DUCT: Double Resin Casting gevolgd door Micro-Computed Tomography voor 3D Leveranalyse

Samenvatting

Dubbelharsgieten micro-computertomografie, of DUCT, maakt visualisatie, digitalisering en segmentatie van twee buisvormige systemen tegelijkertijd mogelijk om 3D-analyse van orgelarchitectuur te vergemakkelijken. DUCT combineert ex vivo injectie van twee radiopaqueharsen gevolgd door micro-computertomografiescanning en segmentatie van de tomografische gegevens.

Samenvatting

De lever is het grootste interne orgaan bij mensen en muizen, en hoge autofluorescentie vormt een belangrijke uitdaging voor het beoordelen van de driedimensionale (3D) architectuur van het orgaan op het niveau van het hele orgaan. Leverarchitectuur wordt gekenmerkt door meerdere vertakkende lumenstructuren, die kunnen worden gevuld met hars, waaronder vasculaire en galbomen, waardoor een zeer stereotiep patroon ontstaat in het anders hepatocytrijke parenchym. Dit protocol beschrijft de pijplijn voor het uitvoeren van microcomputertomografie met dubbele harsgiet, of "DUCT". DUCT omvat het injecteren van de poortader en de gemeenschappelijke galwegen met twee verschillende radiopaque kunstharsen, gevolgd door weefselfixatie. Kwaliteitscontrole door één kwab, of de hele lever, te zuiveren met een optisch clearingmiddel, maakt pre-screening van geschikte geïnjecteerde monsters mogelijk. In het tweede deel van de DUCT-pijplijn kan een kwab of de hele lever worden gebruikt voor micro-computertomografie (microCT) scanning, (semi-)geautomatiseerde segmentatie en 3D-rendering van de portale veneuze en galwegen. MicroCT resulteert in 3D-coördinatengegevens voor de twee harsen die zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse van de twee systemen en hun ruimtelijke relatie mogelijk maken. DUCT kan worden toegepast op postnatale en volwassen muizenlever en kan verder worden uitgebreid naar andere buisvormige netwerken, bijvoorbeeld vasculaire netwerken en luchtwegen in de longen.

Inleiding

Orgelharsgieten is een techniek die teruggaat tot de ^{17e eeuw1}. Een van de eerste voorbeelden van modern harsgieten werd uitgevoerd op de menselijke lever van een autopsie. Intrahepatische galwegen werden gevuld met een contrastmiddel gemengd met gelatine, gevolgd door beeldvorming met een röntgen-CT-scan2. Het doel van de DUCT-techniek is om twee buisvormige hars-gegoten netwerken in combinatie in 3D te visualiseren, digitaliseren en analyseren.

DUCT is gebaseerd op de uitgebreide bestaande kennis van single-system leverharsgieten3,4,5,6,7,8 en ^strekt zich uit tot gelijktijdige 3D-visualisatie en analyse van twee ^systemen9. DUCT geavanceerde single resin casting naar double resin casting door twee radiopaque harsen van verschillend contrast te mengen en deze harsen in twee verschillende netwerken te injecteren, met name het gemeenschappelijke galkanaal en de poortader. DUCT kan worden toegepast op jonge postnatale muizen met reproduceerbare resultaten al op postnatale dag 15 (P15). In vergelijking met op microscopie gebaseerde beeldvormingstechnieken is het belangrijkste voordeel dat DUCT sneller, antilichaamvrij is en leverweefselautofluorescentie de beeldvorming niet verstoort. Verder biedt DUCT kwantitatieve gegevens die de lumenisatiestatus, interne diameter, netwerkconnectiviteit en perfusie beschrijven. Onderscheid maken tussen de aanwezigheid van lumenvormende cellen en hun de facto morfogenese in buizen is essentieel voor het analyseren van organen waarin ductulaire cellen aanwezig zijn maar geen buizen vormen, zoals het geval kan zijn bij het syndroom van ^Alagille10. Het grootste nadeel van DUCT is de beperkte penetratie van de hars, die stroperig is en niet in buizen met een klein kaliber (<5 μm) komt. DUCT kan worden toegepast voor elke buisvormige structuur na het bepalen van het injectie-ingangspunt, zoals de arteriële en veneuze bloedsomloop, luchtwegen, de extrahepatische galwegen of lymfevaten. Het zou dus de analyse van de hele orgaanarchitectuur van andere weefsels zoals longen en pancreas kunnen vergemakkelijken.

MicroCT-gesegmenteerde afbeeldingen kunnen worden verwerkt met behulp van in de handel verkrijgbare beeldvormingssoftware, zoals ImageJ, of op maat geschreven pijplijnen (bijv. MATLAB). De harsgeïnjecteerde lever kan kwalitatief worden geanalyseerd voor netwerkuitbreiding en connectiviteit of kwantitatief voor volume, lengte, vertakking, tortuositeit van een enkel systeem en de interactie tussen twee systemen, zoals de afstand tussen twee systemen, of branchpoint-afhankelijkheid (vertakt systeem 1 zich in de nabijheid van systeem 2-vertakking?). De DUCT-pijplijn met harsinjectie, microCT-scanning en CT-gegevenssegmentatie, gecombineerd met gedetailleerde kwantitatieve analyse van architecturale mechanismen van twee buisvormige systemen, zou een standaard kunnen bieden voor volledige leveranalyse in diermodellen.

Protocol

Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, is goedgekeurd en volgt de dierenwelzijnsregels en -voorschriften van de Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Stockholm animal research ethics board). De dieren die in deze studie werden gebruikt, waren wilde of homozygote Jag1H268Q-mutante muizen met een gemengde C3H / N- en C57bl6J-achtergrond. Zowel mannen als vrouwen werden opgenomen in de studie. De dieren werden gebruikt op postnatale dag 15 of als volwassenen tussen 3 - 8 maanden.

1. Dubbele harsinjecties

1. Voorbereiding
   1. Bereid harsoplossing voor. Bereid voor harsinjecties met een dubbel systeem zowel gele als groene harsen zoals beschreven in de stappen 1.1.2-1.1.4.
   2. Bereid 1 ml aliquots verdunde hars per muis.
   3. Gele hars: Verdun geel siliconenrubber (hoge radiopaciteit) met het heldere verdunningsmiddel in een 3:1 verdunning om gele hars voor injectie te bereiden.
   4. Groene hars: Meng blauw siliconenrubber (niet-detecteerbare radiopaciteit) met het heldere verdunningsmiddel in een verdunning van 1:1 om blauwe hars te bereiden. Om groene hars te genereren, mengt u de verdunde blauwe hars met de verdunde gele hars in een verhouding van 1:1. Vortex de groene hars grondig tot de kleur homogeen is.
      OPMERKING: Blauwe hars heeft een zeer lage radiopaciteit die niet detecteerbaar is met microCT, waardoor verdunning met gele hars nodig is om twee harsen met verschillende radiopaciteiten te creëren.
      LET OP: Hars kan loodchromaat bevatten, wat kankerverwekkend is. Het produceert giftige gassen in een brand. Behandel de hars met zorg en gooi deze weg als gevaarlijk afval.
   5. Bereid twee injectiesets (injectieset #1 en injectieset #2) voor met slangen zoals beschreven in de stappen 1.1.6-1.1.11.
      OPMERKING: Gebruik voor volwassen muizen (>P30 (postnatale dag 30) = P30 - 2 jaar) injectieset #1 (PE10-slang met een buitendiameter van 0,6 mm) voor gemeenschappelijke galweginjectie en injectieset #2 (PE50-slang met een buitendiameter van 0,96 mm) voor poortaderinjectie. Bereid voor jonge postnatale muizen (tot P30) twee #1 injectiesets voor, één voor galweg en één voor poortaderinjectie (geen injectieset #2 omdat de poortader te smal is om PE50-slangen te herbergen).
   6. Om injectieset #1 voor te bereiden, snijdt u 30 cm PE10-buis en strekt u het ene uiteinde van de buis met de hand uit door eraan te trekken totdat deze zo dun mogelijk wordt (figuur 1A, B, ongeveer 0,15 mm diameter, niet-uitgerekte PE10-buis heeft een diameter van 0,6 mm).
   7. Snijd de punt van de uitgerekte PE10-buis diagonaal af om een afgeschuinde punt te creëren (figuur 1B).
   8. Sluit het niet-uitgerekte uiteinde van de PE10-slang aan op een naald van 30 G (figuur 1A, injectieset #1).
   9. Om injectieset #2 voor te bereiden, snijdt u 30 cm PE50-buis en strekt u het ene uiteinde van de buis met de hand uit door eraan te trekken totdat deze dun genoeg wordt om in de poortader te passen (figuur 1A, B, ongeveer 0,7 mm, niet-uitgerekte PE50-buis heeft een diameter van 0,96 mm).
   10. Snijd de punt van de uitgerekte PE50-buis diagonaal om een afgeschuinde punt te creëren (figuur 1B).
   11. Sluit het niet-uitgerekte uiteinde van de PE50-buis aan op een naald van 23 G (figuur 1A, injectieset #2).
       OPMERKING: Elke injectieset kan slechts voor één injectie worden gebruikt, omdat de hars in de spuit en slang zal uitharden. Pas de grootte van de uitgerekte en afgeschuinde punt aan op basis van de grootte van het gemeenschappelijke galkanaal en de poortader van de muis, afhankelijk van de leeftijd, het genotype en het fenotype. Wanneer u niet zeker bent van de grootte en pasvorm van de slang, plaatst u de slang in het juiste kanaal of vat na de incisie en voordat de slang wordt gevuld met hars. Als de slang te breed is om in het kanaal/vat te passen, rek deze dan verder uit.
   12. Verdoof het dier door isofluraaninhalatie (eerst 4% in de inductiekamer en ~ 2% met behulp van de neuskegel).
   13. Plaats de muis op een geventileerde bank op een dissectiepad terwijl de muis isofluraan door de neuskegel ademt. Controleer of het dier bewusteloos is door een door het instituut/IRB aanbevolen methode, bijvoorbeeld door in een van de poten te knijpen.
       LET OP: Isofluraan kan slaperigheid of duizeligheid veroorzaken bij inademing en kan schade aan het cardiovasculaire systeem en het centrale zenuwstelsel veroorzaken door langdurige of herhaalde blootstelling. Inhaleer het niet. Behandel de stof op een geventileerde bank en in goed geventileerde ruimtes.
       OPMERKING: Het is mogelijk om een andere verdovingsmethode te gebruiken, zolang deze compatibel is met hartperfusie.
   14. Zodra het dier bewusteloos is, spuit u de ventrale kant met 70% ethanol om interferentie van de vacht te voorkomen.
   15. Knip met behulp van een huidschaar de huid, fascia en spierlaag vanaf de middellijn van de buikholte en snijd door naar de thoracale holte om de inwendige organen bloot te leggen.
   16. Pak het xiphoid-proces met een tang om het borstbeen op te tillen en snijd het diafragma en de ribbenkast aan beide zijden om het hart en de longen bloot te leggen.
   17. Verwijder de ribbenkast door met een schaar door de ribben aan de linker- en rechterkant van de ribbenkast te snijden. Wees extra voorzichtig om de lever niet te beschadigen, omdat dit zal resulteren in lekkage van de hars.
   18. Trek met een rechte tang het hart naar de lever en snijd het rechteratrium weg.
   19. Steek een vlindernaald (23 G), verbonden met een peristaltische perfusiepomp, in de linker ventrikel. Perfuseer de muis transcardiaal met Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en heparine (1 U/g lichaamsgewicht van de muis). Perfundeer gedurende 3 minuten met een perfusiesnelheid van 5 ml/min.
       OPMERKING: Als de muis correct wordt doordrenkt, zullen de inwendige organen bleek worden, vooral de lever. Als in plaats daarvan de longen wit worden, wordt de naald in de rechter ventrikel ingebracht en moet deze worden verplaatst. Na perfusie wordt de muis geëxsanguineerd en kan deze uit de neuskegel en isofluraan worden verwijderd.
   20. Schakel de isofluraanpomp uit.
2. Harsinjectie - Galsysteem harsgieten
   1. Beweeg de muis naar de dissectiemicroscoop, buik omhoog, staart naar de experimentator en hoofd weg van de experimentator. De anatomische bezienswaardigheden zijn afgebeeld in figuur 2A.
   2. Lokaliseer de inferieure vena cava (figuur 2A) door de darm naar de zijkant te verplaatsen. Gebruik een voorjaarsschaar om een kleine transversale incisie te maken in de inferieure vena cava om de afgifte van de levervasculaire druk mogelijk te maken (figuur 2Bi).
   3. Stel de gemeenschappelijke galwegen en poortader bloot zoals beschreven in stappen 1.2.4- 1.2.6.
   4. Verplaats de darm en alvleesklier naar de rechterkant (van de experimentator) met behulp van een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) -bevochtigd wattenstaafje.
   5. Draai de ventrale kant van de lever naar het hart met behulp van het pbs-bevochtigde wattenstaafje om het viscerale oppervlak en het hilarische gebied bloot te leggen.
   6. Lokaliseer het gemeenschappelijke galkanaal dat loopt van het hilarische gebied over de pancreas en in de darm bij de sluitspier van Oddi (Figuur 2Bii, gemeenschappelijk galkanaal omlijnd met de gele stippellijn, zwarte pijlpunten wijzen naar sluitspier van Oddi).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de lever vochtig is tijdens de procedure door het te besprenkelen met PBS.
   7. Maak omringend weefsel (gebied ~ 5 mm) vrij van het gemeenschappelijke galkanaal met behulp van een rechte tang. Plaats zijden hechtdraad (maat 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lang) onder het gemeenschappelijke galkanaal (figuur 2Bii) en bind een losse bovenhandse knoop rond de gemeenschappelijke galgang (figuur 2Biii).
      OPMERKING: Kies een gebied voor de knoop halverwege tussen het hilarische gebied en de sluitspier van Oddi en op enige afstand van de poortader, zodat nadat de hechting rond de gemeenschappelijke galweg is aangespannen, deze de poortaderinjectie niet zal verstoren.
   8. Houd de veerschaar plat tegen het gemeenschappelijke galkanaal om een schuine incisie te maken naar het gemeenschappelijke galkanaal op de plek waar het gemeenschappelijke galkanaal de pancreas en darm binnenkomt naast de sluitspier van Oddi. (Figuur 2Biv), gele stippellijn omlijnt de sluitspier van Oddi-gebied, benadrukt door zwarte pijlpunten).
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Maak een schuine en geen transversale snede en maak een incisie; breek de galwegen niet af. Het doorsnijden van het gehele galkanaal maakt het inbrengen van de slang zeer uitdagend.
   9. Meng vlak voor gebruik 1 ml van de gele hars met 50 μL van het uithardingsmiddel (door de spuit van 1 ml te vullen en te legen) en vul een luerspuit van 1 ml met het mengsel hars - uithardingsmiddel.
   10. Sluit de gevulde spuit aan op de slang (set #1). Druk op de zuiger om de slang volledig te vullen. Zorg ervoor dat het mengsel van hars/uithardingsmiddel uit de punt van de slang druipt.
       OPMERKING: Vermijd en verwijder bubbels in de spuit en slang voor het beste resultaat.
   11. Maak met een tang het gebied rond de gemeenschappelijke galwegincisie recht en steek de slang in de opening in het gemeenschappelijke galkanaal (figuur 2Bv), met de langste rand van de afgeschuinde punt naar beneden naar de dorsale kant van het galkanaal. Deze oriëntatie zorgt ervoor dat hars de naar boven gerichte opening van de buis in het kanaal kan verlaten (figuur 2Bv).
   12. Draai de zijden draadknoop aan om de slang in het gemeenschappelijke galkanaal vast te zetten (figuur 2Bvi).
   13. Injecteer de hars in het gemeenschappelijke galkanaal. Observeer de galblaas en de individuele leverkwabben.
   14. Masseer de lever met een pbs-bevochtigd wattenstaafje om de hars gelijkmatig te verspreiden. De terminale takken van met hars gevulde galwegen (bij wildtype muizen) zijn vaag zichtbaar aan het leveroppervlak.
       OPMERKING: De verwachte tijd om de lever te vullen is 30 -100 s.
   15. Stop met het injecteren van de hars wanneer er stippen hars verschijnen aan het oppervlak van de lever (figuur 2Ci, blauwe pijlpunten) of wanneer weerstand wordt bereikt.
       OPMERKING: Werk zo snel mogelijk omdat de hars begint uit te harden na het toevoegen van het harsuithardingsmiddel. De werktijd na het toevoegen van het uithardingsmiddel is ongeveer 15 min.
   16. Verwijder de slang door deze uit het gemeenschappelijke galkanaal te trekken en draai de zijden knoop snel aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt. Snijd de losse uiteinden van de zijde hechtdraad weg, zodat ze de poortaderinjectie niet verstoren.
   17. Gooi de buis met hars en de resterende hars weg in het gevaarlijke afval en de naald in het naaldafval.
3. Harsinjectie - Portal aderharsgieten
   1. Verwijder de poortader (gebied ~ 5 mm) van het omliggende weefsel ongeveer 2 cm van de binnenkomst in de lever met behulp van een rechte tang. Plaats zijden hechtdraad (maat 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lang) onder het vrijgemaakte gebied van de poortader (figuur 2Ci) en bind een losse bovenhandse knoop (figuur 2Cii).
   2. Maak een longitudinale incisie in de poortader distal naar de lever en de knoop (figuur 2Ciii).
   3. Meng 1 ml van de groene hars met 50 μL van het uithardingsmiddel (door het vullen en legen van een spuit van 1 ml) en vul de luerspuit van 1 ml met het mengsel van het harsuithardingsmiddel.
   4. Sluit de gevulde spuit aan op de slang (set #2 voor >P30 muizen, nieuwe set #1 voor OPMERKING: Vermijd en verwijder bubbels in de spuit en slang voor het beste resultaat.
   5. Maak met een tang de poortader recht door het omliggende weefsel naar de experimentator te trekken en breng de slang met de langste rand van de afgeschuinde punt naar de dorsale kant van het vat (figuur 2Ciii).
   6. Span de zijden draad aan om de slang in de poortader vast te zetten.
   7. Injecteer de hars in de poortader. Observeer hoe de bloedvaten zich vullen met hars. Masseer de lever met een pbs-bevochtigd wattenstaafje om de hars gelijkmatig te verspreiden (figuur 2Civ).
   8. Stop met het injecteren van de hars wanneer alle bloedvaten gevuld zijn (uiteinden van poortaders zijn zichtbaar aan de leverrand) of wanneer weerstand wordt bereikt.
      OPMERKING: Werk snel omdat de hars begint uit te harden na toevoeging van het uithardingsmiddel. De werktijd na het toevoegen van het uithardingsmiddel is ongeveer 15 minuten voor injectieset #1 en 25 min voor injectieset #2.
   9. Verwijder de slang door de slang uit de poortader te trekken en draai de zijdeknoop snel aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt.
   10. Gooi de buis met hars en de resterende hars weg in het gevaarlijke afval en de naald in het naaldafval.
4. Leverdissectie en fixatie
   1. Ontleed de hele lever door deze weg te snijden van het omliggende weefsel en het middenrif.
   2. Plaats de hele lever voorzichtig in een lege conische buis van 50 ml met de ventrale kant naar boven gericht en de dorsale kant rustend op de wand van de conische buis om vervorming van de lever te voorkomen. Bewaar de conische buis een nacht horizontaal bij 4 °C zodat de hars volledig is uitgehard.
      OPMERKING: Elke container die groot genoeg is om in de lever te passen, kan worden gebruikt in plaats van 50 ml conische buis. Het gebruik van een container met platte bodem verhoogt de kans dat de lever niet wordt vervormd.
   3. Scheid de lever in individuele lobben. Maak een selectie van de lobben die zullen worden gebruikt voor microCT-analyse (1.4.4-1.4.5) of kwaliteitscontrole (1.4.6-1.4.8). Gebruik optioneel de hele lever voor zowel optische clearing als microCT zonder deze in individuele lobben te scheiden.
      OPMERKING: De leverarchitectuur van de galwegen en het vasculaire systeem is in elke kwab anders en daarom zijn gematchte kwabanalyses vereist. De optische clearing interfereert niet met microCT-scanning en de kwab (en) die voor kwaliteitscontrole worden gebruikt, kunnen vervolgens worden gescand met microCT. Omgekeerd kunnen monsters die met microCT zijn gescand, vervolgens optisch worden gewist voor vergelijking. De hele leveranalyse is dus mogelijk. Bij wild-type muizen (C3H/C57bl6 genetische achtergrond) wordt de rechter mediale kwab eerst gevuld door harsinjecties, waardoor dit een geschikte kwab is voor microCT-analyse, met de hoogste reproduceerbaarheid. De linker laterale kwab is de grootste kwab, waarbij het dus eenvoudig is om vooraf te screenen op injectiekwaliteit. De selectie van de kwab (of hele lever) die wordt gebruikt voor kwaliteitscontrole en microCT-scanning is afhankelijk van het diermodel en de onderzoeksvraag.
   4. Bereid in een geventileerde kap 4% formaldehyde-oplossing (10 -20 ml per buis). Bevestig de voor microCT gebruikte lobben een nacht met 4% formaldehyde bij 4 °C en was daarna eenmaal met PBS (10 -20 ml per buis).
   5. Verzamel formaldehydeafval in een aparte container. Houd de leverlobben in PBS op 4 °C voor korte opslag of 70% ethanol voor langdurige opslag. Ga verder met sectie 2: Micro-computertomografie.
      LET OP: Formaldehyde veroorzaakt acute toxiciteit bij inslikken, inademen of contact met de huid. Formaldehyde is een brandbare vloeistof en damp. Het veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging. Kan een allergische huidreactie veroorzaken. Fataal bij inademing (geconcentreerd of in poedervorm). Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Verdacht van het veroorzaken van genetische defecten. Kan kanker veroorzaken. Veroorzaakt schade aan organen (ogen, centraal zenuwstelsel). Voorzorgsmaatregelen - uit de buurt houden van hitte, hete oppervlakken, vonken, open vuur en andere ontstekingsbronnen. Niet roken. Draag beschermende handschoenen en beschermende kleding. In geval van morsen, doe onmiddellijk alle kleding uit die besmet was. Bij contact met de huid: spoel het besmette gebied af met water. Bij inademing: verwijder de persoon naar frisse lucht en controleer de ademhaling indien comfortabel. Bel onmiddellijk een antigifcentrum / arts. Indien in de ogen: spoel de ogen enkele minuten met water. Verwijder indien aanwezig en mogelijk contactlenzen.
   6. Voor kwaliteitscontrole fixeert u de resterende lobben (ten minste één) met 50% methanol (gemengd met gedeïoniseerd water) gedurende minimaal 4 uur, schommelend bij kamertemperatuur, gevolgd door 100% methanol 's nachts schommelen bij kamertemperatuur. Verzamel methanolafval in een aparte container.
      LET OP: Methanol veroorzaakt acute toxiciteit bij inslikken, inademen of contact met de huid. Methanol is een brandbare vloeistof en damp. Draag beschermende handschoenen en kleding. Vermijd ademhalen bij het hanteren en blijf uit de buurt van vuur en hitte. Was de huid grondig na gebruik. In geval van morsen, doe onmiddellijk alle vervuilde kleding uit. Spoel de huid af met water. Indien ingeademd: Verwijder de persoon naar frisse lucht en blijf comfortabel ademen. Als u wordt ingeademd, ingeslikt of blootgesteld, belt u een gifcentrum / arts.
   7. Bereid in een geventileerde kap benzylalcohol en benzylbenzoaat (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml per lob) oplossing.
   8. Plaats de leverkwab in een polypropyleenbuis van 15 of 50 ml (afhankelijk van de grootte van de kwab) met BABB-oplossing. Laat het op kamertemperatuur schommelen tot het transparant is. Deze stap kan tussen de 2-16 uur duren, afhankelijk van de grootte van de lob.
      OPMERKING: De BABB-oplossing lost bepaalde soorten plastic op. Het is veilig om de monsters op te slaan in polypropyleen buizen of glazen containers.
      LET OP: Benzylbenzoaat kan acute toxiciteit veroorzaken bij inslikken. Het is giftig voor het waterleven met langdurige effecten. Voorzorgsmaatregelen: was de huid grondig na het hanteren. Het is schadelijk bij inslikken, in contact met de huid of ingeademd. Vermijd het inademen van dampen/ dampen. Was de handen grondig na het hanteren. Niet eten, drinken of roken bij gebruik van dit product. Indien ingeslikt - bel een gifcentrum / arts als u zich niet goed voelt Gebruik in geventileerde ruimtes. Verzamel morsen. Gooi de inhoud/container naar een erkende afvalverwijderingsinstallatie.
   9. Controleer de kwaliteit van de injectie. Alleen goed geïnjecteerde lever moet worden gescand met microCT.

2. Micro-computertomografie

1. Monstervoorbereiding
   1. Bereid 1% agarosegel door 100 ml gedestilleerd water en 1 g agarosepoeder te mengen. Plaats het mengsel in een magnetron en kook de oplossing totdat het agarosepoeder is opgelost.
   2. Temper de 1% agarose gel tot ~40 °C om thermische schade aan het levermonster te voorkomen.
   3. Plaats de betreffende lobben in een conische buis van 15 ml en vul deze met de 1% agarosegel tot ongeveer 2/3 van het totale volume van de buis. Deze stap minimaliseert ongewenste monsterbewegingen tijdens CT-metingen.
2. CT-meting
   OPMERKING: De volgende stappen zijn afhankelijk van het CT-apparaat en specifieke instellingen en acties kunnen verschillen voor verschillende CT-apparaten en fabrikanten. In dit protocol was de gebruikte microcomputertomografiescanner uitgerust met een nanofocus röntgenbuis (180 kV/15 W) en flat-panel dynamische 41|100 (4048 px x 4048 px, pixelgrootte 100 mm met binning 2) voor de CT-metingen.
   1. Monteer de conische buis van 15 ml met het monster op de rotatietrap van een CT-apparaat en laat het zich gedurende ten minste 1 uur thermisch aanpassen aan de meetkamer.
   2. Wanneer het monster thermisch is aangepast, centreert u het in het gezichtsveld (FOV).
   3. Optimaliseer de afstanden tussen bronmonster en monsterdetector (SSD, SDD) om voldoende voxelresolutie te bereiken, bijvoorbeeld 12 μm voor een volwassen muizenlevermonster of 6,5 μm voor
   4. Stel de acquisitieparameters in (d.w.z. versnellende spanning en stroom, blootstelling, binning, middeling) volgens de aanbevelingen van de fabrikant van het CT-apparaat om een voldoende niveau van gedetecteerd signaal te bereiken. Deze parameters zijn niet alleen CT-apparaatafhankelijk, maar ook monsterafhankelijk en moeten voor elk monster worden geoptimaliseerd. In Hankeova et ^al.9 waren de instellingen: 80 kV versnellingsspanning, 160 μA versnellende stroom, 400 ms belichtingstijd en 2000 beelden.
   5. Start een CT-meting. Gebruik een speciale tomografische reconstructiesoftware om de CT-gegevens te reconstrueren.

3. Analyse en datasegmentatie

OPMERKING: De volgende stappen zijn afhankelijk van beeldverwerkingssoftware; specifieke instellingen en acties kunnen verschillen afhankelijk van de gebruikte software.

1. De CT-gegevens laden: Selecteer Bestand > opdracht Importeren >. Een verdere selectie is afhankelijk van het specifieke formaat van de te verwerken CT-gegevens.
2. Gebruik de functie Oppervlaktebepaling op het bovenpaneel om de hars in de gegevens te segmenteren met behulp van globale drempelwaarden. Bepaal in het dialoogvenster de drempelwaarde met histogramevaluatie door de positie van de rode lijn "Isowaarde" in te stellen om alleen de met hars gevulde vaten te segmenteren (d.w.z. de gele lijn in het gepresenteerde deelvenster "Voorbeeld") (figuur 3A).
3. Selecteer in het linkerdeelvenster de module ROI maken van volume/CAD/mesh om een interessegebied (ROI) van de met hars gevulde vaten te maken. Gebruik in het dialoogvenster de optie ROI(s) maken vanuit Solid, selecteer de naam van het verwerkte volume en bevestig.
4. Elimineer foutieve segmentatie van ruisclusters in het achtergrondgebied van deze ROI. Markeer deze ROI in het rechterdeelvenster, klik er met de rechtermuisknop op en selecteer de module Split ROI.
5. Stel in het dialoogvenster de parameter Minimum Volume [voxel] in om alle ruisdeeltjes uit te sluiten - deze waarde is experiment- en gegevensafhankelijk en moet worden geoptimaliseerd voor elk te analyseren monster (figuur 3B).
6. Creëer gladde, continue en solide kanaalmaskers zonder artefacten in de roi van het harsgieten - bijvoorbeeld aanwezigheid van luchtbellen of harslekkage.
7. Gebruik in het linkerdeelvenster de module Afvlakken, stel de parameter Afvlaksterkte in op 1 of 2 (afhankelijk van de individuele gegevens, wanneer hogere waarden kunnen leiden tot modelvervorming, vooral bij het omgaan met fijne structuren). Voer dit proces indien nodig twee keer uit (afbeelding 3C).
8. Identificeer en scheid de afzonderlijke buisvormige systemen in het gesegmenteerde harsmasker.
   1. Creëer een afzonderlijke ROI voor het systeem gevuld met de meer absorberende hars (de gele hars die wordt gebruikt voor de gemeenschappelijke galweginjectie) met hogere intensiteitswaarden in de CT-gegevens. Volg de procedure die wordt beschreven in stap 3.2. (Figuur 3Di).
   2. Markeer de nieuwe ROI en de ROI van het harsmasker, klik met de rechtermuisknop en selecteer ROI(S) aftrekken en trek de nieuwe ROI af van de ROI van het harsmasker om een nieuwe ROI te creëren voor het resterende buisvormige systeem (Figuur 3Dii, iii).
9. Exporteer de resulterende ROI's voor beide buissystemen in verschillende formaten, op basis van de voorkeuren van de operator, voor verdere verwerking in verschillende software. Verwerk verder de resulterende ROI's in een volumegrafische software om de uiteindelijke visualisatie in de vorm van een afbeelding of een video te exporteren.

Resultaten

Wat te doen
Succesvolle dubbele harsinjectie wordt bereikt wanneer zowel de intrahepatische galwegen als de poortader vasculatuur goed gevuld zijn. Als een kwaliteitscontrolestap maakt het opruimen van één kwab (bijvoorbeeld de linker laterale kwab) verificatie van een succesvolle injectie mogelijk, gevolgd door beeldvorming van interessante lobben. De optisch geklaarde kwab kan later worden gescand met behulp van microCT; daarom is het mogelijk om de hele lever optisch te zuiveren. In goed geïnjecteerde muizenlever moet de poortader vasculatuur worden gevuld met hars totdat de leverrand en hars zichtbaar moeten zijn in zijtakken (figuur 4), en deze architectuur wordt getrouw samengevat in microCT gescande en gesegmenteerde gegevens. Verder moeten goed geïnjecteerde intrahepatische galwegen zichtbaar zijn naast de hoofdportaaladertakken die zich bijna tot aan de periferie uitstrekken, en hars moet zichtbaar zijn in de belangrijkste zijtakken. Als de controlekwab de kwaliteitscontrolestap doorstaat, kunnen de betreffende lobben (inclusief de optisch gewiste) worden gescand met microCT. Het resultaat van de gesegmenteerde gegevens van een goed geïnjecteerde lever wordt getoond voor een P15-muis (figuur 4A,B) en een volwassen muis (figuur 4C,D).

Wat niet te doen
Intact leverweefsel is een voorwaarde voor een succesvolle injectie. Wees extra voorzichtig bij het doorsnijden van de buikholte en het middenrif om niet per ongeluk het leverweefsel te snijden. Als er tijdens deze procedure fysieke schade aan de lever is, is de kans groot dat de hars uitlekt tijdens de injectie van de poortader (figuur 5A). Het is niet mogelijk om een goede injectie van het vasculaire systeem te bereiken als de lever fysiek beschadigd is.

Een van de meest voorkomende fouten is het ondervullen van de lever met hars, wat kan leiden tot uitdagingen voor visualisatie of analyse. Een van de oorzaken voor ondervulling van het systeem is voortijdig verharden van hars in de naald of de punt van de slang voordat de injectie is voltooid (figuur 5B, blauwe pijlpunten, beugels tonen grote bellen). Een goede gewoonte is om één injectieset per dier te gebruiken en snel te werken nadat het uithardingsmiddel aan de hars is toegevoegd. Als de hars uithardt tijdens de injectie (wat kan worden waargenomen door een half gevuld systeem, hier geïllustreerd met een half gevulde poortader vasculatuur) verwijder dan de slang, snijd de punt van de buis (altijd diagonaal om een afgeschuinde punt te creëren) en duw op de zuiger. Als de hars weer begint te druppelen, breng dan voorzichtig de slang opnieuw in en zet deze vast met de hechtdraad. Als de hars in de naald is uitgehard, vervang dan de slang volledig, vul deze met hars (vermijd bubbels), plaats de slang voorzichtig opnieuw en zet deze vast met de hechting. Het kan een uitdaging zijn om de slang te vervangen, vooral bij jonge postnatale muizen figuur 5C, blauwe pijlpunten duiden op bloed dat zichtbaar is in terminale takken). Dit kan worden waargenomen wanneer de uiteinden van de bloedvaten zijn gevuld met bloed in plaats van hars. Om dit te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de poortader (buiten de lever) vóór de injectie geen bloed bevat. De derde oorzaak van ondergevulde lever is wanneer de slang te diep in de lever wordt ingebracht en een tak naar een van de lobben binnendringt. Om dit te voorkomen, plaatst u de slang op minimaal 0,5 cm van de ingang naar de lever.

Omgekeerd raken één of beide systemen overvol met hars (figuur 5D). Het is noodzakelijk om de lever visueel te controleren tijdens de injectie. Galsysteemgieten met hars is uitdagender dan portaaladerharsgieten, omdat met hars gevulde kanalen slechts vaag zichtbaar zijn op het leveroppervlak en het moeilijk is om te beoordelen wanneer het systeem bijna vol is en wanneer moet worden gestopt. Wanneer kleine gele harsstippen op het leveroppervlak verschijnen (figuur 2Ci, blauwe pijlpunt), is dit een teken dat het galsysteem volledig is gevuld en de hars uit de kanalen begint te lekken. Kleine harslekkage kan handmatig worden gecorrigeerd tijdens microCT-gegevenssegmentatie (figuur 5D, rechterpanelen).

Als de injectiedruk te hoog is, kan dit ertoe leiden dat vaten of kanalen scheuren (figuur 5E), waardoor de vat- of kanaalarchitectuur onomkeerbaar wordt beschadigd. De lever zal niet geschikt zijn voor microCT-scanning of -analyse. Om overvulling van hars te voorkomen, optimaliseert u het juiste volume en de juiste druk die worden gebruikt voor injectie in elk muismodel. Bij het werken met muizen die zijn uitgedaagd met een toxisch dieet, genetische modificatie of leverbeschadiging die de gal- of veneuze systemen beïnvloedt, of leverstijfheid, moeten de injectiedruk en het volume mogelijk worden aangepast omdat het toegestane volume en de druk kunnen verschillen van de muizen van het wilde type. Dit protocol beschrijft de handmatige injectie van de twee systemen, maar het is mogelijk om de spuit aan te sluiten op een pomp om de injectiedruk te standaardiseren. Bubbels zijn een ander veel voorkomend injectieartefact dat leidt tot schaarse vulling van de buisvormige netwerken (figuur 5F-H, blauwe pijlpunten). Om bubbelvorming te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de spuit en de slang geen bubbels bevatten, volledig gevuld zijn met hars en dat de hars vóór de injectie uit de punt van de slang druppelt. Kleine bubbels die als negatieve gebieden op de microCT-gegevens verschijnen, kunnen handmatig worden gecorrigeerd tijdens nabewerkingsstappen, hoewel dit bewerkelijk is.

Vers is het beste
Het gebruik van verse gele hars is een cruciale factor, die het contrast van de twee harsen en de microCT-gegevenssegmentatie aanzienlijk beïnvloedt. Wanneer de vers geopende hars wordt gebruikt (figuur 6A) is er een duidelijk verschil in contrast tussen de gele hars geïnjecteerde galkanalen (helder wit) en de groene hars geïnjecteerde poortaders (heldergrijs). Lever die wordt geïnjecteerd met verse hars wordt gemakkelijk verwerkt met behulp van geautomatiseerde globale drempels. Bij langdurige opslag slaat de hars neer en neemt het contrast af. Na 3 maanden opslag kan het contrast nog steeds voldoende zijn om de poortader van de galweg te onderscheiden (figuur 6B), maar neerslag beïnvloedt de vermenging van de twee harsen, wat zichtbaar is als een heterogene opaciteit in de gevulde poortader (fig. 6B, blauwe pijlpunten). Heterogeen contrast heeft een negatieve invloed op de geautomatiseerde drempelvorming en vereist handmatige correcties, waardoor de verwerkingstijd toeneemt. Als de hars ouder is dan zes maanden, is het contrast afgenomen tot een punt waarop het niet mogelijk is om het geel geïnjecteerde galkanaal te onderscheiden van de groen geïnjecteerde poortader op basis van hun contrast alleen (figuur 6C). In dit geval moeten de galweg en de poortader handmatig worden gesegmenteerd op basis van hun diameter en positie in het hilargebied en handmatig worden gevolgd door de volledige microCT-gegevens. Deze procedure is uiterst tijdrovend en kan het beste worden vermeden.

Figuur 1: Injectieset voor harsgieten. (A) Injectieset #1 bestaat uit een naald van 30 G en een PE10-slang van ~ 30 cm lang. Injectieset #2 bestaat uit een naald van 23 G en een PE50-slang van ~ 30 cm lang. (B) De punt van de buis wordt uitgerekt en onder een hoek gesneden om een afgeschuinde punt te creëren. De liniaal in A en B is een centimeterliniaal, met grote stappen van 1 cm, tussenstappen van 5 mm en kleine stappen van 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Dubbel hars gietstroomschema. (A) Schema met de muriene veneuze bloedsomloop en het hart met gemarkeerde rechteratrium, die vóór de perfusie moet worden weggesneden, en de linker ventrikel waarin de naald moet worden ingebracht voor perfusie om het bloed uit de bloedsomloop weg te spoelen. De inferieure vena cava moet onder de nieren worden doorgesneden om de vasculaire druk te verlichten. (B) Stroomschema voor de injectie van galweghars. (i) Zoomafbeelding van (A) die aangeeft waar de IVC moet worden gescheiden. (ii) Afbeelding van het gemeenschappelijke galkanaal (gele stippellijn) van het leverarische gebied naar de sluitspier van Oddi (zwarte pijlpunten), met hechtdraad onder het vrijgemaakte gemeenschappelijke galkanaal. (iii) Geschikte positie voor losse bovenhandse knoop rond gemeenschappelijke galwegen. iv) De gele stippellijn en zwarte pijlpunten labelen de sluitspier van Oddi, waarbij de schuine hoek voor incisie wordt aangegeven en hoe de opening eruit moet zien na de schuine hoekincisie. v) Schema dat de oriëntatie van de schuine opening van de PE10-buis (naar boven) bij het inbrengen aangeeft. vi) uiterlijk van gele hars die wordt geïnjecteerd; hars moet gemakkelijk de losjes gebonden knoop passeren. IVC, inferieure vena cava; CBD, gemeenschappelijke galwegen. (C) Stroomschema voor de injectie van portaaladerhars. (i) De groene stippellijn markeert de poortader van het hilargebied. De blauwe pijlpunten labelen het overvolle galsysteem. (ii) Geschikte locatie voor losse overhandse knoop rond portaalader. iii) Schematische weergave van de schuine opening (naar boven) bij het inbrengen. iv) Uiterlijk van lever bij injectie van groene hars en gele hars; let op het met hars gevulde bloedvat in de leverrand. PV, portaalader. Figuur 2A is gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Micro CT-gegevensverwerking in volumegrafische software. (A) Oppervlaktebepaling, (i) overschatte isowaarde (huidige preview van selectie wordt weergegeven in gele kleur), (ii) onderschatte isowaarde, (iii) optimale selectie van isowaarde voor een goede oppervlaktebepaling van poortader en galwegen. (B) Het splitsen van het interessegebied (ROI) gecreëerd door oppervlaktebepaling, (i) stel de waarde in het dialoogvenster hoog genoeg in dat er slechts één segment (het grootste) overblijft, (ii) in gele frames worden de kleinere (uitgesloten) deeltjes weergegeven. (C) Oppervlakteafvlakking van de gegevens, (i) afvlakkingsfunctie bevindt zich in het linkerdeelvenster, (ii) stel de afvlakkingssterkte in op 1 (max. 2) en creëer nieuwe vloeiende ROI, (iii) afgevlakte gegevens. (D) Scheiding van individuele buisvormige systemen, (i) in oppervlaktebepalingsfunctie de isowaarde zo instellen dat alleen het galsysteem bij de selectie wordt opgenomen (het huidige voorbeeld van de selectie wordt in gele kleur weergegeven), (ii) markeer de ROI van beide systemen en roi van alleen het galsysteem en trek de ROI van het galsysteem af van de ROI van beide systemen, iii) Portaalader in grijs weergegeven, de galwegen in groen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Goed geïnjecteerde galweg (BD) en portalader (PV) systemen. (A) Optisch geklaarde rechter mediale kwab (RML) van postnatale dag 15 (P15) lever geïnjecteerd met twee harsen in de twee systemen. Schaalbalk 1 mm. (B) 3D-weergave van P15 RML weergegeven in (A) met weergave van portaaladervaculaire in wit en galsysteem in groen. Schaalbalk 1 mm. (C) Optisch geklaarde RML van volwassen lever geïnjecteerd met twee harsen in de twee systemen. Schaalbalk 1 mm. (D) 3D-weergave van volwassen RML weergegeven in (C) met weergave van portaaladervaculaire in wit en galsysteem in groen. H = hilar, P = perifeer. Schaalbalk 1 mm. Panelen A, B, D zijn aangepast met toestemming van Hankeova et ^al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Veelvoorkomende uitdagingen van leverinjecties met dubbele hars. (A) De afbeelding toont een lever die per ongeluk werd geknepen tijdens de eerste opening van de buikholte en de hars lekt door de snede (blauwe pijlpunt). (B) Slecht geïnjecteerd poortadersysteem als gevolg van harsverharding. Blauwe pijlpunten labelen lege terminaltakken en rode haakjes labelen grote bubbels. Schaalbalk 1 mm. (C) Slecht geïnjecteerd poortadersysteem als gevolg van slechte transcardiale perfusie. Blauwe pijlpunten labelen bloed dat zichtbaar is in de terminale takken. Schaalbalk 1 mm. (D) Overgevuld galsysteem gemanifesteerd door geïsoleerde bolletjes hars. De linkerpanelen tonen de optisch geklaarde lever en de rechterpanelen tonen het 3D microCT-gerenderde beeld. De blauwe stippellijnen geven zoomgebieden weer. De zwarte pijlpunten labelen een deel van de lever dat beschadigd is geraakt tijdens het optisch opruimen na microCT-scanning. Schaalbalk 1 mm. (E) Hoge druk tijdens harsinjectie kan scheuring van de poortader veroorzaken (het dier in dit paneel draagt een Jag1H268Q-mutatie), gemarkeerd door blauwe pijlpunten. Schaalbalk 1 mm. (F) Bellen in de hars tijdens poortaderinjectie (blauwe pijlpunten) en (G) galweginjectie (blauwe pijlpunt), schaalbalk 1 mm. (H) MicroCT-scan van bellen (blauwe pijlpunt), slecht gevulde eindtakken (rode haakjes) en harslekkage (gele pijlpunt), schaalbalk 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Differentieel harscontrast. (A) Vers geopende gele hars genereert voldoende contrast om hars geïnjecteerde poortader (grijs) en galwegen (wit) te onderscheiden. (B) Drie maanden opslag van gele hars leidt tot neerslag van de hars, wat resulteert in heterogene opaciteit (grijswitte poortader, blauwe pijlpunt). (C) Langdurige opslag (>6 maanden) van gele hars vermindert het contrast tussen de poortader (grijs) en galwegen (grijs). Schaalbalk 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Verschillende kritische stappen bepalen het succes van DUCT, van monstervoorbereiding tot de parameters van het CT-apparaat. Om de beste resultaten te bereiken, moet goed contrasterende, goed geïnjecteerde en bubbelvrije hars worden gebruikt om eenvoudige digitale verwerking met geautomatiseerde drempels mogelijk te maken om 3D-gegevens, afbeeldingen en films te verkrijgen. Met training en het volgen van dit protocol is 90% van de injecties succesvol en resulteert dit in reproduceerbare gegevens. Het is belangrijk om verse gele hars te gebruiken om het beste contrast tussen de twee geïnjecteerde systemen te bereiken. De gele hars heeft een zeer sterke radiopaciteit, terwijl de blauwe hars een niet-detecteerbare radiopaciteit heeft. Topresultaten worden behaald binnen de eerste drie maanden na het openen van een nieuwe gele harsfles. Na verloop van tijd slaat hars neer en na langere opslag (>6 maanden) zullen de gele en de groene harsen niet langer te onderscheiden zijn in CT-scans. Beelden met een slecht contrast vereisen uitgebreide en tijdrovende handmatige tracering en segmentatie van de twee systemen. Vervolgens zijn goed uitgerekte buizen onmisbaar om te passen in het gemeenschappelijke galkanaal van volwassen muizen en het gemeenschappelijke galkanaal en de poortader van postnatale muizen. Het toegangspunt voor de injectie moet met zorg worden gecreëerd. Als het gemeenschappelijke galkanaal transversaal wordt opengesneden, zal het waarschijnlijk loskomen van het omliggende weefsel, waardoor een succesvolle binnenkomst van de slang wordt voorkomen. Deze stap is vooral delicaat voor postnatale muizen waarbij het gemeenschappelijke galkanaal zich terugtrekt en "opkrult" als het zich heeft losgemaakt van het omliggende weefsel, waardoor het inbrengen van de slang uiterst uitdagend is. De gemeenschappelijke galweginvoer en injectie kan enige oefening vereisen. Tijdens het voorbereiden van de slang met hars en tijdens de injectie, vermijd bubbelvorming, omdat bubbels negatieve ruimte creëren in de CT-beelden en tijdrovende handmatige correctie vereisen. Het is belangrijk om de lever zachtjes te masseren door tijdens en na de injectieprocedure met een bevochtigd wattenstaafje over het oppervlak te rollen, omdat dit een gelijkmatige harsverspreiding vergemakkelijkt. Na de voltooiing van de injectie en het verwijderen van de slang, moet de zijden hechtknoop snel en voorzichtig worden aangespannen, zodat de hars niet uit de lever stroomt voordat deze volledig polymeriseert. Voor succesvolle microCT-beeldvorming moet het monster op de juiste manier op zijn plaats worden gefixeerd met agarose en thermisch worden aangepast om bewegingsartefacten in de CT-gegevens te elimineren. De acquisitie-instellingen zijn ook van cruciaal belang, die moeten worden geoptimaliseerd om een adequate ruimtelijke resolutie te bereiken om fijne structuren op te lossen.

Technische wijzigingen in de injectieprocedure kunnen worden aangebracht om injectie bij jongere muizen te bereiken. Momenteel wordt het harsgieten van jongere muizenlevers beperkt door de beschikbaarheid van voldoende dunne buizen, waarbij PE10 de kleinste commercieel verkrijgbare buis is. Tanimizu et al. injecteerden met succes koolstofinkt in embryonale dag 17 (E17) gemeenschappelijke galwegen met behulp van glazen ^haarvaten11. Toekomstige testen of hars via glazen capillair kan worden geleverd, zou daarom van belang zijn. DUCT werd verder aangepast om andere buisvormige systemen te injecteren, zoals de luchtwegen en de longslagadervaculatuur van de ^longen9. De dubbele harsinjectie kan ook worden aangepast om te worden gebruikt met andere in de handel verkrijgbare harsen, of dit protocol kan worden gebruikt voor injecties met koolstofinkt.

Een van de belangrijkste beperkende factoren van de DUCT-pijplijn is de viscositeit van de hars. DUCT kan alleen worden gebruikt voor het gieten van hars van buisvormige structuren boven een diameter van 5 μm. In deze dataset kon de hars buizen binnendringen met de kleinste diameter van 5 ^μm9. Deze groottebeperking sluit de analyse van fijne ductules en kleine haarvaten uit. Om de DUCT-pijpleiding verder te ontwikkelen naar vaten van kleiner kaliber, moeten andere commercieel verkrijgbare harsen worden getest, of de ontwikkeling van nieuwe radiopaquemiddelen met lage viscositeit kan de lumenpenetratie verbeteren.

In Hankeova et ^al.9 werd DUCT vergeleken met twee andere veelgebruikte technieken, dubbele koolstofinktinjecties gevolgd door weefselverwijdering en standaardfotografie, en iDISCO+ met kleuring van de bloedvaten met alfa-gladde spiercelactine en galwegen met cytokeratine 7, gevolgd door 3D-beeldvorming9. DUCT presteerde beter dan de andere twee methoden in termen van dubbele analyse (wat een uitdaging was voor iDISCO + vanwege hoge leverautofluorescentie), 3D-beeldvorming en kwantificering (niet mogelijk met koolstofinktinjectie) en lumenisatie (DUCT levert gegevens voor de interne lumenarchitectuur en systeemperfusie). Zoals hierboven vermeld, is de belangrijkste beperking van DUCT de minimale lumengrootte die kan worden geïnjecteerd en geanalyseerd (limiet van 5 μm), een parameter waarin zowel koolstofinktinjectie als iDISCO + beter presteerden. DUCT is superieur aan harsgieten met één ^systeem3,5,6 omdat het analyse van elk geïnjecteerd systeem afzonderlijk mogelijk maakt en ook dubbel 3D-onderzoek mogelijk maakt om de architecturale relatie tussen de twee systemen te bestuderen.

DUCT kan worden toegepast om twee buisvormige netwerken in 3D te bestuderen. Als proof of principle werd DUCT gebruikt om de leverbiliaire en poortadersystemen en de longslagader vasculatuur en luchtwegen in de longen te ^{visualiseren9}. De intrahepatische galwegen ontwikkelen zich naast de poortader en de poortader biedt een structureel sjabloon en signaleringscentrum dat de groei en differentiatie van de galboom ^reguleert12. In Hankeova et ^al.9 onderzocht DUCT galregeneratie in een muismodel voor de menselijke pediatrische ziekte Alagille-syndroom. DUCT onthulde niet eerder gerapporteerde architecturale mechanismen die het galsysteem gebruikte om een wild-type-achtig volume te ^bereiken9. De Alagille-syndroommuizen gebruikten twee verschillende strategieën: (1) in de hilarische en centrale regio's van de lever verhoogde het galsysteem zijn vertakking en (2) in de leverrand waren de de novo gegenereerde galwegen zeer kronkelig. Deze twee factoren samen leverden een bijna normaal galsysteemvolume op, ondanks de abnormale architectuur. Bovendien detecteerde DUCT abnormale galkanaalvertakkingen die onafhankelijk van poortadervertakkingen optraden en galwegen die verbindingsbruggen vormden tussen twee ^poortaders9. Deze fenotypen zouden onmogelijk te detecteren zijn in enkelharsgieten en zouden verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd in 2D histologische secties als galwegproliferatie. DUCT levert dus gegevens die de 3D-architectuur van twee buisvormige netwerken op het hele orgaan- of kwabniveau beschrijven met de mogelijkheid van kwalitatieve en diepgaande kwantitatieve analyse. DUCT zou een nieuwe standaard kunnen zijn voor postnatale leverontwikkeling en leverregeneratieanalyses in verschillende diermodellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL SafeSeal micro tubes	Sarstedt	72.706
23 G butterfly needle with tubing	BD bioscience	367283
23 G needle	BD bioscience	305892
30 G needle	BD bioscience	305106
Agarose	Top-Bio	P045
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	108006
Benzyl benzoate	Sigma Aldrich	B6630
Corning 50 mL tubes	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	polypropylene
Cotton swabs	Medicarier	60406
Dissection Microscope	Leica Camera AG		Leica M60
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	14190144
Ethanol 70%	VWR	83801.41
Falcon tube 15 mL	Verkon	331.850.084.006
Forceps curved	Fine Science Tools	11051-10	Fine Graefe 10 cm curved
Forceps straight	Fine Science Tools	11050-10	Fine Graefe 10 cm straight
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240	Waygate Technologoies		micro computed tomography scanner
Hanks' Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14025092
Heparin	Leo Pharma	B01AB01	5000 IE/mL
Isolfurane	Baxter	FDG9623
Methanol	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL	Flowtech	MV-122	synthetic resin yellow
MICROFIL	Flowtech	MV-120	synthetic resin blue
MICROFIL	Flowtech	MV-diluent	clear resin diluent
Pasteur pipette	Verkon	130.690.424.503
Peristaltic pump	AgnThos	010.6131.M20
phoenix datos|x 2.0 software	Baker Hughes		CT data reconstruction software
Rocker	VWR	444-0142
Silk suture	AgnThos	14757	Black silk, 4-0, sterile, 100 m
Skin scissor	Fine Science Tools	14058-09	Iris straight tip 9 cm
Spring scissor	Fine Science Tools	15000-03	Vannas micro, straight tip 2 mm
Syringe 1 mL Luer	BD bioscience	303172
Tubing PE10	BD bioscience	427401
Tubing PE50	BD bioscience	427411
VG Studio MAX 3.3 software	Volume Graphics GmbH		CT data processing and analysis software