Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

3.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62964

⸱

25 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Samenvatting

Microglia, als hersenbewoner macrofagen, zijn fundamenteel voor verschillende functies, waaronder reactie op omgevingsstress en hersenhomeostase. Microglia kunnen een groot spectrum van activeringsfenotypen aannemen. Bovendien worden microglia die het pro-inflammatoire fenotype ondersteunen geassocieerd met zowel neurologische als neurodegeneratieve aandoeningen. In vitro studies worden veel gebruikt in onderzoek om potentiële therapeutische strategieën in specifieke celtypen te evalueren. In deze context is het bestuderen van microgliale activering en neuro-inflammatie in vitro met behulp van primaire microgliale culturen relevanter dan microgliale cellijnen of van stamcellen afgeleide microglia. Het gebruik van sommige primaire culturen kan echter lijden aan een gebrek aan reproduceerbaarheid. Dit protocol stelt een reproduceerbare en relevante methode voor om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups. Microgliale activering met behulp van verschillende stimuli na 4 h en 24 h door mRNA-expressiekwantificering en een Cy3-kraal fagocytische assay wordt hier gedemonstreerd. Het huidige werk zal naar verwachting een gemakkelijk reproduceerbare techniek bieden voor het isoleren van fysiologisch relevante microglia uit juveniele ontwikkelingsstadia.

Inleiding

Microglia zijn de macrofaagachtige cellen van het centrale zenuwstelsel die zijn afgeleid van erytropoëtische voorlopers van de dooierzak die migreren naar het neuro-epitheel tijdens de vroege embryonale ontwikkeling1. Afgezien van hun immuniteitsfuncties, spelen ze ook een belangrijke rol tijdens de neurologische ontwikkeling, met name voor synaptogenese, neuronale homeostase en myelinisatie2. Op volwassen leeftijd ontwikkelen microglia lange cellulaire processen om de omgeving continu te scannen. In het geval van homeostaserupturen zoals hersenletsel of hersenziekte, kunnen microglia hun morfologische uiterlijk veranderen om een amoeboïde vorm aan te nemen, naar het gewonde gebied te migreren, veel cytoprotectieve of cytotoxische factoren te verhogen en vrij te geven. Microglia hebben heterogene activeringstoestanden, afhankelijk van hun ontwikkelingsstadium en het type opgelopen letsel 3,4,5. In deze studie worden deze activeringstoestanden grofweg ingedeeld in drie verschillende fenotypen: pro-inflammatoire / fagocytische, ontstekingsremmende en immunoregulerende, rekening houdend met het feit dat de situatie in werkelijkheid waarschijnlijk complexer is6.

Het bestuderen van in vivo microgliale activering en screening op neuroprotectieve strategieën in vroege stadia van de ontwikkeling van de hersenen kan een uitdaging zijn vanwege (1) de kwetsbaarheid van dieren vóór het spenen en (2) het lage aantal microgliale cellen. Daarom worden in vitro studies op microglia veel gebruikt voor toxiciteit 7,8,9, neuroprotectieve strategieën 5,10,11,12,13,14 en co-culturen 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro studies kunnen microgliale cellijnen, van stamcellen afgeleide microglia of primaire microgliacultuur gebruiken. Al deze benaderingen hebben voor- en nadelen en de keuze hangt af van de initiële biologische vraag. De voordelen van het gebruik van primaire microgliaculturen zijn de homogene genetische achtergrond, pathogeenvrije geschiedenis en controle van de tijd waarin de microglia worden gestimuleerd na de dood van het dier22.

In de loop der jaren werden verschillende methoden (flowcytometrie, schudden of magnetisch labelen) ontwikkeld voor het kweken van primaire microglia van knaagdieren, zowel pasgeborenen als volwassen 23,24,25,26,27,28,29. In het huidige werk wordt microglia-isolatie van muisneaatpups uitgevoerd met behulp van eerder beschreven magnetisch geactiveerde celsorteertechnologie met behulp van microbead-gecoate anti-muis CD11b 25,27,29. CD11b is een integrine-receptor die tot expressie komt aan het oppervlak van myeloïde cellen, waaronder microglia. Wanneer er geen ontstekingsuitdaging in de hersenen is, zijn bijna alle CD11b + -cellen microglia30. Vergeleken met andere eerder gepubliceerde methoden 23,24,25,26,27,28,29, balanceert het huidige protocol onmiddellijke ex vivo microgliale activeringsanalyses en gemeenschappelijke in vitro primaire microgliale cultuur. Microglia worden dus (1) geïsoleerd op postnatale dag (P)8 zonder myelineverwijdering, (2) gekweekt zonder serum en (3) blootgesteld aan siRNA, miRNA, farmacologische verbinding en/of ontstekingsprikkels slechts 48 uur na hersenisolatie. Elk van deze drie aspecten maakt het huidige protocol relevant en snel. Allereerst maakt het gebruik van pediatrische microglia het mogelijk om dynamische en reactieve levensvatbare cellen in cultuur te verkrijgen zonder dat een extra demyelinisatiestap nodig is die mogelijk de microgliale reactiviteit in vitro zou kunnen wijzigen. Het huidige protocol heeft als doel om zo dicht mogelijk bij de fysiologische omgeving van microglia te komen. Inderdaad, microglia komen nooit serum tegen, en dit protocol vereist ook niet het gebruik van serum. Bovendien voorkomt het blootstellen van microglia al 48 uur na het kweken dat ze hun fysiologische vermogens verliezen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd en alle dieren werden behandeld volgens de institutionele richtlijnen van Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrijk). Magnetische isolatie van microglia uit de hersenen van 24 OF1 muisjongen (zowel mannelijk als vrouwelijk) op P8, verdeeld in 6-well, 12-well of 96-well platen, worden gepresenteerd. Het experimentele werk werd uitgevoerd onder een kap om steriele omstandigheden te behouden.

1. Bereiding van steriele oplossingen voor isolatie en celkweek

  1. Bereid 50 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) zonder Ca2+ en Mg2+ (HBSS-/-) uit de in de handel verkrijgbare 10x-oplossing (zie Materiaal tabel).
  2. Bereid het dissociatiemengsel volgens de samenstelling in tabel 1 met behulp van een in de handel verkrijgbare weefseldissociatiekit (zie materiaaltabel).
  3. Bereid 200 ml 1x HBSS met Ca2+ en Mg2+ (HBSS+/+) uit de in de handel verkrijgbare 10x oplossing.
  4. Bereid 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (celsorteerbuffer genoemd).
  5. Bereid CD11b-microbeads volgens tabel 2.
  6. Bereid 500 ml macrofaag serumvrij kweekmedium (SFM) + 1% penicilline-streptomycine (P / S). Maak aliquots van buizen van 50 ml en bewaar ze bij 4 °C. Dit wordt later in de tekst het microgliamedium genoemd.
    OPMERKING: Alle isolatieoplossingen moeten vers worden bereid onder steriele omstandigheden op de experimenteerdag en op ijs worden bewaard. Microglia celkweekmedium kan worden bereid, gealiquoteerd in buizen van 50 ml en bewaard op 4 °C voor toekomstig gebruik. Filtratie is niet nodig.

2. Hersendissectie

  1. Onthoofd het hoofd van de pup met een grote schaar zonder voorafgaande algemene anesthesie.
  2. Knip de huid van de nek tot de neus na de sagittale hechting (15-20 mm) met een kleine schaar (figuur 1A-C).
  3. Steek de uiteinden van een kleine schaar in het Foramen magnum parallel aan de schedel. Snijd van elke kant voorzichtig naar de ogen (figuur 1D, E).
  4. Knip tussen de ogen met een kleine schaar om de schedel en de hersenen los te maken van het hoofd (figuur 1F).
  5. Pak met twee tangen de schedel dicht bij de olfactorische bollen en scheur de schedel voorzichtig, waarbij je ervoor zorgt dat de onderliggende hersenen niet worden beschadigd (figuur 1G-I).
  6. Verwijder cerebellum en reukbol met een scheermesje en snijd de hersenen in twee stukken (figuur 1J).
  7. Plaats de hersenstukken in een petrischaaltje met 30-40 ml HBSS-/- (figuur 1K).

3. Hersendissociatie en magnetische microgliale isolatie

OPMERKING: Alle celmanipulaties en resuspensaties moeten met grote voorzichtigheid worden uitgevoerd met een pipet van 1.000 μL. Het toepassen van een hoge mechanische actie kan microgliacellen activeren of doden.

  1. Breng 12 hersenstukken (~1,2 g) per dissociatiebuis met dissociatiemengsel volgens tabel 1. Voor 24 pups waren vier C-Tubes nodig (figuur 2A-B).
  2. Plaats C-Tubes op de dissociator (met de verwarmingsmodus). Start het geoptimaliseerde NTDK-programma in de apparatuur volgens de instructies van de fabrikant (figuur 2D).
  3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 20 s (bij 4 °C) om alle cellen te verzamelen. Voltooi de mechanische dissociatie door drie keer op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL (figuur 2E).
  4. Breng de cellen over naar vier buizen van 15 ml + zeven. Spoel de zeven af met 10 ml HBSS+/+ (figuur 2F).
  5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 10 ml HBSS+/+ (figuur 2G).
  6. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspeneer de pellet voorzichtig met 6 ml sorteerbuffer (stap 1.4) (figuur 2H).
  7. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Voeg 200 μL CD11b-microbead-oplossing (stap 1.5) per buis toe en resuspenseer voorzichtig (figuur 2I).
  8. Incubeer de buizen gedurende 15-20 min bij 4 °C. Resuspeneer de pellet voorzichtig met 6 ml sorteerbuffer (figuur 2I-J).
  9. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 8 ml sorteerbuffer (figuur 2K).
  10. Volg het POSSEL-programma op de separator (zie Materiaaltabel) om acht kolommen voor te bereiden. Breng cellen 1 ml bij 1 ml over op de kolom. Wacht tot alle cellen zijn doorgegeven voordat u nog een ml toevoegt. Elute CD11b+ cellen op steriele elutieplaat met 1 ml sorteerbuffer (figuur 2L).
  11. Pool CD11b+ cellen in een nieuwe buis van 50 ml (figuur 2M).
  12. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 10 ml koud microgliamedium (stap 1.6) (figuur 2N).
  13. Tel de CD11b+-cellen. Bij P8 zou men ~650.000 cellen per brein moeten verkrijgen.
    OPMERKING: In het huidige protocol werden de cellen geteld met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie Tabel van materialen).
  14. Resuspensieer de cellen in koud microglia medium tot een eindconcentratie van 650.000-700.000 cellen/ml en dispense in celkweekplaten.
    OPMERKING: De 6-well platen zijn voor Western Blot (2 ml per put); de 12-well platen zijn voor RT-qPCR-analyse (1 ml per put) en de 96-well platen zijn voor fagocytische assay (250 μL per put); alle drie werden ze voor dit werk gebruikt. In dit manuscript worden de resultaten van de Western Blot-analyse echter niet getoond, maar het is mogelijk om met dit protocol te presteren.
  15. Zet de borden een nacht op 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium voorzichtig met een pipet van 1.000 μL met voorverwarmd microgliamedium.
  16. Plaats de platen op 37 °C met 5% CO2 een nacht voor stimulatie.
    OPMERKING: Het isoleren van microglia van meer dan 36 pups en na P9 worden niet aanbevolen. Dit verhoogt het risico op besmetting en ophoping van celresten om microglia te activeren.

4. Celstimulaties

  1. Bereid stimulatiereagentia volgens tabel 3 met behulp van de in de handel verkrijgbare reagentia (zie materiaaltabel).
  2. Voeg het juiste volume toe aan elke gestimuleerde put.
    OPMERKING: Het juiste volume hangt af van de concentratie van de stimulus en de grootte van de put.
  3. Plaats de platen op 37 °C met 5% CO2tot het einde van de stimulatie op 6 h, 24 h of 48 h.
  4. Voor de Western Blot-analyse aspirateer je het supernatant en voeg je 50 μL eiwitlysisbuffer (zie Materiaaltabel) toe met een pipet. Kras met behulp van tips de onderkant van de plaat om de gelyseerde cellen los te maken en breng ze over naar buizen van 1,5 ml. Bewaren bij -80 °C.
    OPMERKING: De kweekplaten kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard als het supernatant correct wordt aangezogen.
  5. Voor RT-qPCR-analyse 6,31 ademt u het supernatant op en slaat u de kweekplaten direct op bij -80 °C tot mRNA-extractie (stap 5).
  6. Voor de fagocytische test, zie stap 6.

5. mRNA-extractie en RT-qPCR-analyse

  1. Voer RNA-extractie, RT-PCR en RT-qPCR uit volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel). Zie tabel 4 voor de primerreeksen 5,6,31.
  2. Voer rt-qPCR-analyse uit door het eerder gepubliceerde rapportte volgen 5.

6. Fagocytische test

  1. Stimuleer de cellen en voer fagocytische testen uit tijdens de laatste 3 uur van de stimulatie. Bijvoorbeeld, voor stimulatie van 6 uur, start de fagocytische assay na 3 h stimulatie; en voor stimulatie van 12 uur, start de fagocytische test 9 uur na het begin van de stimulatie.
  2. Bereken het aantal kralen dat nodig is om te bereiden, rekening houdend met de verhouding (1 cel: 50 kralen). Voor één put van de 96-well plaat zijn 8,1 x 106 kralen nodig. Bereid het kralenmengsel volgens tabel 5.
    OPMERKING: Vortex de voorraadflacon van de kralen voorzichtig voordat u deze aan het PBS / FBS-mengsel toevoegt.
  3. Incubeer gedurende 1 uur in een waterbad bij 37 °C. Vortex elke 10 min.
  4. Bereken het oplossingsvolume dat aan elke put moet worden toegevoegd. Voeg de oplossing toe en incubeer gedurende 3 uur.
  5. Spoel de putjes drie keer af met 1x PBS. Lees de fluorescentie-emissie bij 550 nm (Cy3-emissiegolflengte).

7. Zuiverheid kwaliteitscontrole

  1. Evalueer de zuiverheid van CD11b magnetische isolatie door flowcytometrie (FACS) (voor en na celsortering) en voer vervolgens de RT-qPCR uit.
    1. Tel de cellen en resuspendeer in FACS-buffer (PBS + 2 mM EDTA + 0,5% runderserumalbumine) om een verdunning van 10 x 106 cellen / ml te verkrijgen na stap 3,5 en stap 3,14.
    2. Na 15 minuten van de conventionele Fc-blokkeringvan 32,33, incubeer de cellen gedurende 15 minuten met levensvatbaarheidsonde (FVS780) en fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen muis CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 of hun overeenkomstige controle-isotypen32,33 in de door de fabrikanten aanbevolen concentratie (zie materiaaltabel).
    3. Was de cellen met FACS-buffer, fixeer en permeabiliseer met een in de handel verkrijgbare permeabilisatiekit (zie Materiaaltabel).
    4. Voer fc-blokkering opnieuw uit op de gepermeabiliseerde cellen en incubeer vervolgens met fluorofoor-geconjugeerd antilichaam tegen NeuN (zie materiaaltabel) of het controle-isotype gedurende 15 minuten.
    5. Voer FACS-analyse uit na het wassen met FACS-buffer.
    6. Na uitsluiting van de doubletten en de dode cellen op basis van respectievelijk morfologische parameters en FVS780-kleuring, selecteert u de gatingstrategie voor de oppervlakteexpressie van CX3CR1 (microglia), ACSA-2 (astrocyten), O4 (oligodendrocyten) en intracellulaire aanwezigheid van NeuN (neuronen) voor de analyse van het percentage positieve cellen.
  2. Na stap 5, extraheer mRNA en voer RT-qPCR uit om Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin en Gfap mRNA te kwantificeren. Normaliseer Cq met Rpl13a-mRNA als reporter en voer een relatieve expressie uit voor Itgam-mRNA .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Microglia is de in het CZS verblijvende macrofaag die wordt geactiveerd wanneer deze wordt blootgesteld aan milieu-uitdagingen (trauma, toxische moleculen, ontsteking)4,5,6,34 (figuur 3A). In vitro studies op microglia worden vaak gebruikt om cel-autonome mechanismen gerelateerd aan die omgevingsuitdagingen te evalueren en de activeringstoestand na farmaco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige werk presenteert een primaire microgliale celcultuur met behulp van magnetisch gesorteerde CD11b + -cellen. Naast de microgliale functionele evaluatie (RT-qPCR en fagocytische assays) werd ook de microgliale cultuurzuiverheid bepaald.

Klassieke microgliacelculturen worden vaak gegenereerd uit P1- of P2-knaagdierneaatheren en co-cultuur met astrocyten gedurende ten minste 10 dagen. Microglia worden vervolgens mechanisch gescheiden met behulp van een orbitale shaker. De methode om mi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Figuren zijn gemaakt met Behulp van BioRender. Onderzoek wordt gefinancierd door Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, en een aanvullende subsidie van Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS en Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilisatiekitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbumineMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocale microscoopLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Celcultuur 12-well plaat, platte bodem + dekselDutscher353043
Falcon Celcultuur 96-well plaat, platte bodem + dekselDutscher353072
Falcon buizen 50 mLDutscher352098
Fc blokkeringsreagens (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescentie microscoopNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator met verwarmersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA syntheseBio-rad1708890
Latex kralen, amine-gemodificeerd polystyreen, fluorescent roodSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysacchariden (LPS) uit Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-vrij mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA StockoplossingMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 stuksMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociatie Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conische CentrifugeerbuizenThermo Scientific362694
OPTILUX Petri schotel - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteïneR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteïneR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteïneR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

Referenties

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286(2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819(2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297(2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378(2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463(2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748(2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769(2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15(2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237(2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166(2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242(2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22(2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428(2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809(2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545(2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99(2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277(2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van microgliamagnetische celstortingprimaire microglia kweekpasgeboren muizenhersenenCD11b microbeadsfagocytose assayflowcytometrieconfocale microscopiemicroglia activatieRT qPCR analyse
Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.