Methodenartikel

Microfluïdische fabricage van core-shell microcapsules met menselijke pluripotente stamcelsferoïden

DOI:

10.3791/62944

⸱

13 oktober 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft de inkapseling van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) met behulp van een co-axiale stroomfocusapparaat. We tonen aan dat deze microfluïdische inkapselingstechnologie een efficiënte vorming van hPSC-sferoïden mogelijk maakt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale (3D) of sferoïde culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) bieden de voordelen van verbeterde differentiatieresultaten en schaalbaarheid. In dit artikel beschrijven we een strategie voor de robuuste en reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden waarbij een co-axiale stroomfocusapparaat wordt gebruikt om hPSC's in kern-shell microcapsules te vangen. De kernoplossing bevatte eencellige suspensie van hPSC's en werd viskeus gemaakt door de integratie van poly(ethyleenglycol) met hoog molecuulgewicht (PEG) en dichtheidsgradiëntmedia. De schelpenstroom bestond uit PEG-4 arm-maleimide of PEG-4-Mal en stroomde langs de kernstroom naar twee opeenvolgende olieknooppunten. Druppelvorming vond plaats bij de eerste olieverbinding met shell-oplossing die zich rond de kern wikkelde. Chemische crosslinking van de schaal vond plaats bij de tweede olieverbinding door een di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol of DTT) in deze druppels te introduceren. De crosslinker reageert met maleimide functionele groepen via klikchemie, wat resulteert in de vorming van een hydrogelschaal rond de microcapsules. Onze inkapselingstechnologie produceerde capsules met een diameter van 400 μm met een snelheid van 10 capsules per seconde. De resulterende capsules hadden een hydrogel-schil en een waterige kern waarmee afzonderlijke cellen zich snel konden samenvoegen tot aggregaten en sferoïden konden vormen. Het proces van inkapseling had geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van hPSC's, met >95% levensvatbaarheid waargenomen 3 dagen na inkapseling. Ter vergelijking: hPSC's ingekapseld in vaste gelmicrodeeltjes (zonder een waterige kern) vormden geen sferoïden en hadden 3 dagen na inkapseling <50% levensvatbaarheid. Sferoïde vorming van hPSC's in kern-shell microcapsules vond plaats binnen 48 uur na inkapseling, waarbij de sferoïde diameter een functie was van de celinentingsdichtheid. Over het algemeen was de microfluïdische inkapselingstechnologie die in dit protocol wordt beschreven zeer geschikt voor hPSCs-inkapseling en sferoïdevorming.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is veel belangstelling voor 3D-culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) vanwege de verbeterde pluripotentie en differentiatiemogelijkheden die dit kweekformaatbiedt 1,2,3. hPSC's worden meestal gevormd tot sferoïden of andere 3D-cultuurformaten door middel van bioreactoren, microwells, hydrogels en polymere steigers 4,5,6. Inkapseling biedt een ander middel om enkele hPSC's in sferoïden te organiseren. Eenmaal ingekapseld kunnen hPSC-sferoïden gemakkelijk worden behandeld en overgebracht naar microtiterplaten voor differentiatie, ziektemodellering of experimenten met het testen van geneesmiddelen. Het inkapselen van hPSC's in een hydrogellaag beschermt cellen ook tegen afschuifschade en maakt het mogelijk om sferoïden in een bioreactor te kweken met hoge roersnelheden7.

Onze methodologie voor stamcelinkapseling evolueerde in de loop van de tijd. Ten eerste hebben we ons gericht op vaste hydrogel-microdeeltjes en succesvolle inkapseling en kweek van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) aangetoond)8. Er werd echter opgemerkt dat menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een lage levensvatbaarheid hadden wanneer ze werden ingekapseld in dergelijke hydrogel-microdeeltjes, vermoedelijk vanwege de grotere behoefte van deze cellen om cel-celcontacten na de inkapseling te herstellen. We redeneerden dat heterogene microcapsule, die een waterige kern bezit, beter geschikt kan zijn voor inkapseling van cellen die afhankelijk zijn van een snel herstel van cel-celcontacten. Het concept van co-axiale flowfocus microfluïdische apparaat voor het maken van waterige kern / hydrogel shell microcapsules werd aangepast van He et al.9, maar in plaats van alginaat dat in de oorspronkelijke benadering werd gebruikt, werd een peg-gebaseerde hydrogel in de schaal opgenomen. We toonden voor het eerst succesvolle inkapseling en sferoïde vorming van primaire hepatocyten in core-shell microcapsules10 en meest recent beschreven inkapseling van hES- en iPS-cellen7. Zoals beschreven in figuur 1A, worden capsules vervaardigd in een stroomfocusapparaat waarbij de shell- en kernstroomstromen overgaan van zijwaartse naar co-axiale stroom voordat ze in de oliefase worden uitgeworpen. De kernstroom bevat cellen en additieven die de viscositeit van de oplossing verhogen (niet-reactieve PEG MW 35kD en iodixanol - handelsnaam OptiPrep), terwijl de shell-stroom reactieve moleculen (PEG-4-Mal) bevat. Continue co-axiale stroomstroom wordt gediscretiseerd in druppels die de core-shell-architectuur behouden. De kern-schilstructuur wordt permanent gemaakt door blootstelling aan di-thiol crosslinker (DTT), die reageert met PEG-4-Mal via klikchemie en resulteert in de vorming van een dunne (~ 10 μm) hydrogelhuid of -schaal. Nadat de emulsie is gebroken en capsules in een waterige fase zijn overgebracht, diffunderen moleculen van PEG uit de kern en worden vervangen door watermoleculen. Dit resulteert in waterige kern en hydrogel shell microcapsules.

Hieronder vindt u stapsgewijze instructies voor het maken van microfluïdische apparaten, het voorbereiden van cellen en het inkapselen van hPSC's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricage van apparaten

  1. Maak de ontwerpen voor het micro-inkapselingsapparaat en dissociatieapparaat met behulp van CAD-software10,11.
  2. Spin-coat de drie lagen SU-8 fotoresist sequentieel op een silicium wafer (figuur 2A) om structuren te bereiken met de gewenste hoogtes: 60, 100 en 150 μm.
    OPMERKING: Het proces voor de bovenste en onderste mallen is identiek.
    1. Spin coat een schone 10 cm silicium wafer met SU-8 2025 negatieve fotoresist bij 1.100 rpm om de eerste 60 μm laag te creëren. Na een zachte bak bij 65 °C gedurende 3 minuten en 95 °C gedurende 10 minuten op een hete plaat, belicht u de mal met behulp van een maskerloze aligner door het ontwerpbestand van het kernkanaalpatroon te uploaden naar de μPG 101 PC. Ga vervolgens verder met het bakken na blootstelling bij 65 °C gedurende 3 minuten en bij 95 °C gedurende 10 minuten.
    2. Spin coat de tweede SU-8 2025-laag (40 μm) bij 1.500 tpm en stel bloot door het juiste CAD-bestand voor het shellkanaalpatroon te uploaden.
      OPMERKING: Zachte en post-exposure bakes waren vergelijkbaar met de vorige stap.
    3. Spin de derde SU-8 2025-laag bij 1.400 tpm om een hoogte van 50 μm te bereiken en herhaal het bovenstaande proces, maar stel de structuren voor de oliefase bloot.
    4. Ontwikkel de mal met alle drie de lagen in één stap door onderdompeling in SU-8 developer totdat alle onbelichte fotoresist is verwijderd.
    5. Bak de vorm hard op een hete plaat bij 160 °C gedurende 10 minuten om de hechting te verbeteren en kleine scheuren af te dichten die na de ontwikkeling kunnen optreden.
    6. Stel de schimmel bloot aan chlorotrimethylsilaan om te voorkomen dat elastomeer zich in de volgende stap hecht en plaats het in petrischalen van 15 cm tot gebruik.
  3. Bereid de mal van het dissociatieapparaat op dezelfde manier voor, zoals beschreven in figuur 1D en figuur 2B. Spin coat een laag SU-8 fotoresist op een silicium wafer, zoals eerder beschreven in stap 1.2.3, om structuren te bereiken met de gewenste hoogte: 50 μm. Voer het zachte en na-blootstelling bakken, ontwikkelen en hard bakken op dezelfde manier uit als de vorige stap.
    OPMERKING: Een reeks driehoekige palen bedekte de hele kamer, waarbij de afstand tussen de palen afnam naarmate de kamerbreedte afnam naar de uitlaat. Driehoekspalen waren 200 μm per zijde met een toonhoogte variërend van 400 μm (aan de inlaat) tot 30 μm (aan de uitlaat).
  4. Bereid de mallen voor door zachte lithografie met polydimethylsiloxaan (PDMS).
    1. Meng PDMS-elastomeerbasis en elastomeeruithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 w/w in een planetaire centrifuge. Giet het mengsel op zowel micro-inkapselingsmastermallen als dissociatiemastermal om een laag van 3-4 mm te creëren.
      OPMERKING: Een mengsel van 50 g elastomeerbasis met 5 g uithardingsmiddel is voldoende om een hoofdmal met een dikte van 3 mm te bedekken.
    2. Plaats de petrischaaltjes met de mallen gedurende 15 minuten in een vacuümsiccator om het niet-uitgeharde PDMS te ontgassen.
    3. Zet de petrischaaltjes in een oven en bak minimaal 60 min op 80 °C.
    4. Haal de hoofdvormen uit de oven en laat ze afkoelen. Snijd met een precisiemes voorzichtig de PDMS volgens de vorm van de wafer en pel de PDMS-stukken uit de hoofdvorm.
    5. Knip de PDMS-platen uit door de randen van elk apparaat bij te snijden met een scalpel en pons vervolgens inlaat- / uitlaatvloeistofpoorten uit in het dissociatieapparaat en alleen in het bovenste microfluïdische apparaat met behulp van roestvrijstalen naalden. Bedek de apparaten met magische tape om besmetting te voorkomen.
      OPMERKING: De naaldmeter is respectievelijk 14 G en 15 G voor inlaat- en uitlaatpoorten.
    6. Behandel voor het verlijmen de patroonzijden van de bovenste en onderste PDMS-stukken met O2 plasma op een plasma-ets gedurende 2 minuten.
    7. Lijn beide PDMS-onderdelen uit onder een stereoscoop na toevoeging van een dunne scheidingslaag gedestilleerd water direct in de microkanalen (2 μL).
    8. Plaats het uitgelijnde PDMS-apparaat 's nachts in de oven bij 80 °C om de verlijming te voltooien en het PDMS in de oorspronkelijke hydrofobe staat te herstellen. Bewaar de apparaten tot verder gebruik.
      OPMERKING: Dit resulteert in een coaxiaal flowfocusapparaat met drie verschillende hoogtes van 120 μm voor kern, 200 μm voor schaal en 300 μm voor oliekanalen.
    9. Om het apparaat direct na de plasmabinding te gebruiken, injecteert u zorgvuldig maar stevig 30 μL hydrofobe coatingoplossing in de vloeistofkanalen om hydrofobe coating te bereiken. Spoel vervolgens onmiddellijk lucht in de kanalen totdat er geen residuen van de hydrofobe coatingoplossing in het apparaat worden waargenomen.
    10. Bind het dissociatieapparaat vast door eerst de patroonzijde van het apparaat en een gereinigd schuifglas gedurende 2 minuten met O2-plasma te behandelen en monteer ze vervolgens voor verdere uitharding in de oven bij 80 °C gedurende een nacht.
      OPMERKING: Apparaten kunnen worden opgeslagen tot verder gebruik.

2. Bereiding van oplossingen

  1. Voorraadoplossingen. Bereid eerst stamoplossingen (geconcentreerde oplossingen) voor die worden verdund tot lagere concentraties voor daadwerkelijk gebruik.
    OPMERKING: Voorraadoplossingen worden gebruikt om bereidingstijd te besparen, materialen te besparen, opslagruimte te verminderen en de nauwkeurigheid te verbeteren bij het bereiden van een werkoplossing in lagere concentraties.
    1. Bereid 30 ml 2x-kernoplossing (16% PEG en 34% dichtheidsgradiëntmedia): meng 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml dichtheidsgradiëntmedia en 19,8 ml DMEM/F12-media. Filtreer deze kernoplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
    2. Bereid 50 ml minerale olie met 3% oppervlakteactieve stof: meng 48,5 ml minerale olie en 1,5 ml oppervlakteactieve stof. In steriele toestand bewaren na filtratie door een spuitfilter van 0,22 μm.
    3. Bereid 50 ml minerale olie met 0,5% oppervlakteactieve stof: meng 49,75 ml minerale olie en 0,25 ml oppervlakteactieve stof. In steriele toestand bewaren.
    4. Bereid 1 M Dithiotheritol (DTT): los 1,5425 g DTT op in gedestilleerd water van 10 ml. In steriele toestand bewaren.
    5. Bereid 1 M Triethanolamine (TEA): voeg 66,4 μL TEA toe in 433,6 μL gedestilleerd water. In steriele toestand bewaren.
    6. Bereid 1% Pluronic F127 (PF127): los 100 mg PF127 op in 10 ml gedestilleerd water. In steriele toestand bewaren.
  2. Werkende oplossingen
    1. Bereid een crosslinker-emulsie door 4,5 ml minerale olie te mengen met 3% oppervlakteactieve stof en 300 μl 1 M DTT (verhouding 1:15). Vortex de oplossing gedurende 2 minuten en soniceer gedurende 45-60 minuten in een ultrasoon bad bij 20 °C. Laad deze oplossing op een spuit van 5 ml met een naald van 27 G.
      OPMERKING: Emulsie wordt gegenereerd door het ultrasoon maken van het olie/water mengsel.
    2. Bereid de afschermende olieoplossing voor door de minerale olie met 0,5% oppervlakteactieve stof te laden op een spuit van 5 ml met een naald van 27 G.
    3. Bereid de shell (8% w/v PEG-4-Mal en 15 mM TEA) oplossing voor door 32 mg PEG-4-Mal toe te voegen in 400 μL 1x DPBS om 8% w/v oplossing te vormen, en vortex de oplossing gedurende 2 min. Voeg vervolgens 6 μL van 1 M TEA toe (eindconcentratie 15 mM TEA). Centrifugeer ten slotte gedurende 5 minuten bij 13.000 x g door een spinfilter en houd het gedurende 30 minuten in het donker op de rocker. Laad deze oplossing vervolgens op een spuit van 1 ml met een naald van 27 G.
      OPMERKING: Laat de PEG-4-Mal-container 10 minuten op kamertemperatuur staan voordat u het deksel opent en blaas N2-gas om de O2 door N2 te vervangen voordat u het deksel sluit. Vortex TEA voordat u aan de oplossing toevoegt.
  3. Bereid de celsuspensie voor in de kernoplossing
    1. Behandel de hPSC's met trypsine gedurende 5 tot 10 minuten bij 37 °C. Verzamel ze vervolgens van borden. Doof de trypsine met het medium na celloslating en breng de cellen vervolgens over naar een conische buis van 15 ml.
    2. Centrifugeer de bulkcelsuspensie (400 x g, 5 min). Zuig het supernatant voorzichtig op en suspend de celkorrel vervolgens met een minimaal volume groeimedium. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller.
      OPMERKING: Typische cel aliquots bevatten 12-20 x 106 cellen en zijn voldoende om 400 μL van de kernoplossing te maken.
    3. Neem 12-20 x 106 cellen uit de bulkcelsuspensie en centrifugeer de cel/media-suspensie (400 x g, 5 min).
    4. Aspirateer zorgvuldig media uit de celkorrel. Voeg vervolgens 200 μL media en 200 μL 2x PEG-oplossing toe (eindconcentratie 30-50 x 106 cel/ml) en meng voorzichtig.
      OPMERKING: Lage celconcentraties (minder dan 20 x 106 cellen / ml) resulteerden in veel lege capsules.
    5. Voeg 30 μL van 1% PF127 toe aan de oplossing.
    6. Steek een microroerderstaaf (2 mm x 7 mm) in een spuit van 1 ml en laad vervolgens de celbevattende kernoplossing met een naald van 27 G in de spuit. Houd de oplossing koud met ijs tijdens het hele inkapselingsproces.

3. Experimentele opstelling

  1. Plaats een gebonden PDMS-druppelapparaat, vier stuks van 20 cm lang en een stuk van 5 cm lange inlaatmicrobuizen (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), één stuk van 10 cm uitlaatbuis (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) en zes stuks van 0,5 cm fittingbuizen (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) onder een kiemdodende lichtbron (meestal ingebouwd in biologische veiligheidskasten) en steriliseer gedurende 30 Min.
  2. Gebruik een tang om de slang in de vloeistofinlaatpoorten en de dissociatiepoorten te plaatsen.
  3. Gebruik de drie stukken van 20 cm lange inlaatmicrobuizen voor de schaal, olie, crosslinker-emulsie-inlaten en één stuk voor de inlaat van het dissociatieapparaat. Breng vervolgens het andere uiteinde van de buisjes in de naald van de spuit met de bijbehorende oplossing. Verbind ondertussen de kerninlaat van het microfluïdische apparaat en de uitlaat van het dissociatieapparaat met één microbuis van 5 cm (figuur 1C).
    OPMERKING: De microbuizen van de inlaat moeten stevig worden vastgezet in de fittingbuizen, die in de laatste stap zijn ingebracht.
  4. Steek één uitlaatbuis in de vloeistofuitlaatpoort en plaats het andere uiteinde in een opvangreservoir.
  5. Plaats het apparaat op een microscooptrap en bevestig de slang om beweging te voorkomen. Lijn en richt de microscoop op het mondstuk van het apparaat voor stroominspectie.
  6. Plaats elke spuit op verschillende spuitpompen en zet goed vast (figuur 1B). Programmeer elke pomp volgens de protocollen van de fabrikant volgens de volgende stroomsnelheden: kern (3-5 μL / min), shell (3-5 μL / min), afschermingsolie (20-80 μL / min) en crosslinking-olie (40-60 μL / min). Start de stroom in alle pompen.
  7. Wacht tot elke vloeistof het apparaat binnenkomt en vul de kanalen terwijl u de resterende lucht naar buiten duwt.
    OPMERKING: Als er een grote hoeveelheid lucht in de inlaatbuis zit, verhoog dan tijdelijk elk debiet totdat de lucht volledig is verwijderd. Houd er rekening mee dat een te hoog debiet kan leiden tot pdms-naar-PDMS-bindingsfouten.
  8. Wanneer de capsulevorming is gestabiliseerd (figuur 3), plaatst u het andere uiteinde van de opvangbuis in een nieuwe conische buis met 5 ml mTeSR-media.
    OPMERKING: De media bevatten 10 μM ROCK-remmer, 100 E / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine.
  9. Nadat een voldoende aantal capsules is verzameld, incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 10 minuten. Capsules die zich in de oliefase bevinden, bevinden zich aan de bovenkant van de buis (zie figuur 4A). Zachtjes tikken op de buis zorgt ervoor dat capsules naar de bodem bezinken. Hierna kan het grootste deel van de olie en media worden aangezogen.
  10. Verzamel de capsules van de bodem van de conische buis, plaats ze op een celzeef (poriegrootte van 100 μm) en was ze met overvloedige hoeveelheden media. Verzamel vervolgens microcapsules met behulp van 2 ml media in een 6-well cultuurplaat door de media door het filter te laten lopen terwijl het omgekeerd is bovenop de putplaat (zie figuur 4A).

4. hPSC-cultuur en analyse in microcapsules

  1. Basiscultuur
    1. Incubeer de stamcelcapsules in een 6-wells bordkweekschaal bij 37 °C met 5% CO2.
    2. Vervang de media om de dag door de capsules op een celzeeffilter te verzamelen, ze te wassen met overtollige media en ze opnieuw te besteden aan een nieuwe put in 6-putplaten met 2 ml media zoals werd gedaan in stap 3.10.
    3. Kweek de capsules gedurende ten minste 10 dagen.
  2. Voer de levend/dood-test uit om de levensvatbaarheid van ingekapselde stamcellen te bepalen.
    1. Ontdooi levend/dood assay oplossingen (ethidium homodimer-1 en calceïne AM).
    2. Voeg 4 μL van de 2 μM ethidium homodimeer-1 en 1 μL van de 4 μM calceïne AM-oplossingen toe aan 2 ml steriele DPBS. Vortex om een volledige menging te garanderen.
    3. Verzamel ongeveer 100 microcapsules op een celzeef en spoel ze af met steriele DPBS om diffusie van medium uit de capsules mogelijk te maken.
    4. Verzamel ze opnieuw op een kweekplaat met 12 putten met behulp van 1 ml van de in stap 4.2.2 bereide oplossing. Incubeer bij 37 °C gedurende 20 min.
    5. Visualiseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: De levensvatbaarheid van cellen wordt gekwantificeerd door het percentage levende cellen te berekenen, dat als groen wordt gevisualiseerd, onder het totale aantal cellen.
  3. Karakterisering van de sferoïde grootte.
    1. Plaats desgewenst de putplaat met microcapsules onder de microscoop en meet de diameter van de sferoïden die op de bijbehorende software worden weergegeven met de juiste schaalstaven.
    2. Meet en analyseer de sferoïde grootte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door het bovengenoemde protocol te volgen, kan de lezer microfluïdische apparaten fabriceren en celdragende microcapsules produceren. Figuur 3A toont voorbeelden van optimale en suboptimale microcapsules vervaardigd met behulp van microfluïdische druppelgeneratie. Verschillende formuleringen van PEG-4-Mal resulteerden in capsules met verschillende morfologieën - gerimpelde capsules werden geassocieerd met slechte gelation, lage mechanische integriteit en waren niet bestand tegen teelt in een...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven inkapselingsproces resulteert in reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden. Het microcapsule-formaat maakt het gemakkelijk om sferoïden in putten van een microtiterplaat te doseren voor experimenten gericht op het verbeteren / optimaliseren van differentiatieprotocollen of het testen van therapieën. Ingekapselde stamcelsferoïden kunnen ook worden gebruikt in suspensieculturen waar hydrogelschaal cellen beschermt tegen door afschuiving veroorzaakte schade7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de subsidies van het Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) en NIH (DK107255).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm Syringe FiltersGenesee Scientific25-244
1 ml syringe luer-lock tipBD309628
1x DPBSCorning23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDaLaysan Inc.164-68
5 ml syringe luer-lock tipBD309646
6-WELL NON-TREATED PLATEUSA ScientificCC7672-7506
Aquapel Applicator PackAquapel Glass Treatment47100
CAD softwareAutodeskAutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore sizecardinal335583
ChlorotrimethylsilaneAldrich386529-100mL
Countess II FL Automated Cell CounterLife technologyA27974
Digital hot plateDataplate
Digital vortex mixerFisher Scientific215370
Distilled waterGibco15230-162
Dithiotheritol (DTT)SigmaD0632-10G
DMEM/F12 mediagibco11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesFisher scientific14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifugelive13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 IncubatorThermo Scientific50144906
Inverted Fluorescence Motorized MicroscopeOlympusOlympus IX83
Laurell Spin CoatersLaurell TechnologiesWS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kitFisherL3224
Magic tapeStaples483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)Scientific Commodities, IncBB31695-PE/2
Micro stir barDaigger ScientificEF3288E
MilliporeSigma Filter ForcepsFisher scientificXX6200006P
Mineral oilSigmaM8410-1L
mTeSR 1 Basal MediumSTEMCELL TECHNOLOGY85850
Needles-Stainless Steel  14 GaugeCML supply901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 GaugeCML supply901-15-050
OptiPrepSTEMCELL TECHNOLOGY7820
OvenThermo ScientificHERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)Gemini400-109
Petri Dish 150X20 Sterile VentSarstedt, Inc.82.1184.500
Plasma Cleaning SystemYield Engineering System, Inc.YES-G500
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDaSigma94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27GBD305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydroclorideSELLECK CHEMS1049-10mg
Silicon wafer 100mmUniversity Wafer452
Slide glass (75mm ´ 25mm)CardinalHealthM6146
Span 80SigmaS6760-250ML
SpeedMixerThinkyARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)Costar8160
SU-8 2025Kayaku Advanced MaterialsY111069 0500L1GL
SU-8 developerKayaku Advanced MaterialsY020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Bladesfisher scientific22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)Dow Corning2065622
Syringe pumpNew Era Pump System, IncNE-4000
TriethanolamineSigma-aldrichT58300-25G
TrypLE ExpressGibco12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)Cole-Parmer06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)Cole-Parmer06419-04
Ultrasonic cleaner FS20DFisher ScientificCPN-962-152R
Vacuum desiccatorBel-ArtF42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32xZEISS435421-0000-000
μPG 101 laser writerHeidelberg InstrumentsHI 1128

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
  2. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
  3. Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70(2020).
  4. Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
  5. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
  7. Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
  8. Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
  9. Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
  10. Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
  11. Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
  12. Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
  13. Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
  14. You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfluidic EncapsulationCore Shell MicrocapsulesHuman Pluripotent Stem CellsStem Cell Spheroids3D Cell CultureHydrogel MicrocapsulesDroplet MicrofluidicsSpheroid FormationCell Viability AssayFluorescence Microscopy

Gerelateerde artikelen