Methodenartikel

Reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten

DOI:

10.3791/62928

⸱

10 augustus 2021

 , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Toledo

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten in gedefinieerde proteoliposomen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als centrum voor oxidatieve fosforylering en apoptotische regulatie spelen mitochondriën een vitale rol in de menselijke gezondheid. Een goede mitochondriale functie is afhankelijk van een robuust kwaliteitscontrolesysteem om eiwithomeostase (proteostase) te behouden. Dalingen in mitochondriale proteostase zijn in verband gebracht met kanker, veroudering, neurodegeneratie en vele andere ziekten. Msp1 is een AAA + ATPase verankerd in het buitenste mitochondriale membraan dat proteostase handhaaft door verkeerd gelokaliseerde staartverankerde eiwitten te verwijderen. Met behulp van gezuiverde componenten gereconstitueerd tot proteoliposomen, hebben we aangetoond dat Msp1 noodzakelijk en voldoende is om een model staart-verankerd eiwit uit een lipide bilayer te extraheren. Ons vereenvoudigde gereconstitueerde systeem overwint verschillende van de technische barrières die een gedetailleerde studie van membraaneiwitextractie hebben belemmerd. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het genereren van liposomen, membraaneiwitreconstructie en de Msp1-extractietest.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een goede cellulaire functie hangt af van een proces dat proteostase wordt genoemd, dat ervoor zorgt dat functionele eiwitten zich op de juiste concentratie en cellulaire locatie bevinden1. Mislukkingen in proteostase leiden tot een gecompromitteerde organelfunctie en worden geassocieerd met veel neurodegeneratieve ziekten2,3,4. Membraaneiwitten vormen unieke uitdagingen voor het proteostasenetwerk, omdat ze op het juiste membraan moeten worden gericht, terwijl aggregatie van de hydrofobe transmembraandomeinen (TMD's) wordt vermeden5. Bijgevolg zijn gespecialiseerde machines geëvolueerd om de hydrofobe TMD te beschermen tegen het cytosol en het richten en inbrengen in het juiste celmembraan6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15te vergemakkelijken.

Mitochondriën zijn de metabole hub van de cel en zijn betrokken bij tal van essentiële cellulaire processen zoals: oxidatieve fosforylering, ijzer-zwavel clustergeneratie en apoptotische regulatie16,17. Deze endosymbiotische organellen bevatten twee membranen, aangeduid als het binnenste mitochondriale membraan (IMM) en het buitenste mitochondriale membraan (OMM). Meer dan 99% van de 1.500 menselijke mitochondriale eiwitten zijn gecodeerd in het nucleaire genoom en moeten worden getransloceerd over een of twee verschillende membranen18,19. Een goede mitochondriale functie is dus afhankelijk van een robuust proteostasenetwerk om eventuele fouten in eiwittargeting of translocatie te corrigeren.

Ons laboratorium richt zich op een subset van mitochondriale membraaneiwitten genaamd staart-verankerde (TA) eiwitten, die een enkel transmembraandomein hebben op het C-eindpunt20,21,22,23,24. TA-eiwitten zijn betrokken bij een aantal essentiële processen, zoals apoptose, vesikeltransport en eiwittranslocatie25. De unieke topologie van TA-eiwitten vereist posttranslationele insertie, die optreedt in het endoplasmatisch reticulum (ER) door de Guided Entry of Tail-anchored (GET) of Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) pathways of in de OMM door een slecht gekarakteriseerde pathway20,26,27,28. De biofysische eigenschappen van de TMD zijn noodzakelijk en voldoende om TA-eiwitten naar het juiste membraan te leiden29. De herkenning van biofysische kenmerken in plaats van een gedefinieerd sequentiemotief beperkt de getrouwheid van de richtroutes5. Mislokalisatie van TA-eiwitten is dus een veel voorkomende stress voor de proteostasenetwerken. Cellulaire stress, zoals remming van de GET-route, veroorzaakt een toename van eiwitmislokalisatie naar de OMM en mitochondriale disfunctie, tenzij deze eiwitten onmiddellijk worden verwijderd30,31.

Een gemeenschappelijk thema in membraanproteostase is het gebruik van AAA +(ATPase Associated met cellulaire A-ctivities) eiwitten om oude, beschadigde of verkeerd gelokaliseerde eiwitten uit de lipide bilayer1,32,33,34,35,36,37,38 te verwijderen . AAA + -eiwitten zijn moleculaire motoren die hexamere ringen vormen en ATP-afhankelijke bewegingen ondergaan om een substraat te hermodelleren, vaak door translocatie door een smalle axiale porie39,40. Hoewel er veel moeite is gedaan om de extractie van membraaneiwitten door AAA + ATPases te bestuderen, zijn de reconstituties complex of omvatten ze een mengsel van lipiden en wasmiddel41,42, wat de experimentele kracht beperkt om het mechanisme van substraatextractie uit de lipide bilayer te onderzoeken.

Msp1 is een zeer geconserveerde AAA + ATPase verankerd in de OMM en peroxisomen die een cruciale rol speelt in membraanproteostase door het verwijderen van verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten43,44,45,46,47. Msp1 bleek onlangs ook mitochondriale eiwitimportstress te verlichten door membraaneiwitten te verwijderen die vastlopen tijdens translocatie over de OMM48. Verlies van Msp1 of de menselijke homoloog ATAD1 resulteert in mitochondriale fragmentatie, falen in oxidatieve fosforylering, epileptische aanvallen, verhoogd letsel na een beroerte en vroege dood31,49,50,51,52,53,54,55,56.

We hebben aangetoond dat het mogelijk is om TA-eiwitten te co-reconstitueren met Msp1 en de extractie uit de lipide bilayer57 tedetecteren. Dit vereenvoudigde systeem maakt gebruik van volledig gezuiverde eiwitten gereconstitueerd in gedefinieerde liposomen die de OMM nabootsen (Figuur 1)58,59. Dit niveau van experimentele controle kan gedetailleerde mechanistische vragen van substraatextractie aanpakken die experimenteel onhandelbaar zijn met complexere reconstituties waarbij andere AAA + -eiwitten betrokken zijn. Hier bieden we experimentele protocollen met gedetailleerde informatie over onze methoden voor liposoompreparaat, membraaneiwitreconstructie en de extractietest. Het is onze hoop dat deze experimentele details verdere studie van het essentiële maar slecht begrepen proces van membraanproteostase zullen vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Liposoom voorbereiding

  1. Combineer chloroformvoorraden lipiden in geschikte verhoudingen om het buitenste mitochondriale membraan na te bootsen.
    1. Bereid 25 mg lipidenmengsel. We gebruiken een eerder vastgesteld mengsel van lipiden die mitochondriale membranen nabootsen, bestaande uit een 48:28:10:10:4 molaire verhouding van kippenei fosfatidyl choline (PC), kippenei fosfatidyl ethanolamine (PE), runder lever fosfatidyl inositol (PI), synthetische 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (DOPS), en synthetische 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo]-glycerol (TOCL)58,59. Voorbeeldberekeningen zijn weergegeven in tabel 1.
    2. Breng alle lipidenvoorraden op kamertemperatuur voordat u ze opent, omdat dit de condensatie zal beperken. Omdat de meeste laboratoria geen precieze manier hebben om de concentratie van de lipiden te meten, zal elk water dat door de chloroformvoorraad wordt geabsorbeerd, de concentratie van de lipidenvoorraad en dus de verhouding van lipiden die in de test worden gebruikt, veranderen.
    3. Aangezien lipidenvoorraden in glazen ampullen komen, brengt u de vereiste hoeveelheid lipide over naar een glazen injectieflacon met behulp van een spuit van 1 ml. Voeg 2 mg dithiothreitol (DTT) toe aan de injectieflacon om lipide-oxidatie te voorkomen. Werk snel omdat verdamping van chloroform de concentratie van het lipide zal veranderen.
    4. Breng de resterende lipide over in een aparte glazen injectieflacon en plaats met een PFTE septa. Voeg 2 mg DTT toe aan de injectieflacon, wikkel met parafilm en bewaar bij -20 °C om lipide-oxidatie te voorkomen. Probeer de lipiden binnen 3 maanden na overdracht naar de injectieflacons te gebruiken. Om mogelijke verontreiniging van de chloroformvoorraden door markerafvoer te voorkomen, brengt u de stickers van de originele ampullen over naar de glazen injectieflacons in plaats van met stift te labelen.
  2. Verdamp chloroform onder een zeer zachte stikstofstroom terwijl u de glazen injectieflacon continu met de hand in een zuurkast laat draaien, die in wezen fungeert als een handmatige rotovap. Draai de injectieflacon met een constante snelheid (20-40 rpm) met de hand om de lipiden in beweging te houden. Het doel is om alle chloroform te verdampen en een gelijkmatige coating van lipiden over de hele glazen flacon te krijgen.
    LET OP: Chloroform is neurotoxisch en deze stap moet worden uitgevoerd in de zuurkast.
    1. Bevestig een verse Pasteur pipet aan de stikstofbuis. Laat geen van de lipiden uit de injectieflacon of op de Pasteur pipet spatten. Richt de punt op de bodem van de injectieflacon, zodat de lucht van de bodem weerkaatst en de lipiden omhoog duwt naar het midden van de injectieflacon. Zorg voor een gelijkmatige coating over de hele injectieflacon en vermijd ophoping in de hoeken of bij de dop. Dit hele proces duurt ongeveer 5 minuten.
    2. Naarmate het mengsel dikker wordt tot een "kraal" van lipiden, leidt u het naar het midden van de injectieflacon door de hoek van de injectieflacon te veranderen. Zodra de kraal kleiner begint te worden, draait u de stikstofstroom iets hoger om de kraal te verspreiden, zodat geen van de lipiden uit de injectieflacon waait.
  3. Verwijder alle resterende chloroform onder vacuüm.
    1. Plaats de glazen injectieflacon gedurende 1 uur op een huisvacuüm- of membraanvacuümpomp om het grootste deel van de resterende chloroform te verwijderen. Deze stofzuigers zijn over het algemeen niet sterk genoeg om alle chloroform te verwijderen, maar ze kunnen kleine hoeveelheden oplosmiddel beter verdragen dan roterende ijdele stofzuigers.
    2. Plaats de injectieflacon gedurende 12-16 uur op een sterk vacuüm (<1 mTorr) om alle resterende chloroform te verwijderen. Zorg ervoor dat u tijdens dit proces geen stoten van de injectieflacon maakt.
  4. Resuspend de lipiden in 1,25 ml liposoombuffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 15% glycerol, 1 mM DTT). Omdat we begonnen met 25 mg lipiden, resulteert dit in een concentratie van 20 mg / ml. Reuspend de lipiden volledig zonder zichtbare brokken. Als de lipiden zich in de hoek van de injectieflacon verzamelen, kan dit een langdurig proces zijn.
    1. Draai de injectieflacon krachtig totdat het monster melkachtig glad is. We vinden dat als de chloroform-verdamping de avond ervoor goed is gedaan, dit proces ongeveer 5-10 minuten duurt.
    2. Om volledige resuspensie van de lipiden te garanderen, draait u gedurende 3 uur op een wiel bij kamertemperatuur bij ~ 80 tpm. Verwijder de injectieflacon eenmaal per uur uit het wiel gedurende 1 minuut vortexing om een gelijkmatige menging te garanderen.
  5. Breng lipiden voorzichtig over op een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voer 5 vries-dooicycli uit met vloeibare stikstof om te bevriezen en een warmteblok van 30 °C om te ontdooien. Deze stap helpt om multilamellaire blaasjes om te zetten in unilamellaire blaasjes.
  6. Extrudeer de lipiden.
    1. Bereid tijdens de vriesdooicycli de mini-extruder voor. Monteer de mini-extruder met 10 mm filtersteunen en een polycarbonaat membraan van de gewenste poriegrootte (we gebruiken 200 nm). De grootte van het filter heeft invloed op de grootte van het liposoom, wat van invloed is op de concentratie van eiwitten die nodig zijn voor de reconstitutie(stap 2.3).
    2. Plaats de mini-extruder op een hete plaat en breng de extrudertemperatuur op 60 °C.
    3. Zuig de lipiden op in een gasdichte glazen spuit van 1 ml en plaats ze voorzichtig in het ene uiteinde van de mini-extruder. Plaats de lege gasdichte spuit in de andere kant van de mini-extruder. Laat de lipiden gedurende 5-10 minuten in evenwicht brengen met de standtemperatuur van de extruder.
    4. Breng de lipiden over naar de alternatieve spuit door zachtjes op de zuiger van de gevulde spuit te drukken. Duw de oplossing van de alternatieve spuit in de originele spuit. Herhaal dit heen-en-weer proces 15 keer, zodat bij de 15e passage de lipiden eindigen in de alternatieve spuit. Controleer het volume in elke pas om er zeker van te zijn dat er geen lekken zijn.
  7. Bereid aliquots van de lipiden voor eenmalig gebruik, vries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C. De liposomen zijn enkele maanden stabiel bij -80 °C. De reconstituties vereisen 10 μL liposomen per keer (stap 2.3.4), dus het is handig om 10 μL of 20 μL aliquots te bereiden.

2 Reconstitutie van Msp1 en Model TA eiwit

  1. Bereid de reconstitutiebuffer voor: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM kaliumacetaat, 7 mM magnesiumacetaat, 2 mM DTT, 10% sucrose, 0,01% natriumazide, 0,2-0,8% Deoxy Big Chaps (DBC).
    1. Optimaliseer de reconstitutiecondities voor de nieuwe batch liposomen. De concentratie van DBC en biobeads die nodig zijn voor optimale reconstitutie varieert afhankelijk van de gebruikte batch liposomen. Als u de voorbereiding wilt beperken tot de voorbereidingsvariabiliteit, gebruikt u dezelfde partij DBC voor alle experimenten. Wanneer u veel DBC wijzigt, herhaalt u het optimalisatieproces.
    2. Stel een reeks reconstituties op met verschillende concentraties DBC (0,2% - 0,8%) en biobeads (25 mg - 100 mg) telkens wanneer een nieuwe partij liposomen wordt bereid. Het is belangrijk om de DBC niet onder de kritische micelconcentratie (CMC) van ~0,12% te laten zakken. Zodra de omstandigheden zijn geoptimaliseerd, raden we aan om alle gegevens te verzamelen met behulp van dezelfde liposoomvoorbereiding en reconstitutiecondities.
    3. De effectiviteit van de verschillende reconstitutiecondities testen met behulp van de extractietest beschreven in stap 3.
  2. Bereid biokorrels in een eindconcentratie van 250 mg / ml.
    1. Weeg 2,7 g gedroogde biokorrels af en resuspend in een centrifugebuis van 50 ml van 100% methanol (ongeveer 45 ml) om de kralen nat te maken. Maak de biokorrels in eerste instantie nat in methanol om te voorkomen dat lucht vast komt te zitten in de poriën van de kralen. Eenmaal in methanol, houd de biobeads nat, omdat alle lucht die door de biobeads wordt gevangen, hun vermogen om wasmiddel te absorberen zal veranderen.
    2. Verwijder methanol door de kralen 8x te wassen met ongeveer 45 ml ultrapuur water (18,2 mΩ), hierna ddH2O. Pelletkorrelkorrels genoemd door gedurende 1 minuut op 3.200 x g te draaien. Decanteer de vloeistof en resuspend in ddH2O.
    3. Na het wassen resuspend in 10 ml ddH2O met 0,02% natriumazide en bewaren bij 4 °C. Biobeads kunnen enkele maanden bewaard worden bij 4 °C. Deze voorraad is 250 mg / ml omdat wordt aangenomen dat ~ 0,2 g verloren gaat tijdens de wasstappen.
  3. Bereken de grootte van het liposoom en het gewenste aantal moleculen TA-eiwit en Msp1 per liposoom. Dit bepaalt de concentratie van Msp1 en TA-eiwit die nodig is voor de reconstitutie.
    1. Bereken eerst het aantal lipidemoleculen per unilamellair liposoom (Ntotaal) met behulp van de vergelijking figure-protocol-1 waarbij d de diameter van het liposoom is, h de dikte van de dubbellaag en a het lipidehoofdgroepgebied.
      1. Meet de liposoomdiameter met DLS. In ons voorbeeld werd een waarde van 70 nm voor de liposoomdiameter (d) verkregen.
      2. Gebruik een waarde van 5 nm voor h en 0,71 nm2 voor een, wat de hoofdgroepgrootte is voor fosfatidylcholine. In deze specifieke situatie is Ntotaal 37.610.
    2. Bereken vervolgens de molaire concentratie van lipide M Lipid met behulp van het gemiddelde molecuulgewicht van de lipiden in het mengsel. In dit voorbeeld is de concentratie van lipiden 20 mg/ml(stap 1.4)en het gemiddelde molecuulgewicht van lipiden 810 g/mol(tabel 1). Dit resulteert in een waarde van 0,0247 M voor MLipid.
    3. Bereken vervolgens de molaire concentratie van liposomen, MLiposome, met behulp van de vergelijking figure-protocol-2 waarbij M Lipid de molaire concentratie van lipide is uit stap 2.3.2, en Ntotaal is het totale aantal lipiden per liposoom berekend in stap 2.3.1. In dit voorbeeld is de voorraadconcentratie van 20 mg/ml liposomen ongeveer 660 nM.
    4. Bereken de hoeveelheid Msp1- en TA-eiwit die nodig is voor een reconstitutiereactie van 100 μL.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van lipiden in de reconstitutie is 2 mg / ml, wat een 10x verdunning van de liposoomvoorraad is. Dit geeft een uiteindelijke liposoomconcentratie van 66 nM. De uiteindelijke concentratie van Msp1 is 792 nM, wat een gemiddelde geeft van 12 totale kopieën (2 functionele hexameren) per liposoom. De uiteindelijke concentratie TA-eiwit is 660 nM, wat een gemiddelde van 10 kopieën per liposoom geeft.
  4. Meng in een PCR-buis gezuiverde Msp1, TA-eiwit en liposomen in reconstitutiebuffer. De volgorde van toevoeging is buffer, eiwitten en liposomen duren. Het totale volume is 100 μL. Laat het mengsel 10 minuten op ijs staan. Zuiver het Msp1- en TA-eiwit zoals eerder beschreven57.
    1. Gebruik het goed gekarakteriseerde model TA-eiwit His-Flag-Sumo-Sec22 als een positief controlesubstraat bij het voor het eerst vaststellen van de test. Deze constructie heeft een His-tag voor eenvoudige zuivering, 3x-Flag tag voor detectie door western blot, een Sumo-domein voor verhoogde oplosbaarheid en de TMD van het ER-TA-eiwit Sec22 voor reconstitutie en herkenning door Msp1.
    2. Zorg ervoor dat stamoplossingen van zowel Msp1 als het TA-eiwit ongeveer 100 μM zijn om het effect van N-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) van de eiwitzuivering op de reconstitutie te minimaliseren. Purified Msp1 is in 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM natriumchloride, 0,1 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride (TCEP), 0,05% DDM terwijl het gezuiverde TA-eiwit in 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumchloride, 10 mM magnesiumchloride, 5 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0,1% DDM zit. Stockoplossingen van ongeveer 100 μM TA-eiwit en Msp1-monomeer zorgen ervoor dat deze componenten < 5% van het uiteindelijke reconstitutievolume uitmaken, wat resulteert in een verdunning van DDM onder de CMC.
  5. Voeg de gewenste hoeveelheid biokralen toe aan het monster om het reinigingsmiddel te verwijderen.
    1. Snijd de punt van een p200 pipetpunt tot ongeveer1/8 e inch in diameter, zodat kralen door de punt kunnen passen. Vortex de biobeads-buis grondig om een uniform mengsel te verkrijgen en verwijder snel het deksel en pipetteer het volume voordat de biobeads bezinken. Breng de biokorrels over in een lege PCR-buis.
    2. Wanneer de reconstitutie zijn incubatietijd van 10 minuten op ijs heeft voltooid, gebruikt u een ongesneden pipetpunt om alle vloeistof uit de biokralen te verwijderen. Breng vervolgens de 100 μL reconstitutie over in de buis met de biobeads. Dit moet snel gebeuren zodat de biokralen geen lucht vasthouden, waardoor de kralen gaan drijven.
  6. Laat de reconstitutie gedurende 16 uur bij 4 °C op een wiel draaien bij ~80 tpm.
  7. Verwijder gereconstitueerd materiaal uit biokralen. Doe een snelle spin in een picofuge om de biokralen te pelleteren en gebruik vervolgens een ongesneden pipetpunt om het gereconstitueerde materiaal over te brengen naar een schone PCR-buis. Herhaal dit proces 1-2 keer totdat er geen biokorrels meer in het monster zitten. Blijf reconstitutie op ijs.
  8. Ruim het gereconstitueerde materiaal vooraf op om eventuele eiwitten te verwijderen die niet in de liposomen zijn gereconstitueerd.
    1. Bereid extractiebuffer voor: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM kaliumacetaat, 7 mM magnesiumacetaat, 2 mM DTT, 100 nM calciumchloride.
    2. Breng de glutathionspinkolommen in evenwicht met extractiebuffer volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Dit omvat meestal 3 wasrondes met 400 μL buffer en vervolgens centrifugeren bij 700 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om de buffer te verwijderen.
    3. Voeg 5 μM van elke chaperonne (GST-SGTA en GST-Calmodulin) toe aan het gereconstitueerde materiaal. Deze chaperonnes binden zich aan de TMD van eiwitten die niet in de liposomen zijn gereconstitueerd. Zuivering van chaperonnes werd eerder beschreven6,57.
      OPMERKING: Deze chaperones zijn commercieel verkrijgbaar, maar we geven er de voorkeur aan om in eigen huis te zuiveren om te controleren op kosten en kwaliteit. Beide eiwitten zijn in 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM natriumchloride en 0,1 mM TCEP en hebben een voorraadconcentratie van ongeveer 160 μM. SGTA herkent substraten met een sterk hydrofobe TMD, terwijl Calmodulin TMD's bindt met matige hydrofobiciteit6,29. Samen kan deze chaperonnecocktail een breed scala aan substraten herkennen.
    4. Voeg 100 μL extractiebuffer toe aan het gereconstitueerde materiaal, waardoor het volume op 200 μL komt. Voeg dit toe aan de gebalanceerde glutathion spinkolommen. Merk op dat de glutathion spinkolommen het hoogste monsterherstel bieden wanneer het pre-clearing volume 200 - 400 μL is.
    5. Sluit de centrifuges aan en draai gedurende 30 minuten met ~ 80 rpm bij 4 °C om chaperones aan hars te laten binden.
    6. Draai de kolommen bij 700 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. De doorstroming is voorgeklaard materiaal dat is uitgeput van geaggregeerde eiwitten. Houd materiaal op ijs en ga direct verder met extractietest.

3. Extractietest

  1. Bereid buizen voor op SDS PAGE-analyse. Elke reactie heeft 4 buizen: INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) en ELUTE (E).
    1. Voeg 45 μL ddH2O-monster toe aan de INPUT-buis, 40 μL ddH2O aan de FLOW THROUGH-buis en 0 μL aan de WASH- en ELUTE-buizen.
      OPMERKING: De beste signaal-ruisverhouding in deze test wordt verkregen wanneer de WASH- en ELUTE-monsters 5x geconcentreerd zijn ten opzichte van de INPUT- en FLOW THROUGH-monsters. Vanwege de verdunningen tijdens de test vereist dit het nemen van 5 μL monster voor het INPUT-monster, 10 μL monster voor het FLOW THROUGH-monster en 50 μL monster voor de WASH- en ELUTE-monsters.
    2. Voeg 16,6 μL 4x SDS PAGE-laadbuffer toe aan elke buis. Het totale volume van elk monster is 50 μL vóór SDS PAGE Loading Buffer. Het uiteindelijke volume is 66,6 μL (50 μL monster + 16,6 μL 4x SDS PAGE loading buffer).
  2. Stel de extractietest samen.
    1. Bereid de extractiereactie voor met 60 μL voorgeklaarde proteoliposomen, 5 μM GST-SGTA, 5 μM GST-Calmodulin en 2 mM ATP. Combineer alle reagentia behalve ATP, dat wordt gebruikt om de reactie te initiëren. Breng tot een eindvolume van 200 μL met extractiebuffer.
      OPMERKING: Aangezien voor elke extractietest 60 μL monster wordt gebruikt, kan één reconstitutie worden gebruikt voor drie verschillende extractietests. Voer positieve en negatieve controles (+ATP en -ATP) uit op materiaal uit dezelfde reconstitutie.
    2. Voorverwarm de extractietest in een warmteblok van 30 °C gedurende 2 minuten.
  3. Start de extractietest door ATP toe te voegen aan de eindconcentratie van 2 mM en start de timer.
    1. Geef een draai van 5 seconden in een picofuge om ATP in de reactie te mengen. Incubeer de reactie bij 30 °C gedurende 30 minuten.
    2. Neem tijdens de incubatie 5 μL van de reactie en voeg toe aan de INPUT-buis. De timing hiervan is flexibel.
    3. Breng tijdens deze incubatieperiode één glutathion-spinkolom in evenwicht voor elk monster in de extractietest.
  4. Voer pull-down uit op chaperones om geëxtraheerd materiaal te isoleren.
    1. Zodra de incubatie van 30 minuten is voltooid, voegt u 200 μl extractiebuffer toe aan de buis om het totale volume op 400 μL te brengen. Voeg toe aan de gebalanceerde glutathionhars en laat gedurende 30 minuten op het wiel bij 4° C binden.
    2. Draai de kolommen op 700 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om de doorstroom op te vangen. Neem 10 μL voor de FLOW THROUGH buis. Dit monster bevat substraten die nog steeds geïntegreerd zijn in de lipide bilayer.
    3. Was hars tweemaal met 400 μL extractiebuffer en gooi de doorstroming weg. Houd bij de derde wasbeurt de doorstroming vast en neem 50 μL voor de WASH-buis.
    4. Bereid 5 ml elutiebuffer door gereduceerd glutathion toe te voegen aan een eindconcentratie van 5 mM in extractiebuffer. Bereid deze buffer elke keer vers.
    5. Voeg 200 μL elutiebuffer toe aan de spinkolom. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Draai bij 700 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om te elueren. Houd de doorstroming door. Herhaal het proces een tweede keer zodat het totale elutievolume 400 μL is.
    6. Neem 50 μL monster uit het elutiemonster en voeg het toe aan de ELUTE-buis.
  5. Analyseer extractieactiviteiten met SDS-PAGE en western blot.
    OPMERKING: Aangezien een western blot een vrij standaardprocedure is, wordt een basisprotocol verstrekt dat enkele van de details benadrukt die uniek zijn voor deze test.
    1. Laad monsters in een vlekvrije polyacrylamidegel (4% stapelen, 15% scheiden) en laat gedurende 50 minuten op 200 V in tris-glycinebuffer lopen. Als de ruimte het toelaat, gebruik dan zowel een onbevlekte als een gekleurde ladder om visualisatie op vlekvrije gel imager en overdracht naar PVDF-membraan mogelijk te maken. De vlekvrije gel maakt kwantitatieve visualisatie van tryptofaan bevattende eiwitten mogelijk bij activering met ultraviolet licht, terwijl de gel nog steeds kan worden gebruikt voor een western blot.
    2. Stel de vlekvrije gel voor om te bevestigen dat er een gelijke belasting is over alle monsters. Dit is een essentiële controle die ervoor zorgt dat eventuele veranderingen in het signaal die door western blot worden gedetecteerd, niet het gevolg zijn van variabele eiwitbelasting. Er mogen alleen zichtbare banden zijn voor de chaperones (GST-calmodulin en GST-SGTA) in de INPUT- en ELUTION-monsters. Bedenk dat het ELUTE-monster geconcentreerder zal zijn dan het INPUT-monster.
    3. Monteer een western blot cassette met behulp van een 45 μm PVDF membraan. Breng over met een constante stroom van 300 mA gedurende 60 minuten.
    4. Na het blokkeren van het membraan, bindt u gedurende 16 uur bij 4 °C aan het primaire antilichaam met zacht schudden ~ 15 rpm. Dep voor substraat met konijn Anti-FLAG bij een verdunning van 1:1.000.
      OPMERKING: De primaire en secundaire antilichamen die worden gebruikt, zijn substraatspecifiek en de concentratie voor gebruik moet mogelijk worden geoptimaliseerd.
    5. Was het membraan en incubeer met secundair antilichaam, geit anti-konijn bij een verdunning van 1:10.000, met zacht schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Was membraan en beeld voor analyse met behulp van western blotting detectiemiddel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de resultaten goed te interpreteren, moeten de vlekvrije gel en de western blot samen worden bekeken. De vlekvrije gel zorgt voor een gelijke belasting over alle monsters. Bij het bekijken van de vlekvrije gel zullen de chaperones (GST-calmodulin en GST-SGTA) zichtbaar zijn in de INGANG (I) en ELUTE (E) rijstroken. Controleer nogmaals of de intensiteit van deze banden uniform is voor alle INPUT-samples. Zorg er ook voor dat de intensiteit uniform is over de ELUTE-monsters. De ELUTE is 5x geconcentreerder dan de INPUT ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een goede mitochondriale functie is afhankelijk van een robuust eiwitkwaliteitscontrolesysteem. Vanwege inherente limieten in de getrouwheid van de TA-eiwitgerichte routes, zijn verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten een constante bron van stress voor mitochondriën. Een belangrijk onderdeel van het mitochondriale proteostasenetwerk is Msp1, een membraan verankerd AAA + ATPase dat verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten uit de OMM verwijdert. Hier hebben we beschreven hoe proteoliposomen te bereiden, Msp1 en een model TA-eiwit t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MLW ontwikkelde een deel van dit protocol tijdens zijn postdoctorale studies met Dr. Robert Keenan aan de Universiteit van Chicago.

Dit werk wordt gefinancierd door NIH-subsidie 1R35GM137904-01 aan MLW.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BiobeadsBio-Rad1523920
Bovine lever fosfatidylinositolAvanti840042CPI
Kippeneige fosfatidylkolineAvanti840051CPC
Kippeneige fosfatidyletanolamineAvanti840021CPE
ECL Select western blotting detectiemiddelGERPN2235
FilterondersteuningenAvanti610014
GlaspeuVWR60910L-1
Glutathione spinkolomThermo FisherPI16103
Geiten anti-konijnThermo FisherNC1050917
Mini-ExtruderAvanti610020
PolycarbonaatmembraanAvanti610006200 nM
PVDF-membraanThermo Fisher8851845 µM
Konijn anti-FLAGSigma-AldrichF7245
Synthetisch 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serineAvanti840035CDOPS
Synthetisch 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo]-glycerolAvanti710335CTOCL
Spuit, 1 mLNorm-Ject53548-001
Spuit, 1 mL, gasdichtAvanti610017

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
  2. Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
  3. Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1868, 118922(2020).
  4. McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, New York, N.Y. (2020).
  5. Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902(2019).
  6. Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
  7. Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
  8. Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
  9. Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
  10. Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, New York, NY. 88-91 (2016).
  11. Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, Copenhagen, Denmark. 770-785 (2018).
  12. Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, New York, NY. 1152-1155 (2015).
  13. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
  14. Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
  15. Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
  16. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
  17. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
  18. Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
  19. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135(2019).
  20. Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
  21. Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
  22. Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
  23. Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
  24. Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
  25. Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, Copenhagen, Denmark. 1687-1694 (2007).
  26. Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
  27. McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
  28. Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, New York, NY. 3099(2017).
  29. Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301(2016).
  30. Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
  31. Chen, Y. -C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
  32. Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
  33. Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
  34. van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
  35. Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507(2017).
  36. Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135(2018).
  37. Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
  38. Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
  39. Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
  40. Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
  41. Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10(2018).
  42. Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
  43. Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
  44. Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
  45. Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126(2019).
  46. Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
  47. Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
  48. Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR - a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, New York, NY. (2018).
  49. Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
  50. Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
  51. Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
  52. Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
  53. Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985(2017).
  54. Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
  55. Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678(2018).
  56. Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329(2020).
  57. Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
  58. Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  59. Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EiwitreconstitutieAAA ATPaseMitochondri le ProteostaseLiposoomgeneratieMembraaneiwittextractieTail Anchored EiwittenGlutathion spinzuilenSDS PAGE analyseWestern Blot

Gerelateerde artikelen