Netwerkactiviteit opnemen in spinale nociceptieve circuits met behulp van micro-elektrodearrays

Summary

Het gecombineerde gebruik van micro-elektrode array-technologie en 4-aminopyridine-geïnduceerde chemische stimulatie voor het onderzoeken van nociceptieve activiteit op netwerkniveau in de dorsale hoorn van het ruggenmerg wordt geschetst.

Abstract

De rollen en connectiviteit van specifieke soorten neuronen in de dorsale hoorn van het ruggenmerg (DH) worden in een snel tempo afgebakend om een steeds gedetailleerder beeld te geven van de circuits die ten grondslag liggen aan de verwerking van spinale pijn. De effecten van deze verbindingen voor bredere netwerkactiviteit in de DH blijven echter minder goed begrepen omdat de meeste studies zich richten op de activiteit van enkele neuronen en kleine microcircuits. Als alternatief biedt het gebruik van micro-elektrode arrays (MEA's), die de elektrische activiteit in veel cellen kunnen volgen, een hoge ruimtelijke en temporele resolutie van neurale activiteit. Hier wordt het gebruik van MEA's met muisplakken van het ruggenmerg beschreven om DH-activiteit te bestuderen die wordt geïnduceerd door chemisch stimulerende DH-circuits met 4-aminopyridine (4-AP). De resulterende ritmische activiteit is beperkt tot de oppervlakkige DH, stabiel in de tijd, geblokkeerd door tetrodotoxine, en kan worden onderzocht in verschillende plakoriëntaties. Samen biedt dit preparaat een platform om dh-circuitactiviteit in weefsel van naïeve dieren, diermodellen van chronische pijn en muizen met een genetisch veranderde nociceptieve functie te onderzoeken. Bovendien kunnen MEA-opnames in 4-AP-gestimuleerde ruggenmergplakken worden gebruikt als een snelle screeningtool om het vermogen van nieuwe antinociceptieve verbindingen te beoordelen om de activiteit in het ruggenmerg DH te verstoren.

Introduction

De rollen van specifieke soorten remmende en exciterende interneuronen in het ruggenmerg DH worden in een snel tempo blootgelegd 1,2,3,4. Samen vormen interneuronen meer dan 95% van de neuronen in de DH en zijn ze betrokken bij sensorische verwerking, inclusief nociceptie. Bovendien zijn deze interneuroncircuits belangrijk om te bepalen of perifere signalen de neuroaxis opstijgen om de hersenen te bereiken en bijdragen aan de perceptie van pijn ^5,6,7. Tot op heden hebben de meeste studies de rol van DH-neuronen op het niveau van analyse van één cel of het hele organisme onderzocht met behulp van combinaties van in vitro intracellulaire elektrofysiologie, neuroanatomische etikettering en in vivo gedragsanalyse 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Deze benaderingen hebben het begrip van de rol van specifieke neuronpopulaties bij pijnverwerking aanzienlijk verbeterd. Er blijft echter een kloof bestaan in het begrijpen hoe specifieke celtypen en kleine macrocircuits grote populaties neuronen op microcircuitniveau beïnvloeden om vervolgens de output van de DH, gedragsreacties en de pijnervaring vorm te geven.

Een technologie die macrocircuits of meercellige functies kan onderzoeken, is de micro-elektrode array (MEA)^15,16. MEAs worden al tientallen jaren gebruikt om de werking van het zenuwstelsel te onderzoeken^17,18. In de hersenen hebben ze de studie van neuronale ontwikkeling, synaptische plasticiteit, farmacologische screening en toxiciteitstests vergemakkelijkt^17,18. Ze kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo toepassingen, afhankelijk van het type MEA. Bovendien is de ontwikkeling van MEA's snel geëvolueerd, met verschillende elektrodenummers en configuraties die nu beschikbaar^{zijn 19}. Een belangrijk voordeel van MEA's is hun vermogen om tegelijkertijd elektrische activiteit in veel neuronen te beoordelen met een hoge ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid via meerdere elektroden^15,16. Dit biedt een bredere uitlezing van hoe neuronen interageren in circuits en netwerken, onder controleomstandigheden en in de aanwezigheid van lokaal toegepaste verbindingen.

Een uitdaging van in vitro DH-preparaten is dat de voortdurende activiteitsniveaus meestal laag zijn. Hier wordt deze uitdaging aangepakt in DH-circuits van het ruggenmerg met behulp van de voltage-gated K ⁺ kanaalblokker, 4-aminopryidine (4-AP), om DH-circuits chemisch te stimuleren. Dit medicijn is eerder gebruikt om ritmische synchrone elektrische activiteit vast te stellen in de DH van acute ruggenmergplakken en onder acute in vivo omstandigheden 20,21,22,23,24. Deze experimenten hebben eencellige patch en extracellulaire opname of calciumbeeldvorming gebruikt om 4-AP-geïnduceerde activiteit 20,21,22,23,24,25 te karakteriseren. Samen heeft dit werk de vereiste aangetoond van exciterende en remmende synaptische transmissie en elektrische synapsen voor ritmische 4-AP-geïnduceerde activiteit. De 4-AP-respons wordt dus gezien als een benadering die inheemse polysynaptische DH-circuits met biologische relevantie ontmaskert in plaats van als een door geneesmiddelen geïnduceerd epifenomeen. Bovendien vertoont 4-AP-geïnduceerde activiteit een vergelijkbaar responsprofiel op analgetische en anti-epileptica als neuropathische pijnaandoeningen en is het gebruikt om nieuwe spinale analgetische medicijndoelen voor te stellen, zoals connexinen 20,21,22.

Hier wordt een preparaat beschreven dat MEAs en chemische activering van de spinale DH combineert met 4-AP om deze nociceptieve circuits op macrocircuit of netwerkniveau van analyse te bestuderen. Deze aanpak biedt een stabiel en reproduceerbaar platform voor het onderzoeken van nociceptieve circuits onder naïeve en neuropathische 'pijnachtige' omstandigheden. Deze voorbereiding is ook gemakkelijk toepasbaar om de werking op circuitniveau van bekende analgetica te testen en om nieuwe analgetica in het hyperactieve ruggenmerg te screenen.

Protocol

Studies werden uitgevoerd op mannelijke en vrouwelijke c57Bl/6 muizen in de leeftijd van 3-12 maanden. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care and Ethics Committee van de University of Newcastle (protocollen A-2013-312 en A-2020-002).

1. In vitro elektrofysiologie

1. Bereiding van oplossingen voor de bereiding en registratie van ruggenmergsneden
   1. Kunstmatig hersenvocht
      OPMERKING: Kunstmatige hersenvocht (aCSF) wordt gebruikt in een interface-incubatiekamer, waar plakjes worden opgeslagen totdat de opname begint en tijdens experimenten als zowel perfusaat als verdunningsmiddel voor geneesmiddelen. Zie tabel 1 voor de gedetailleerde samenstelling.

Chemisch	aCSF (mM)	aCSF (g/100 ml)	Sucrose-gesubstitueerde aCSF (mM)	Sucrose-gesubstitueerde aCSF (g/100 ml)	Kaliumrijke aCSF (mM)	Kaliumrijke aCSF (g/100 ml)
Natriumchloride (NaCl)	118	0.690	-	-	118	0.690
Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3)	25	0.210	25	0.210	25	0.210
Glucose	10	0.180	10	0.180	10	0.180
Potasiumchloride (KCl)	2.5	0.019	2.5	0.019	4.5	0.034
Natriumdiwaterstoffosfaat (NaH2PO4)	1	0.012	1	0.012	1	0.012
Magnesium cloride (MgCl2)	1	0.01	1	0.01	1	0.01
Calciumchloride (CaCl2)	2.5	0.028	2.5	0.028	2.5	0.028
Sacharose	-	-	250	8.558	-	-

Tabel 1: Kunstmatige cerebrospinale vloeistofsamenstellingen. Afkorting: aCSF = kunstmatige hersenvocht.

1. Bereid aCSF met (in mM) 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ en 2,5 CaCl₂ door de vereiste hoeveelheden van het bovenstaande, met uitzondering van CaCl₂, toe te voegen aan 2 L gedestilleerd water.
2. Bel de bovenstaande oplossing met carbogen (95% O₂, 5% CO₂) gedurende 5 minuten en voeg CaCl_{2 toe.}
   OPMERKING: Deze stap voorkomt caCl₂ neerslag, d.w.z. de oplossing mag niet bewolkt worden. Voor medicijntoepassing tijdens experimenten verdunt u de geneesmiddelvoorraadoplossingen in aCSF tot de gewenste eindconcentraties.

2. Sucrose-gesubstitueerde kunstmatige hersenvocht
   OPMERKING: Sucrose-gesubstitueerde aCSF wordt gebruikt tijdens dissectie en het snijden van het ruggenmerg. Zoals aangegeven door de naam, wordt sucrose vervangen door NaCl om neuronale excitatie tijdens deze procedures te verminderen met behoud van osmolariteit. Zie tabel 1 voor de gedetailleerde samenstelling.
   1. Bereid sucrose-gesubstitueerde aCSF met (in mM) 250 sucrose, 25 NaHCO₃, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ en 2,5 CaCl₂ door de vereiste hoeveelheden van al het bovenstaande, met uitzondering van CaCl₂, toe te voegen aan 300 ml gedestilleerd water.
   2. Bel de oplossing gedurende 5 minuten met carbogen en voeg vervolgens CaCl₂ toe.
   3. Bewaar de oplossing in een vriezer van -80 °C gedurende ongeveer 40 minuten of totdat de oplossing een drijfmest vormt. Vermijd het bevriezen van vaste stoffen en gebruik het in drijfmestconsistentie.

2. Micro-elektrode array voorbereiding
   OPMERKING: Het contactoppervlak van de MEA vereist een voorbehandeling om het hydrofiel te maken.
   1. Vul vóór het experiment de MEA-put gedurende 30 minuten met foetaal runderserum (FBS) of paardenserum (HS).
   2. Verwijder de FBS of HS en spoel MEA grondig af met ongeveer vijf wasbeurten gedestilleerd water totdat het gedestilleerde water niet meer schuimig is. Vul de put met aCSF, klaar voor gebruik.
3. Acute voorbereiding van ruggenmergsneden
   OPMERKING: De voorbereiding van het ruggenmergsegment van de muis is zoals eerder beschreven door Smith et ^al.2. Idealiter zou het verwijderen van de lumbosacrale vergroting niet meer dan 8-10 minuten moeten duren (stappen 1.3.2-1.3.11 hieronder).
   1. Verdoof de muis diep met 100 mg/kg ketamine (i.p.) en onthoofd hem vervolgens met een grote chirurgische schaar.
   2. Verwijder de huid over de buikstreek door een kleine snee in de huid te maken ter hoogte van de heupen. Trek de huid aan weerszijden van de snee rostrally totdat alle huid is verwijderd, d.w.z. van de bovenkant van de ribbenkast naar de bovenkant van het bekken (zowel ventraal als dorsaal).
   3. Plaats het lichaam op ijs en gebruik een ventrale benadering om de wervelkolom bloot te leggen door alle ingewanden te verwijderen en door de ribben lateraal naar het borstbeen te snijden.
   4. Verwijder de ventrale ribbenkast, zowel scapulae (afgesneden bij ongeveer T2) als de onderste ledematen en het bekken (afgesneden aan ongeveer de bovenkant van het heiligbeen).
   5. Breng de wervelkolom en het ribpreparaat over naar een ontleedbad met ijskoude sucrose aCSF. Pin alle vier de hoeken van het preparaat (ventraal oppervlak naar boven) door pinnen door de onderrugspieren en de bevestigde bovenste ribben te plaatsen.
   6. Verwijder al het spier- en bindweefsel boven het ventrale oppervlak van de wervels met rongeurs en identificeer het wervelgebied over de lumbosacrale vergroting, die ongeveer onder de T12 tot L2 wervellichamen ligt.
   7. Verwijder een wervellichaam dat caudaal is naar het lumbosacrale vergrotingsgebied om toegang te bieden tot het ruggenmerg terwijl het in het wervelkanaal zit.
   8. Snijd met behulp van een gebogen veerschaar bilateraal door de wervelstelen terwijl u het wervellichaam rostrale optilt en trekt om de ventrale en dorsale aspecten van de wervels te scheiden en het ruggenmerg bloot te leggen.
   9. Zodra de wervellichamen zijn verwijderd om de lumbosacrale vergroting te onthullen, verwijdert u zorgvuldig de resterende wortels die het ruggenmerg verankeren met een veerschaar totdat het koord vrij zweeft.
   10. Isoleer het ruggenmerg met rostrale en caudale sneden ruim boven en onder de lumbosacrale vergroting, waardoor het doelgebied van het koord 'vrij kan zweven'.
       OPMERKING: De voorkeursrichting van het segment bepaalt hoe het snoer vervolgens wordt gemonteerd voor secties (figuur 1).
   11. Voor dwarse plakjes tilt u het lumbosacrale segment op met een aangehechte wortel en plaatst u het op een voorgesneden polystyreenblok (piepschuim) blok (1 cm x 1 cm x 1 cm) met een ondiep kanaal in het midden gesneden. Gebruik cyanoacrylaatlijm (zie de tabel met materialen) om het blok en het koord aan het snijplatform te bevestigen en in het snijbad met ijskoude sucrose aCSF (slurry) te plaatsen.
       OPMERKING: Het ondiepe kanaal helpt het ruggenmerg vast te zetten en te oriënteren, met de dorsale kant bloot en het thoracale uiteinde van het koord aan de onderkant van het blok.
   12. Leg voor sagittale plakjes een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op het snijplatform, til de lumbosacrale vergroting op door een bevestigde wortel en plaats het koord langs de lijmlijn, zodat het ene laterale oppervlak in de lijm zit en het andere naar boven is gericht. Leg het in het snijbad met ijskoude sucrose aCSF (drijfmest).
   13. Voor horizontale plakjes legt u een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op het snijplatform. Til de lumbosacrale vergroting op door een bevestigde wortel en plaats de lumbosacrale vergroting langs de lijn van lijm, zodat het ventrale oppervlak in de lijm zit en het dorsale oppervlak naar boven is gericht. Gebruik bevestigde wortels om het snoer te positioneren. Leg het in het snijbad met ijskoude sucrose aCSF (drijfmest).

Figuur 1: Oriëntaties van ruggenmergsegmenten, montage- en snijmethoden. (A) Dwarsplakken vereisen een piepschuim snijblok met een ondersteunende groef erin gesneden. Het ruggenmerg rust tegen het blok in de steungroef, de dorsale kant van het koord weg van het blok. Het blok en koord worden met cyanoacrylaatlijm op een snijtrap gelijmd. (B) Sagittale plakjes worden bereid door een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op de snijfase te plaatsen en vervolgens het ruggenmerg op zijn kant op de lijm te plaatsen. (C) Horizontale plakjes worden bereid door een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op de snijfase te plaatsen en vervolgens de ventrale kant van het ruggenmerg op de lijm te plaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

14. Verkrijg 300 μm dikke plakken (L1-L5, dezelfde dikte ongeacht de oriëntatie) met behulp van een trillende microtoom met de volgende instellingen: snelheid 0,06 mm / s, amplitude 2,50 mm en gekalibreerd tot binnen ±0,02 hoogte amplitudeafwijking.
15. Breng de plakjes over naar een incubatiekamer met luchtinterface met zuurstofrijke aCSF.
16. Laat de plakjes voor het opnemen 1 uur bij kamertemperatuur (20-24 °C) in evenwicht zijn.

4. Micro-elektrode array opnames
   OPMERKING: In de volgende stappen wordt beschreven hoe u recordgegevens van op MEA gebaseerde experimenten op ruggenmergsegmenten kunt gebruiken. Afhankelijk van het experiment kunnen verschillende MEA-ontwerpen worden gebruikt. Ontwerpdetails voor MEA's die in deze experimenten worden gebruikt, worden weergegeven in Tabel 2 en Figuur 2. Gedetailleerde ontwerpinformatie is gepubliceerd door Egert et al.²⁶ en Thiebaud et al.²⁷ voor respectievelijk planaire en 3-dimensionale (3D) MEA's. Beide MEA-types zijn samengesteld uit 60 titaniumnitride-elektroden, met een siliciumnitride-isolerende laag en titaniumnitridesporen en contactpads.
   1. Experimentele opstelling
      1. Schakel de computer en het interfacebord in en start de opnamesoftware.
      2. Laad de voorgemonteerde opnamesjabloon (figuur 3A). Geef de bestanden voor de dag een naam op het tabblad Recorder.
      3. Bel aCSF continu met carbogen (5% CO₂, 95% O₂) voor de duur van het experiment.
      4. Schakel het perfusiesysteem in, dat wordt geregeld door een peristaltische pomp. Plaats de inlaatlijn in aCSF en het inlaatuiteinde in een afvalbeker. Prime de perfusielijnen met aCSF.
      5. Bereid 4-AP en andere geneesmiddeloplossingen door voorraden in 50 ml aCSF te verdunnen tot de vereiste eindconcentratie (bijv. 200 μM voor 4-AP).
      6. Plaats de medicijnoplossingen in medicijnpotten en bubbel ze met carbogen.
   2. 4-AP activiteit
      1. Breng na incubatie een enkele plak uit de incubator over met behulp van een Pasteur-pipet met grote punt gevuld met aCSF.
      2. Plaats het plakje in het MEA-putje en voeg extra aCSF toe.
      3. Plaats de plak over de opname-array met 60 elektroden met een fijne verfkwast met kort haar. Vermijd contact maken met de elektroden met de kwast of het weefsel over de elektroden slepen, vooral als u 3D-arrays gebruikt.
         OPMERKING: Afhankelijk van de MEA-lay-out kan dit worden gedaan met of zonder de hulp van een microscoop voor nauwkeurige positionering.
      4. Nadat u het plakje hebt geplaatst, plaatst u een verzwaard net over het weefsel om het op zijn plaats te houden en goed contact met MEA-elektroden te bevorderen.
         OPMERKING: Het segment moet mogelijk worden verplaatst na nettoplaatsing.
      5. Plaats de MEA in het opnamehoofdstadium (figuur 2A,B).
      6. Controleer de positie van het weefsel over de elektroden met behulp van een omgekeerde microscoop (2x vergroting) om te bevestigen dat zoveel mogelijk elektroden zich onder de oppervlakkige DH (SDH) bevinden. Zorg ervoor dat ten minste 2-6 elektroden niet in contact komen met het segment, omdat deze elektroden belangrijk zijn voor het aftrekken van ruis en het opnemen van artefacten tijdens de analyse (figuur 2E).
      7. Schakel de camera in, sluit deze aan op het apparaat en maak een referentieafbeelding van het segment ten opzichte van de MEA voor gebruik tijdens de analyse.
      8. Druk op Start DAQ in de opnamesoftware en controleer of alle elektroden een duidelijk signaal ontvangen.
         OPMERKING: Als het signaal luidruchtig is, maakt u het hoofdpodium los en reinigt u zowel de MEA-contactpads als de gouden veercontacten met 70% ethanol (gebruik een laboratoriumdoekje om ervoor te zorgen dat de pads en contacten droog zijn na het reinigen). Als het signaal nog steeds luidruchtig is, schakelt u de defecte elektroden in de opnamesoftware uit of noteert u later tijdens de analyse voor uitsluiting.
      9. Bevestig de perfusie-inlaat- en uitlaatleidingen aan de MEA-put (eerder gevuld met aCSF) en schakel het perfusiesysteem in. Controleer het debiet, idealiter 4-6 badvolumes per minuut, en zorg ervoor dat de uitstroom voldoende is om overloop van het superfusaat te voorkomen.
      10. Laat het weefsel gedurende 5 minuten in evenwicht zijn en noteer vervolgens 5 minuten ruwe, ongefilterde basisgegevens.
      11. Verplaats de perfusie-inlaatlijn van aCSF naar een 4-AP-oplossing en wacht 12 minuten tot de 4-AP-geïnduceerde ritmische activiteit de steady state bereikt (2 minuten voor medicijnen om het bad te bereiken en 10 minuten voordat de activiteit piekt en vervolgens plateau).
      12. Noteer 5 minuten 4-AP-geïnduceerde activiteit. Wees voorbereid op volgende opnames om de medicijnen te testen of om de stabiliteit van 4-AP te controleren.

Microelectrode Array Lay-outs
Micro-elektrode Array Model	60MEA 200/30iR-Ti	60-3DMEA 100/12/40iR-Ti	60-3DMEA 200/12/50iR-Ti	60MEA 500/30iR-Ti
Vlak of 3-dimensionaal (3D)	Planar	3D	3D	Planar
Elektrode Grid	8 x 8 cm	8 x 8 cm	8 x 8 cm	6 x 10 cm
Elektrodeafstand	200 μm	100 μm	200 μm	500 μm
Diameter van de elektrode	30 μm	12 μm	12 μm	30 μm
Elektrode Hoogte (3D)	N.v.t	40 μm	50 μm	N.v.t
Experimenten	Dwarssegment	Dwarssegment	Sagittale + horizontale	Sagittale + horizontale

Tabel 2: Micro-elektrode array lay-outs.

Figuur 2: Weefselpositionering op de micro-elektrode array. (A) Afbeelding toont een open MEA-headstage met een MEA op zijn plaats. (B) Hetzelfde als A met mea-headstage gesloten voor opnames en weefselperfusiesysteem op zijn plaats. (C) Afbeelding toont een MEA zoals geleverd door de fabrikant. Contactpads, die communiceren met de gouden veren van het hoofdstadium, en het MEA-weefselbad dat de weefselbadoplossing en weefselschijf bevat, worden getoond. Het gebied dat wordt gemarkeerd door het rode vierkant in het midden is de locatie van de elektrode-array. (D) Schema's tonen de twee MEA-elektrodeconfiguraties die in dit onderzoek zijn gebruikt, met nadere bijzonderheden in tabel 2. De referentie-elektrode wordt aangeduid met het blauwe trapezium. De linker MEA-elektrode-indeling toont een vierkante configuratie van 60 elektroden, die het meest wordt gebruikt in de gepresenteerde werkmodellen 60MEA200/30iR-Ti met elektroden met een diameter van 30 μm die 200 μm uit elkaar liggen, of 200 μm tussen elkaar en 100 μm verdeelde 3-dimensionale MEA's (60MEA200/12/50iR-Ti en 60MEA100/12/40iR-Ti) met elektroden met een diameter van 12 μm en een hoogte van 50 μm of 40 μm hoog, respectievelijk. De linker MEA elektrode lay-out toont een rechthoekige lay-out van 6 x 10 elektrode-60MEA500/30iR-Ti. (E) Hoge vergrotingsafbeelding van een 60MEA100/12/40iR-Ti vierkante MEA met dwarsbalksegment geplaatst voor opname. De plak zit op elektroderijen 3-8. De bovenste rij elektroden, die geen contact maken met weefsel, dienen als referentie-elektroden. Het SDH-gebied verschijnt als een semitransparante band. In dit geval overtreft de SDH elektroden in rijen 4, 5 en 6 en kolommen 2, 3, 4, 5 en 7 van de MEA. Schaalbalk = 200 μm. Afkortingen: MEA = microelectrode array; SDH = oppervlakkige dorsale hoorn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Segmenten wijzigen
   1. Spoel na elke opnamesessie de lijnen af met aCSF.
   2. Verwijder de MEA uit het hoofdpodium.
   3. Verwijder het net en het weefsel uit de MEA-put, spoel ze goed af met aCSF en herhaal de bovenstaande stappen met een nieuwe plak.

2. Gegevensverwerking en -analyse

OPMERKING: In de volgende stappen wordt beschreven hoe u de analysesoftware kunt gebruiken voor MEA-experimenten op ruggenmergsegmenten. Een van de 60 elektroden dient als interne referentie (gemarkeerd door een trapezium in figuur 2 C, D), terwijl tussen de vier en vijfentwintig van de resterende 59 onder de SDH worden geplaatst in een ruggenmergsegment voor volwassen muizen. Latere analyse detecteert extracellulaire actiepotentiaal (EAP) en lokale veldpotentiaal (LFP) golfvormen (zie figuur 3B voor voorbeelden) van het ruwe signaal in dit gebied.

1. Verwerking van ruwe gegevens
   1. Open de analysesoftware en laad de vooraf gemaakte analyselay-out (figuur 3B).
   2. Open het bestand van belang en deselecteer de referentie-elektrode (elektrode 15 in 8 x 8 MEA- of elektrode E1 in 6 x 10 MEA-configuratie) en alle elektroden die als te luidruchtig worden beschouwd.
   3. Stel het tijdvenster voor analyse in (0:00 → 5:00 min).
   4. Ga naar het filtertabblad Cross-channel . Selecteer Complexe referentie en selecteer de referentie-elektroden op basis van de afbeelding die tijdens het experiment is gemaakt en aantekeningen die zijn gemaakt (d.w.z. die elektroden niet onder weefsel). Als u dit wilt toepassen en controleren, drukt u op Verkennen voordat u doorgaat.
   5. Ga naar het tabblad EAP-filter en pas een^2e orde high pass Butterworth-filter toe (200 Hz afgesneden) om LFP-activiteit te verwijderen.
   6. Ga naar het tabblad LFP-filter en pas een^2e orde band pass Butterworth-filter (deltafrequenties van 0,5-4 Hz) toe om EAP-activiteit te verwijderen.
   7. Ga naar het tabblad EAP-detector en selecteer Automatische drempel. Vink de selectievakjes Stijgende en dalende randen aan en stel de dode tijd in op 0,5 ms.
   8. Stel positieve en negatieve drempels in op basis van de gegevens. Controleer de gegevens door terug te keren naar het scherm Raw-gegevensanalyse , de tijdmarkering te verplaatsen en vervolgens terug te keren naar het tabblad EAP-detector en op Verkennen te drukken. Herhaal dit totdat u ervan overtuigd bent dat de ingestelde detectiedrempel EAP's vastlegt zonder ruis/niet-fysiologische activiteit vast te leggen. Gebruik de referentie-elektroden om ruis/niet-fysiologische activiteit te identificeren.
      OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat een minimaal aantal EAP's wordt gedetecteerd in referentie-elektroden waar geen fysiologische activiteit zal optreden. Vrij kleine afwijkingen in de basislijn kunnen echter ten onrechte worden gedetecteerd als EAP's. Dit terwijl het nog steeds gericht is op het maximaliseren van het aantal echte gebeurtenissen dat in de actieve elektroden wordt gedetecteerd.
   9. Ga naar het tabblad LFP-detector , selecteer de handmatige drempel, vink de selectievakjes Stijgende en dalende rand aan en stel de dode tijd in op 3 ms.
   10. Herhaal stap 2.1.8 voor één elektrode door een elektrode met LFP-activiteit te selecteren. Als u tevreden bent, selecteert u Toepassen op iedereen , omdat drempels alleen worden toegepast op één elektrode wanneer u handmatig drempels uitvoert.
   11. Let bij het onderzoeken van LFP-gegevens op het tabblad Detector op het maximale aantal drempelovergangen voor de ene LFP-golfvorm en de maximale tijdscheiding van drempelovergangen voor de ene LFP-golfvorm voor gebruik in latere analyse.
   12. Druk op Analyse starten.
   13. Wanneer de analyse is voltooid, gaat u naar het tabblad EAP-analyzer en exporteert u de gegevens. Doe hetzelfde op het tabblad LFP-analyzer .
   14. Herhaal dit proces voor alle andere bestanden uit hetzelfde segment.
   15. Na het exporteren van gegevens converteert u de bestanden naar xlsx-indeling, zodat ze kunnen worden gelezen door het gebruikte programmeerscript. Geef de bestanden een naam volgens de volgende conventie voor het meegeleverde script om ze te lezen: experimentnaam (bijv. Voorbeeldgegevens) - segmentnummer (bijv. S1) - registratienummer (bijv. R1) - activiteitstype (bijv. Spikes of SP's, overeenkomend met EAP's of LFP's, respectievelijk).
       OPMERKING: De hier beschreven EAP-analyse behandelt spiking van individuele kanalen als een enkele populatie, hoewel deze activiteit vaak zou voortkomen uit meerdere neuronen in de nabijheid van de opname-elektrode. Als het aantal neuronen dat bijdraagt aan EAP's in een kanaal gewenst is, kunnen elders beschreven multispike-sorteertechnieken worden toegepast om verschillende populaties van spikes te onderscheiden op basis van golfvormkenmerken²⁸.

Figuur 3: Lay-outs van gegevensregistratie- en analysetools en voorbeeldmicro-elektrode-array-opnamen met extracellulaire actiepotentiaal en lokale veldpotentiaalgolfvormen. (A) Schematic toont vooraf geconfigureerde opnamesjabloon die wordt gebruikt voor de verwerving van MEA-gegevens. Door de MEA2100 en de opnametool (headstage/versterker) te koppelen, kunnen de gegevens een naam krijgen en worden opgeslagen. Vier voorbeeldsporen van ruwe gegevens (rechts, tijdperken van 5 minuten) werden verzameld door één MEA-kanaal met activiteit bij baseline, 12 minuten na 4-AP-toepassing, nog eens 15 minuten na vastgestelde 4-AP-activiteit en na badtoepassing van TTX (1 μM). Merk op dat de toevoeging van 4-AP (tweede spoor) een duidelijke toename van achtergrondgeluid en EAP / LFP-activiteit oplevert. Belangrijk is dat de activiteit relatief stabiel blijft gedurende ten minste 15 minuten nadat 4-AP-geïnduceerde activiteit is vastgesteld (derde spoor). Toevoeging van TTX (1 μM) elimineert alle activiteit (bottom trace). (B) Schematic (links) toont de configuratie van de analyzersoftware voor gegevensanalyse. De raw data explorer tool wordt gebruikt om opnames te importeren die zijn verzameld door opnamesoftware. Deze gegevens worden vervolgens uitgevoerd door een cross-channel filtertool die de geselecteerde referentie-elektrode(s) signaal(en) aftrekt van andere elektroden om achtergrondruis te verwijderen. Gegevens passeren het EAP-filter en de LFP-filtertools om signaal-ruisrelaties voor elke golfvorm te optimaliseren. Na deze stap komen de EAP-padgegevens in het hulpprogramma EAP-detector terecht, waar drempelwaarden worden ingesteld. EAP's worden gedetecteerd en vervolgens verzonden naar de EAP-analyzertool, waar de latenties van elke gebeurtenis worden vastgelegd en geëxporteerd als txt. bestand. Een identieke workflow vindt plaats voor LFP-gegevens met behulp van een overeenkomstige LFP-toolkit. Rechtersporen tonen gegevens van een enkel MEA-kanaal met verschillende extracellulaire golfvormen. Locatie van EAP- en LFP-signalen worden gemarkeerd in de bovenstaande 'telrasters'. Lagere sporen zijn tijdperken van de bovenste opname (aangeduid met rode balken) met golfvormen op een uitgebreide tijdschaal, inclusief verschillende LFP-signalen (let op de verscheidenheid aan verschijningen) en individuele extracellulaire EAP's (rode cirkels). Merk op dat de golfvorm en polariteit van LFP/EAP variëren ten opzichte van het aantal neuronen dat deze signalen produceert, hun nabijheid tot de opname-elektrode en hun locatie ten opzichte van de nabijgelegen elektrode(s). Afkortingen: MEA = microelectrode array; EAP = extracellulaire actiepotentiaal; LFP = lokaal veldpotentieel; 4-AP = 4-aminopyridine; TTX = tetrodotoxine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Synchroniciteitsanalyse
   OPMERKING: Synchroniciteit, of het aantal 'toevallige' gebeurtenissen tussen twee elektroden, werd bepaald met behulp van het toevalscriterium binnen de A-SPIKE-synchronisatiemethode beschreven door Satuvuori et al. ²⁹. Het hier gebruikte script vergelijkt alleen elektroden naast elkaar voor efficiëntie (d.w.z. horizontale, verticale en diagonale buren); het script kan echter worden herschreven om indien nodig alle elektroden te vergelijken.
   1. Voer gegevensanalyse uit met behulp van een aangepast programmeerscript, dat latentietijdstempels voor elke elektrode uit de .xlsx bestanden extraheert.
      OPMERKING: Dit kan handmatig worden gedaan.
   2. Noteer in stap 2.1.11 het maximale aantal drempelovergangen en de maximale tijdsscheiding van drempelovergangen voor de ene LFP-golfvorm. Wijzig het script voor het invoeren van deze LFP-definiërende parameters voor elk segment voordat u het script uitvoert.
      OPMERKING: Thresholding die eerder in analysesoftware is uitgevoerd, legt EAP's duidelijk vast als een enkele gebeurtenis. LFP's bestaan echter uit een variabel aantal pieken, afhankelijk van de vorm van de golfvorm en het daaropvolgende aantal drempeloverschrijdingen door die ene gebeurtenis.
   3. Wijzig het script om de elektroden van belang in te voeren vóór de analyse.
   4. Om synchroniciteit te bepalen (gedefinieerd in het script door aanpasbare tijdframes voor synchrone activiteit die binnen kan plaatsvinden), scheidt en analyseert u de geëxtraheerde latenties om toevallige gebeurtenissen te detecteren.
      OPMERKING: Met het script kan de maximale tijd tussen toevallige gebeurtenissen worden ingesteld. Deze zijn vastgesteld op 20 ms voor EAP's en 200 ms voor LFP's.
   5. Voer het script uit om latentietijdstempels te extraheren.
      OPMERKING: Het .xlsx-uitvoerbestand bevat de interpretaties van latentiegegevens, namelijk EAP- en LFP-tellingen, frequenties en toevallige gebeurtenistellingen voor afzonderlijke elektroden en hele segmenten. Deze gegevens worden gebruikt om de frequentie, EAP/LFP-tellingen, het aantal actieve elektroden, het aantal toevallige gebeurtenissen, het aantal gekoppelde elektroden en de gemiddelde sterkte van deze koppelingen te beoordelen.

Results

Model van netwerkactiviteit in de dorsale hoorn van het ruggenmerg
Toepassing van 4-AP induceert op betrouwbare wijze synchrone ritmische activiteit in het ruggenmerg DH. Dergelijke activiteiten presenteren zich als verhoogde EAP's en LFP's. Het latere signaal is een laagfrequente golfvorm, die eerder is beschreven in MEA-opnames³⁰. Veranderingen in EAP- en/of LFP-activiteit na toediening van geneesmiddelen weerspiegelen veranderde neurale activiteit. Voorbeelden van EAP's en L...

Discussion

Ondanks het belang van de spinale DH bij nociceptieve signalering, verwerking en de resulterende gedrags- en emotionele reacties die pijn kenmerken, blijven de circuits binnen deze regio slecht begrepen. Een belangrijke uitdaging bij het onderzoeken van dit probleem is de diversiteit van neuronpopulaties waaruit deze circuits^{bestaan 6,31,32}. Recente ontwikkelingen in transgene technologieën, geleid door optogenetica en chemogene...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-aminopyridine	Sigma-Aldrich	275875-5G
100% ethanol	Thermo Fisher	AJA214-2.5LPL
CaCl2 1M	Banksia Scientific	0430/1L
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)	Coregas	219122
Curved long handle spring scissors	Fine Science Tools	15015-11
Custom made air interface incubation chamber
Foetaal bovien serum	Thermo Fisher	10091130
Forceps Dumont #5	Fine Science Tools	11251-30
Glucose	Thermo Fisher	AJA783-500G
Paarden serum	Thermo Fisher	16050130
Inverted microscope	Zeiss	Axiovert10
KCl	Thermo Fisher	AJA383-500G
Ketamine	Ceva	KETALAB04
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14007-14
Loctite 454 Instant Adhesive	Bolts and Industrial Supplies	L4543G
MATLAB	MathWorks		R2018b
MEAs, 3-Dimensional	Multichannel Systems	60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti	60 titanium nitride (TiN) elektroden met 1 interne referentie-elektrode, gerangschikt in een 8x8 vierkant rooster. Elektroden zijn 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) of 50 µm (200/12/50) hoog en gelijkmatig verdeeld 100 µm (100/12/40) of 200 µm (200/12/50) uit elkaar.
MEA headstage	Multichannel Systems	MEA2100-HS60
MEA interface board	Multichannel Systems	MCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA net	Multichannel Systems	ALA HSG-MEA-5BD
MEA perfusion system	Multichannel Systems	PPS2
MEAs, Planar	Multichannel Systems	60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti	60 titanium nitride (TiN) elektroden met 1 interne referentie-elektrode, gerangschikt in een 8x8 vierkant rooster (200/30) of een 6x10 rechthoekig rooster (500/30). Elektroden zijn 30 µm in diameter en gelijkmatig verdeeld 200 µm (200/30) of 500 µm (500/30) uit elkaar.
MgCl2	Thermo Fisher	AJA296-500G
Microscope camera	Motic	Moticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser software	Multichannel Systems		V 2.17.4
Multi Channel Experimenter software	Multichannel Systems		V 2.17.4
NaCl	Thermo Fisher	AJA465-500G
NaHCO3	Thermo Fisher	AJA475-500G
NaH2PO4	Thermo Fisher	ACR207805000
Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14
Small spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Small surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Sucrose	Thermo Fisher	AJA530-500G
Superglue			cyanoacrylaatlijm
Tetrodotoxin	Abcam	AB120055
Vibration isolation table	Newport	VH3048W-OPT
Vibrating microtome	Leica	VT1200 S