Methodenartikel

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DOI:

10.3791/62949

⸱

5 augustus 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methylatie, een vorm van epigenetische genregulatie, is belangrijk voor de normale cellulaire functie. In cellen stellen eiwitten genaamd DNA-methyltransferasen (DNMT's) het DNA-methylatiepatroon vast en onderhouden het. Veranderingen in het normale DNA-methylatiepatroon zijn gekoppeld aan de ontwikkeling en progressie van kanker, waardoor DNMT's potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen zijn. Het identificeren en karakteriseren van nieuwe kleine molecuulremmers van deze enzymen is dus van groot belang. Dit artikel presenteert een protocol dat kan worden gebruikt om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers. De continue gekoppelde kinetische test maakt het mogelijk om de initiële snelheden van DNA-methylatie te bepalen in de aan- en afwezigheid van potentiële kleine molecuulremmers. De test gebruikt de methylgevoelige endonuclease Gla I om methylering van een gehemimethyleerd DNA-substraat te koppelen aan fluorescentiegeneratie.

Deze continue test maakt het mogelijk om de enzymactiviteit in realtime te volgen. Het uitvoeren van de test in kleine volumes in microtiterplaten verlaagt de kosten van reagentia. Met behulp van deze test werd een klein voorbeeldscreening uitgevoerd op remmers van DNMT1, het meest voorkomende DNMT-isozym bij mensen. Het sterk gesubstitueerde anthrachinon natuurlijke product, laccaïnezuur A, is een krachtige, DNA-competitieve remmer van DNMT1. Hier onderzoeken we drie potentiële kleine molecuulremmers - anthrachinonen of anthrachinonachtige moleculen met één tot drie substituenten - in twee concentraties om het testprotocol te beschrijven. Initiële snelheden worden gebruikt om de procentuele activiteit te berekenen die wordt waargenomen in de aanwezigheid van elk molecuul. Een van de drie onderzochte verbindingen vertoont concentratieafhankelijke remming van DNMT1-activiteit, wat aangeeft dat het een potentiële remmer van DNMT1 is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methylatie is een belangrijk epigenetisch merkteken dat genexpressie en chromatinestructuur reguleert. Methylering treedt voornamelijk op in CpG-dinucleotiden - cytosine gevolgd door guanosine; de methylgroep wordt toegevoegd aan de 5-positie van cytosine. Correcte DNA-methylatiepatronen, en dus de juiste genexpressie, zijn nodig voor een geschikte cellulaire ontwikkeling en functie. Veel ziektetoestanden zijn in verband gebracht met veranderingen in het normale methylatiepatroon 1,2,3. Er is bijvoorbeeld een verband tussen kankerinitiatie en progressie en veranderingen i....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid testoplossingen voor het scherm voor

OPMERKING: De concentraties van substraten die in deze test worden gebruikt, kunnen worden aangepast. Voor RFTS-ontbrekende DNMT1 zijn de experimenteel bepaalde Km-waarden voor het haarspeld-DNA-substraat en SAM 1-2 nM en 2 μM, respectievelijk26,40.

  1. Bereid 600 μL van elke testconditie die wordt getest in microcentrifugebuizen op ijs.
    OPMERKING: Het totale volume van de benodigde testoplossing is afhankelijk van het aantal replicaties dat wordt uitgevoerd. Elke testvoorwaarde werd in drievoud uitg....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Actieve DNMT1 is een voorwaarde voor deze analyse. RFTS-ontbrekende DNMT1 werd uitgedrukt in E.coli en gezuiverd tot homogeniteit volgens eerder gepubliceerde procedures41. Om ervoor te zorgen dat het gezuiverde enzym actief was, werd een discontinue endonuclease-gekoppelde test gebruikt om DNA-methylatieactiviteit36 te onderzoeken. Deze test maakt gebruik van een duplex-DNA van 32 basenparen met een enkele gehemimethyleerde CpG op een Sau3A1-splitsingsplaats. Sau3.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om remmers van DNA-methyltransferasen te identificeren en te karakteriseren, moet de activiteit van het enzym worden gemeten. Er bestaan verschillende methoden voor het onderzoeken van DNA-methyltransferase-activiteit. Activiteit wordt vaak gecontroleerd met behulp van radioactiviteit; overdracht van de gelabelde methylgroep van SAM kan worden gekwantificeerd 29,30,31,32,33,34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Bucknell University en het Department of Chemistry voor hun steun aan dit werk.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated MicroplateCorning3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom PlatesThermoFisher249570
Bovine Serum AlbuminNEBB9000S
compound 1ChemBridge5812086screening compound; resuspended in DMSO tot 10 mM
compound 2ChemBridge6722175screening compound; resuspended in DMSO tot 10 mM
compound 3ChemBridge5249376screening compound; resuspended in DMSO tot 10 mM
DithiothreitolSigmaD0632
Gla ISibEnzymeE494methyl-gevoelige endonuclease
GlycerolRPIG22025
Magnesium ChlorideSigmaM0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)IDTcustom synthesizedintern gequenched hairpin DNA (substraat)
Potassium GlutamateSigmaG1501
S-adenosylmethionineSigmaA4377methyl-donerende co-factor (substraat)
Tris BaseRPIT60040

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA MethylationDNA MethyltransferaseMethylation AssayFluorescence AssayEndonuclease Coupled AssayDNMT1 InhibitorsPlate ReaderGla I EnzymeSmall Molecule InhibitorsEpigenetic Regulation

Gerelateerde artikelen