverdunningsreeksen van teststof(en) bij 3x door de verbinding(en) (halflog-intervalverdunningen) over 12 putten van een polypropyleenplaat met 96 ruimen serieel te verdunnen tot serumvrij medium.
  2. Celzaaien en behandeling
    1. Doseer 8 μL cellen met de vooraf geoptimaliseerde dichtheid (160.000 U266B1-cellen / put voor STAT4; 80.000 HeLa-cellen / put voor STAT6), in het juiste serumvrije kweekmedium, in een witte, laagvolume 384well-testplaat. Ga direct over tot celbehandeling of incubeer 2-4 uur bij 37 °C, 5% CO2.
      OPMERKING: De vereiste voor een celkweekincubatietijd vóór de behandeling moet worden bepaald voor verschillende celtypen.
    2. Voeg voor celstimulatie alleen 4 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de stimulator (3x).
    3. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij kamertemperatuur of 37 °C (IFNα2b/25 min bij 37 °C voor STAT4; IL-4/20 min bij 37°C voor STAT6). Ga dan verder met paragraaf 4.3.
  3. Cellyse
    1. Bereid de specifieke 5x Supplemented Lysis Buffer van de kit voor zoals aangegeven door de fabrikant.
      OPMERKING: Het is verplicht om de 5x Lysis Buffer aan te vullen met de 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail verdund tot een eindconcentratie van 5x.
    2. Voeg 3 μL 5x supplemented Lysis Buffer toe.
    3. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT onder schudden (orbitale platenschudder bij 400 tpm).
      OPMERKING: De incubatietijd van Lysis (30-60 min) kan worden geoptimaliseerd. Lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of worden ingevroren bij 80 °C.
  4. TR-FRET detectie
    1. Voeg 15 μL Positive Control Lysate (onverdund) en 15 μL 1x Supplemented Lysis Buffer (negatieve controle) toe aan afzonderlijke testputten.
    2. Voeg 5 μL 4x antilichaamdetectiemix (Eu-Ab1/FR-Ab2 voor het fosfo-eiwit of Eu-Ab3-/FR-Ab4 voor het totale eiwit) bereid in 1x detectiebuffer toe aan elk van de testputten.
    3. Bedek de plaat met een platensealer en incubeer gedurende 1 uur tot een nacht bij RT, afhankelijk van de test.
      OPMERKING: Optimale leestijd moet worden geoptimaliseerd voor elke test en cellijn. De plaat kan meerdere keren worden gelezen zonder een negatief effect op de testprestaties.
    4. Verwijder de zelfklevende platensealer. Lees de plaat op een TR-FRET-compatibele microplaatlezer.

5. Data-analyse

  1. Bereken de TR-FRET-verhouding voor elke put met behulp van de volgende formule (1):
    figure-protocol-1 (1)
    OPMERKING: Omdat het TR-FRET-signaal wordt gelezen in een tijdomlossende modus, is aftrekken op de achtergrond meestal niet nodig. Als achtergrondaftrek wordt uitgevoerd, gebruik dan de celvrije putten met de 1x aangevulde lysisbuffer (negatieve controle) voor achtergrondaftrek. Bepaal de gemiddelde TR-FRET-verhouding van de celvrije putten en trek deze waarde vervolgens af van de TR-FRET-verhouding van elke put.
  2. Voor concentratie-responscurven analyseert u de gegevens volgens een niet-lineaire regressie met behulp van de 4 parameter logistieke vergelijking (sigmoïdale dosis-responscurve met variabele helling) en een 1/Y2-gegevensweging om EC50- of IC50-waarden te genereren.
  3. Voor het Z'-factorexperiment analyseert u de gegevens volgens de volgende formule (2)10
    figure-protocol-2 (2)
    Waar μ en σ zijn de gemiddelde waarden en standaardafwijkingen voor respectievelijk de positieve controle (p; gestimuleerde cellen) en de negatieve controle (n; onbehandelde cellen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Elke THUNDER TR-FRET-test werd farmacologisch gevalideerd door adherent (HeLa of A431) of suspensiecellen (U266B1) te behandelen met JAK/STAT pathway-specifieke activatoren of remmers en vervolgens de niveaus van specifieke gefosforyleerde en totale STATs te meten, indien van toepassing. Assays werden uitgevoerd in 384-well formaat met behulp van het twee-plaat overdrachtsprotocol en vooraf geoptimaliseerde testomstandigheden. Figuur 3, figuur 4,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vergeleken met conventionele methoden voor fosfoproteïne-analyse zoals western blotting en ELISA-gebaseerde methoden, is de workflow voor een THUNDER TR-FRET cellulaire test eenvoudig en snel, maakt gebruik van een monster met een laag volume (15 μL), is ontworpen voor HTS in een 384-well formaat en is zeer vatbaar voor automatisering. Het testprotocol is flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan zowel toepassingen met een gemiddelde als hoge doorvoer. Assays kunnen worden uitgevoerd met behulp van een twee-plaat ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Concurrerende belangen: Jaime Padros, Mireille Caron en Geneviève Chatel zijn werknemers van BioAuxilium Research, dat de THUNDER TR-FRET-testkits produceert die in deze studie worden gebruikt. Daarnaast zijn Jaime Padros en Mireille Caron aandeelhouders van BioAuxilium Research. Dit verandert niets aan de naleving door de auteurs van alle JoVE-beleidsregels voor het delen van gegevens en materialen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterileCorning3595Dit is de plaat voor het kweken van cellen bij gebruik van het twee-plaat-assayprotocol. Andere 96-well cellencultuurplaten kunnen worden gebruikt
384-well microplate, wit, laag volumePerkinElmer6007290Dit is de plaat voor TR-FRET detectie bij gebruik van de twee- of één-plaat-assayprotocollen. Andere witte 384-well platen met laag volume kunnen worden gebruikt
A431 cellijnATCCCRL-1555
Zelfklevende microplaat sealPerkinElmer6050185
DMSOFisherD159-4
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle medium (DMEM)Wisent319-005-CL THUNDER TR-FRET is compatibel met kweekmedium dat fenolrood bevat
EnVision Xcite Multilabel plate readerPerkinElmer2104-0020ADe assays kunnen worden uitgevoerd op verschillende plate readers uitgerust met de TR-FRET optie
Erlotinib hydrochlorideSigmaCDS022564
Falcon weefselkweek behandelde kolvenFisher13-680-65
Foetaal bovien serum (FBS)Wisent098-150
HeLa cellijnATCCCCL-2
JAK Inhibitor 1Cayman Chemical15146
Orbitale plaat shakerVele opties beschikbaarNiet van toepassing
Recombinant humaan EGFPeproTechAF-100-15
Recombinant humaan IFNα2bProSpecCYT-460
Recombinant humaan IL-4R&D Systems204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)Wisent350-007-CLTHUNDER TR-FRET is compatibel met kweekmedium dat fenolrood bevat
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay KitBioAuxilium ResearchKIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay KitBioAuxilium ResearchKIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Cell Signaling Assay KitBioAuxilium ResearchKIT-STAT4P-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay KitBioAuxilium ResearchKIT-STAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay KitBioAuxilium ResearchKIT-STAT6PT-500
Trypsin/EDTA 0,05%Wisent325-542-CL
U266B1 cellijnATCCTIB-196
Ultrapuur waterNANAGebruik Milli-Q kwaliteitswater (18 MΩ.cm) om Lysis Buffer en Detectie Buffer te verdunnen

Referenties

  1. Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
  2. Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
  3. O'Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
  4. Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
  5. Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392(2015).
  6. Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
  7. Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94(2014).
  8. Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
  9. Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
  10. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  11. Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
  12. Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
  13. Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
  14. Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
  15. Iversen, P. W., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2012).
  16. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

TR-FRET-assaysJAK-STAT-signaalroutetijdopgeloste FREThigh-throughputscreeningimmunoassay van cellysaatdetectie van gefosforyleerd STATsignaaloverdrachtantilichaamdetectiemengselmicroplaatlezer
Tijd-opgeloste Förster Resonantie Energie Transfer Assays voor meting van endogene gefosforyleerde STAT-eiwitten in menselijke cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.