Methodenartikel

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DOI:

10.3791/62949

⸱

5 augustus 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methylatie, een vorm van epigenetische genregulatie, is belangrijk voor de normale cellulaire functie. In cellen stellen eiwitten genaamd DNA-methyltransferasen (DNMT's) het DNA-methylatiepatroon vast en onderhouden het. Veranderingen in het normale DNA-methylatiepatroon zijn gekoppeld aan de ontwikkeling en progressie van kanker, waardoor DNMT's potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen zijn. Het identificeren en karakteriseren van nieuwe kleine molecuulremmers van deze enzymen is dus van groot belang. Dit artikel presenteert een protocol dat kan worden gebruikt om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers. De continue gekoppelde kinetische test maakt het mogelijk om de initiële snelheden van DNA-methylatie te bepalen in de aan- en afwezigheid van potentiële kleine molecuulremmers. De test gebruikt de methylgevoelige endonuclease Gla I om methylering van een gehemimethyleerd DNA-substraat te koppelen aan fluorescentiegeneratie.

Deze continue test maakt het mogelijk om de enzymactiviteit in realtime te volgen. Het uitvoeren van de test in kleine volumes in microtiterplaten verlaagt de kosten van reagentia. Met behulp van deze test werd een klein voorbeeldscreening uitgevoerd op remmers van DNMT1, het meest voorkomende DNMT-isozym bij mensen. Het sterk gesubstitueerde anthrachinon natuurlijke product, laccaïnezuur A, is een krachtige, DNA-competitieve remmer van DNMT1. Hier onderzoeken we drie potentiële kleine molecuulremmers - anthrachinonen of anthrachinonachtige moleculen met één tot drie substituenten - in twee concentraties om het testprotocol te beschrijven. Initiële snelheden worden gebruikt om de procentuele activiteit te berekenen die wordt waargenomen in de aanwezigheid van elk molecuul. Een van de drie onderzochte verbindingen vertoont concentratieafhankelijke remming van DNMT1-activiteit, wat aangeeft dat het een potentiële remmer van DNMT1 is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methylatie is een belangrijk epigenetisch merkteken dat genexpressie en chromatinestructuur reguleert. Methylering treedt voornamelijk op in CpG-dinucleotiden - cytosine gevolgd door guanosine; de methylgroep wordt toegevoegd aan de 5-positie van cytosine. Correcte DNA-methylatiepatronen, en dus de juiste genexpressie, zijn nodig voor een geschikte cellulaire ontwikkeling en functie. Veel ziektetoestanden zijn in verband gebracht met veranderingen in het normale methylatiepatroon 1,2,3. Er is bijvoorbeeld een verband tussen kankerinitiatie en progressie en veranderingen in het DNA-methylatiepatroon. Typisch, kankercellen vertonen lagere algemene niveaus van methylcytosine, die bijdraagt aan genoominstabiliteit. Tegelijkertijd is de methylcytosine die aanwezig is in het genoom geconcentreerd in de promotorregio's van tumorsuppressorgenen, wat leidt tot gen-uitschakeling van deze belangrijke eiwitten. Met name epigenetische veranderingen zijn dynamisch en omkeerbaar, in tegenstelling tot de DNA-mutaties geassocieerd met tumorigenese. Dit heeft de eiwitten die betrokken zijn bij epigenetische genregulatie interessante medicijndoelen 2,4 gemaakt.

DNA-methyltransferasen (DNT's) zijn de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het genereren en onderhouden van DNA-methylatiepatronen. Drie katalytisch actieve isozymen, DNMT1, DNMT3a en DNMT3b, bestaan bij mensen. Tijdens de ontwikkeling en differentiatie stellen de de novo methyltransferasen, DNMT3a en DNMT3b, methylatiepatronen vast. Beide enzymen kunnen het katalytisch inactieve DNMT3L-eiwit binden om complexen te vormen die verhoogde activiteit vertonen 1,5. Na celdeling bevatten dochtercellen hemimethylated DNA - DNA dat methylcytosine bevat in slechts één streng van de duplex - omdat het nieuw gesynthetiseerde DNA verstoken is van methylatiemarkeringen. De belangrijkste functie van DNMT1 is om dit gehemimethyleerde DNA te methyleren, waardoor het volledige methylatiepatroonwordt hersteld 1,5.

Verbanden tussen DNMT-activiteit en kanker zijn goed vastgesteld. Overexpressie van DNMT1, hetzij door transcriptionele of posttranslationele mechanismen, is een gevolg van verschillende veel voorkomende oncogene routes 6,7,8,9. Genetische benaderingen voor lagere DNMT1-activiteit met behulp van hypomorfe allelen resulteren in verminderde tumorvorming bij Apc(Min)-muizen10. Antisense oligonucleotiden die DNMT1 afstoten remmen neoplasie in celkweek en muistumormodellen 11,12. Het remmen van DNMT1-activiteit lijkt dus een veelbelovende benadering van kankertherapie. De rollen die de DNMT3-isozymen spelen, zijn echter niet zo eenvoudig. DNMT3a mutaties worden gevonden bij acute myeloïde leukemie13 en myelodysplastisch syndroom14. Van ten minste één van de geïdentificeerde mutaties is aangetoond dat het de DNA-methylatieactiviteit van het enzym15 vermindert. DNMT3b is echter overexpressie bij borstkanker16 en colorectale kanker17. Omdat de verschillende DNMT-isozymen verschillende rollen spelen in carcinogenese, zal het identificeren van isozymspecifieke remmers van cruciaal belang zijn. Niet alleen zullen deze verbindingen nuttig zijn voor de ontwikkeling van therapeutica, maar isozymspecifieke remmers zouden ook een waardevol hulpmiddel zijn om de rol van elk DNMT-isozym in de kankeretiologie te ontleden.

Verschillende DNMT-remmers zijn gemeld in de literatuur. Bekende DNMT-remmers kunnen worden onderverdeeld in twee klassen: nucleoside en niet-nucleoside. Nucleosideremmers zijn meestal cytidine-analogen. Deze verbindingen zijn opgenomen in DNA en vangen covalent DNMT's. 5-azacytidine en 5-aza-2'-deoxycytidine zijn goedgekeurd voor de behandeling van myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie 4,18. De hoge toxiciteit, lage biologische beschikbaarheid en chemische instabiliteit van deze verbindingen leveren problemen op. Lopend onderzoek is naar de werkzaamheid van de volgende generatie nucleosideremmers; SGI-110, afgeleid van 5-aza-2'-deoxycytidine, is een voorbeeld19,20. Nucleosideremmers zijn niet isozymspecifiek en zullen elk DNMT-isozym dat wordt aangetroffen inactiveren. Daarom resulteert behandeling met een nucleoside-demethylerend middel in de uitputting van alle DNMT-isozymen 4,18. Niet-nucleosideremmers hoeven niet in het DNA te worden opgenomen om hun remmende effecten uit te oefenen. In plaats daarvan binden deze moleculen zich rechtstreeks aan DNT's, waardoor de mogelijkheid voor isozymspecifieke remming wordt geïntroduceerd. Tot op heden zijn verschillende niet-nucleosideremmers ontdekt, waaronder SGI-102721, hydralazine22, procaïnamide23, RG108 en derivaten24, en natuurlijke producten, (−)-epigallocatechine 3-gallaat (EGCG)25 en laccaïnezuur A26,27. De meeste niet-nucleosideremmers die tot nu toe zijn ontdekt, zijn niet isozymselectief of vertonen zwakke voorkeuren voor één DNMT-isozym. Bovendien moet de potentie van deze moleculen worden verbeterd, vooral in cellen 4,18. Er is dus behoefte aan het ontdekken of ontwikkelen van krachtigere, isozymselectieve DNMT-remmers.

Een hindernis voor het ontdekken van nieuwe kleine molecuulremmers van DNT's zijn de moeizame testen die traditioneel worden gebruikt om DNMT-activiteitte onderzoeken 28. Assays zijn meestal discontinu met meerdere stappen. De enzymatische activiteit van DNMT's wordt nog steeds routinematig getest met behulp van radioactief S-adenosyl methionine (SAM)29,30,31,32,33,34. Er zijn ook niet-radioactieve testen voor DNA-methylatie ontwikkeld. Bijvoorbeeld, assays die methylgevoelige restrictie-endonucleasen en elektroforese gebruiken om de spijsverteringsproducten te scheiden, zijn beschreven35,36. Dit soort discontinue, meerstapstests zijn niet gemakkelijk vatbaar voor medicijnontdekking. Sinds het midden van de jaren 2000 zijn verschillende DNA-methylatietests met een hogere doorvoer ontwikkeld28. Een scintillatie-nabijheidstest werd gebruikt om te screenen op DNMT1-remmers37. Een andere test met behulp van een methylgevoelige restrictie-endonuclease werd gebruikt om te screenen op DNMT3a-remmers25,38. Hoewel beide assays een hogere doorvoer mogelijk maakten dan traditionele DNA-methylatietests, vereisen de assays meerdere stappen en laten ze de observatie van methylatieactiviteit in realtime niet toe. Meer recent is een continue kinetische test beschreven die de vorming van S-adenosylhomocysteïne (SAH), een product van de methylatiereactie, koppelt aan de spectroscopische verandering bij 340 nm geassocieerd met NADPH-oxidatie39. Deze test maakt gebruik van drie koppelende enzymen om een spectroscopisch signaal te genereren.

We ontwikkelden een op fluorescentie gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest die gebruik maakt van een enkel commercieel beschikbaar koppelingsenzym en in realtime gegevens kan genereren (figuur 1). Een haarspeld oligonucleotide met drie methylcytosines wordt gebruikt als substraat. Het substraat-DNA bevat een fluorofoor aan het 5'-uiteinde en een quencher aan het 3'-uiteinde. Methylering van de gehemimethyleerde CpG-site genereert de splitsingsplaats voor de endonuclease Gla I - volledig gemethyleerde GCGC. Gla I splitsing van het product oligonucleotide geeft de fluorofoor vrij uit de quencher en genereert fluorescentie in real time. De test kan worden gebruikt om de activiteit van elke isovorm van DNMT te onderzoeken; er wordt echter een hogere activiteit waargenomen met DNMT1, omdat dit isozym bij voorkeur gehemimethyleerd DNA 1,5 methyleert. Nog robuustere activiteit wordt waargenomen als het RFTS-domein (Autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence) wordt verwijderd uit DNMT1. Dit domein, gevonden in het N-terminale regulatoire gebied, bindt aan de katalytische plaats en voorkomt DNA-binding. Verwijdering van de eerste ~ 600 aminozuren resulteert in een afgeknotte enzym dat aanzienlijk actiever is dan het enzym over de volledige lengte (~ 640-voudige toename van kcat / Km)40. Deze geactiveerde vorm van het enzym, aangeduid als RFTS-ontbrekende DNMT1 (aminozuren 621-1616), maakt de gemakkelijkere identificatie van remmers mogelijk vanwege de verhoogde katalytische kracht. Dit artikel presenteert een protocol om RFTS-ontbrekende DNMT1 te gebruiken in assays om te screenen op potentiële remmers van kleine moleculen. Met behulp van de endonuclease-gekoppelde continue assay wordt de beginsnelheid bepaald in de aan- en afwezigheid van enkele kleine moleculen. Elke potentiële remmer wordt onderzocht bij twee concentraties om te zoeken naar concentratieafhankelijke DNMT1-remming. Het percentage activiteit waargenomen in de aanwezigheid van de kleine moleculen werd in elk geval berekend.

figure-introduction-1
Figuur 1: DNA-methylatietest. Een gehemimethyleerd haarspeld-DNA met een fluorofoor aan het 5'-uiteinde en een quencher aan het 3'-uiteinde wordt als substraat gebruikt. DNMT1 katalyseert de overdracht van de methylgroep van S-adenosylmethionine naar de niet-gemethyleerde CpG-site, waarbij S-adenosylhomocysteïne en volledig gemethyleerd DNA wordt gegenereerd. Het DNA-product bevat de splitsingsplaats voor het endonuclease Gla I, dat volledig gemethyleerde GCGC-sites splijt. Splitsing van het product DNA geeft de 5' fluorofoor vrij uit de 3' quencher, waardoor fluorescentie ontstaat. Afkortingen: Fl = fluorofoor; Q =quencher; DNMT1 = DNA methyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionine; SAH = S-adenosylhomocysteïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid testoplossingen voor het scherm voor

OPMERKING: De concentraties van substraten die in deze test worden gebruikt, kunnen worden aangepast. Voor RFTS-ontbrekende DNMT1 zijn de experimenteel bepaalde Km-waarden voor het haarspeld-DNA-substraat en SAM 1-2 nM en 2 μM, respectievelijk26,40.

  1. Bereid 600 μL van elke testconditie die wordt getest in microcentrifugebuizen op ijs.
    OPMERKING: Het totale volume van de benodigde testoplossing is afhankelijk van het aantal replicaties dat wordt uitgevoerd. Elke testvoorwaarde werd in drievoud uitgevoerd voor dit protocol.
    1. Voeg ddH2O en 5x methylatiebuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamaat, 5 mM dithiothreitol (DTT), 25% glycerol) toe aan elke buis om een uiteindelijke concentratie van 1x buffer te bereiken. Voeg voor testen die 20 μM-verbinding bevatten 472 μL ddH2O en 120 μL 5x buffer toe. Voeg voor testen die 50 μM-verbinding bevatten 470 μL ddH2O en 120 μL 5x buffer toe.
    2. Voeg 3,15 μL 20 mg/ml runderserumalbumine (BSA) toe aan elk monster.
    3. Voeg 2 μL 3,15 μM haarspeld DNA-substraat en 1,33 μL 4,75 mM SAM toe aan elk monster.
      OPMERKING: De concentratie van substraten in het mengsel van de testoplossing is 1,05x de gewenste eindconcentraties.
    4. Voeg de remmer toe aan een eindconcentratie van 21 μM (1,26 μL van 10 mM) of 52,5 μM (3,15 μL van 10 mM) aan de juiste monsters. Voeg een equivalente hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan een controlemonster.
      OPMERKING: De concentratie van de remmer die in het scherm wordt gebruikt, kan worden gevarieerd. De maximale uiteindelijke DMSO-concentratie moet ≤5% (v/v) zijn. DMSO-concentraties tot 5% (v/v) hebben geen effect op de activiteit die in de test is waargenomen26.
  2. Meng de oplossingen door vortexing (3.000 rpm) gedurende 3 s. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafelblad (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
  3. Aliquot 95 μL van elke testoplossing in 6 opeenvolgende putjes in een zwarte half-area 96-well plaat (figuur 2).
    OPMERKING: Deze screeningstests werden uitgevoerd in twee batches. Eerst werden 20 μM-remmermonsters (4 totale condities) onderzocht, gevolgd door de 50 μM-remmermonsters (4 totale condities).

figure-protocol-1
Figuur 2: Assay plate setup. Elke testoplossing wordt gealiquoteerd in zes putjes in de zwarte 96-well plaat: DMSO-controle (blauw), verbinding 1 (groen), verbinding 2 (rood) en verbinding 3 (geel). Zowel RFTS-ontbrekende DNMT1 als Gla I worden aan drie putten toegevoegd. Als controle zal Gla I alleen aan de andere drie putten worden toegevoegd. Afkortingen: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA methyltransferase 1; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereid enzymoplossingen voor op het scherm

OPMERKING: RFTS-ontbrekende DNMT1 kan worden uitgedrukt in E. coli en gezuiverd tot homogeniteit. Expressie- en zuiveringsprocedures voor RFTS-ontbrekende DNMT1 zijn eerder beschreven41. Het volume van het benodigde enzym hangt af van het aantal testen dat wordt uitgevoerd. Hier worden in elke set vier verschillende testen uitgevoerd; elke test wordt in drievoud voltooid.

  1. Bereid 75 μL van elke enzymoplossing in microcentrifugebuizen op ijs.
    OPMERKING: Er zijn twee enzymoplossingen nodig. Eén oplossing bevat DNMT1 en Gla I; de andere bevat alleen Gla I.
    1. Voeg ddH2O en 5x methylatiebuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamaat, 5 mM DTT, 25% glycerol) toe aan elke buis om een eindconcentratie van 1x buffer te bereiken. Voeg voor de Gla I enzymoplossing 15 μL 5x buffer en 58,8 μL ddH2O toe. Voeg voor de DNMT1+Gla I enzymoplossing 15 μL 5x buffer en 58,2 μL ddH2O toe.
    2. Voeg 1,2 μL 10 U/μL Gla I toe aan elke oplossing voor een eindconcentratie van 0,16 U/μL.
    3. Voeg 0,6 μL 5 μM RFTS-ontbrekende DNMT1 voor een eindconcentratie van 40 nM toe aan de DNMT1+Gla I-oplossing.
  2. Tik zachtjes om de oplossingen te mengen. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafel (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
  3. Aliquot 12 μL van elke enzymoplossing in 6 putjes in een conisch bodemplaatje met 96 putten (figuur 3).

figure-protocol-2
Figuur 3: Enzymplaatopstelling. De Gla I (grijs) en DNMT1+Gla I (blauw) oplossingen zijn elk gealiquoteerd in zes putten in de 96-well plaat. Met behulp van een meerkanaals pipet kan het enzym tegelijkertijd aan een rij testoplossingen worden toegevoegd. Voor elke testconditie (zes putten) ontvangen drie putten DNMT1 + Gla I en drie putten ontvangen Gla I alleen. Afkorting: DNMT1 = DNA methyltransferase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voer de test uit en analyseer de gegevens.

  1. Verwarm de plaatlezer voor op 37 °C. Plaats de zwarte plaat met de testoplossingen. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 5 s) en lees de fluorescentie af met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 528 nm. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen filters met de juiste golflengteafsnijdingen worden gebruikt voor de fluorescentiemetingen.
  2. Verwijder de testplaat. Voeg 5 μL enzymoplossing toe aan elke put en meng door op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Gebruik meerkanaals pipetten zodat een rij monsters tegelijkertijd kan worden gestart.
  3. Steek de plaat in de plaatlezer. Registreer fluorescentie om de 53 s gedurende 30 minuten. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 4 s) voor elke meting.
  4. Gemiddelde drievoudige Gla I controle assays voor elke aandoening. Trek het gemiddelde Gla I-bevattende controlereactiespoor af van de drievoudige sporen die zijn verkregen in aanwezigheid van RFTS-ontbrekende DNMT1. Bepaal de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor de gecorrigeerde replicaties.
  5. Plot het gemiddelde gecorrigeerde reactiespoor en pas het initiële lineaire gedeelte aan op een lijn om de beginsnelheid te bepalen.
  6. Bepaal het percentage activiteit door de snelheid waargenomen in aanwezigheid van een verbinding te delen door de snelheid waargenomen in de DMSO-bevattende controlereactie en te vermenigvuldigen met 100.

4. Aanvullende controle op de test — sequentiële toevoeging van enzymen

  1. Bereid 550 μL testoplossing in een microcentrifugebuis op ijs. Voeg 110 μL 5x methylatiebuffer, 3,88 μL 3,15 μM haarspeld DNA-substraat, 6,43 μL van 47,5 mM SAM, 3,06 μL van 20 mg/ml BSA en 426,6 μL ddH2O toe.
  2. Meng de oplossing door vortexing (3.000 rpm) gedurende 3 s. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafel (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
  3. Aliquot 90 μL van de testoplossing in 6 opeenvolgende putjes in een zwarte half-area 96-well plaat.
  4. Bereid de DNMT1-enzymoplossingen op ijs. Voeg 4 μL 5x methylatiebuffer, 0,76 μL 5 μM RFTS-ontbrekende DNMT1 en 15,24 μL ddH2O toe aan één buis. Voeg 4 μL 5x methylatiebuffer en 16 μL ddH2O toe aan een andere buis.
  5. Tik zachtjes om de oplossingen te mengen. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafel (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
  6. Voeg 5 μL van de DNMT1-bevattende oplossing toe aan drie putjes in de zwarte half-area 96-well plaat. Voeg 5 μL van de bufferregeloplossing toe aan de andere drie putten.
  7. Plaats de microtiterplaat in de voorverwarmde plaatlezer die is voorverwarmd op 37 °C. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 3 s) en lees de fluorescentie af met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 528 nm. Herhaal de shake en lees elke 60 s gedurende 30 min.
  8. Terwijl de testplaat zich in de plaatlezer bevindt, bereidt u de Gla I-oplossing op ijs. Voeg 8 μL 5x methylatiebuffer, 0,64 μL 10 U/μL Gla I en 31,4 μL ddH2O toe aan een microcentrifugebuis. Tik zachtjes om de oplossing te mengen. Draai het monster gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafelblad (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
  9. Aliquot 6 μL van de Gla I-oplossing in 6 putten in een conisch bodemplaat met 96 putten.
  10. Na de eerste 30 minuten lezen, verwijdert u de zwarte plaat uit de plaatlezer. Voeg 5 μL Gla I-oplossing toe aan alle 6 putten en meng door op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Gebruik een meerkanaals pipet zodat alle putten tegelijkertijd kunnen worden geïnitieerd.
  11. Plaats de zwarte plaat terug in de plaatlezer. Registreer fluorescentie om de 35 s gedurende 35 minuten. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 3 s) voor elke meting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Actieve DNMT1 is een voorwaarde voor deze analyse. RFTS-ontbrekende DNMT1 werd uitgedrukt in E.coli en gezuiverd tot homogeniteit volgens eerder gepubliceerde procedures41. Om ervoor te zorgen dat het gezuiverde enzym actief was, werd een discontinue endonuclease-gekoppelde test gebruikt om DNA-methylatieactiviteit36 te onderzoeken. Deze test maakt gebruik van een duplex-DNA van 32 basenparen met een enkele gehemimethyleerde CpG op een Sau3A1-splitsingsplaats. Sau3...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om remmers van DNA-methyltransferasen te identificeren en te karakteriseren, moet de activiteit van het enzym worden gemeten. Er bestaan verschillende methoden voor het onderzoeken van DNA-methyltransferase-activiteit. Activiteit wordt vaak gecontroleerd met behulp van radioactiviteit; overdracht van de gelabelde methylgroep van SAM kan worden gekwantificeerd 29,30,31,32,33,34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Bucknell University en het Department of Chemistry voor hun steun aan dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated MicroplateCorning3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom PlatesThermoFisher249570
Bovine Serum AlbuminNEBB9000S
compound 1ChemBridge5812086screening compound; resuspended in DMSO tot 10 mM
compound 2ChemBridge6722175screening compound; resuspended in DMSO tot 10 mM
compound 3ChemBridge5249376screening compound; resuspended in DMSO tot 10 mM
DithiothreitolSigmaD0632
Gla ISibEnzymeE494methyl-gevoelige endonuclease
GlycerolRPIG22025
Magnesium ChlorideSigmaM0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)IDTcustom synthesizedintern gequenched hairpin DNA (substraat)
Potassium GlutamateSigmaG1501
S-adenosylmethionineSigmaA4377methyl-donerende co-factor (substraat)
Tris BaseRPIT60040

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369(2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15(2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44(2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752(2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56(2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA MethylationDNA MethyltransferaseMethylation AssayFluorescence AssayEndonuclease Coupled AssayDNMT1 InhibitorsPlate ReaderGla I EnzymeSmall Molecule InhibitorsEpigenetic Regulation

Gerelateerde artikelen