Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Summary

Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.

Abstract

Peptidomics kan worden gedefinieerd als de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van peptiden in een biologisch monster. De belangrijkste toepassingen omvatten het identificeren van de peptide biomarkers van ziekte of omgevingsstress, het identificeren van neuropeptiden, hormonen en bioactieve intracellulaire peptiden, het ontdekken van antimicrobiële en nutraceutische peptiden uit eiwithydrolysaten, en kunnen worden gebruikt in studies om de proteolytische processen te begrijpen. De recente vooruitgang in monstervoorbereiding, scheidingsmethoden, massaspectrometrietechnieken en computationele hulpmiddelen met betrekking tot eiwitsequencing heeft bijgedragen aan de toename van het geïdentificeerde aantal peptiden en peptidomes gekarakteriseerd. Peptidomic studies analyseren vaak peptiden die van nature in cellen worden gegenereerd. Hier wordt een monstervoorbereidingsprotocol op basis van warmte-inactivatie beschreven, dat protease-activiteit en extractie met milde omstandigheden elimineert, zodat er geen splitsing van peptidebindingen is. Daarnaast wordt ook de relatieve kwantificering van peptiden met behulp van stabiele isotoopetikettering door reductieve methylering van amines getoond. Deze etiketteringsmethode heeft enkele voordelen omdat de reagentia in de handel verkrijgbaar zijn, goedkoop in vergelijking met andere, chemisch stabiel en de analyse van maximaal vijf monsters in een enkele LC-MS-run mogelijk maken.

Introduction

"Omics" wetenschappen worden gekenmerkt door de diepe analyse van een molecuulset, zoals DNA, RNA, eiwitten, peptiden, metabolieten, enz. Deze gegenereerde grootschalige datasets (genomics, transcriptomics, proteomics, peptidomics, metabolomics, etc.) hebben een revolutie teweeggebracht in de biologie en geleid tot een geavanceerd begrip van biologische ^processen1. De term peptidomics begon te worden geïntroduceerd in het begin van de ^20e eeuw, en sommige auteurs hebben ernaar verwezen als een tak van proteomics2. Peptidomics heeft echter verschillende bijzonderheden, waarbij het belangrijkste belang is om het....

Protocol

De volgende procedure voor peptide-extractie en reductieve methylatie werd aangepast van eerder gepubliceerde procedures24,25,26,27. Dit protocol volgde de richtlijnen van de National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA) en werd goedgekeurd door de Ethics Commission for Animal Use (CEUA) van het Bioscience Institute van de Sao Paulo State University. De protocolstappen zijn weergegeven in figuur 1.

OPMERKING: Bereid alle waterige oplossingen in ultrapuur water.

Results

De resultaten van de runs die op de massaspectrometer worden uitgevoerd, worden opgeslagen in onbewerkte gegevensbestanden die kunnen worden geopend in de massaspectrometersoftware. In de MS-spectra is het mogelijk om piekgroepen te observeren die gelabelde peptiden vertegenwoordigen volgens het gebruikte etiketteringsschema, variërend van 2-5 labels. In figuur 2 worden bijvoorbeeld paren pieken die in een chromatografische tijd zijn gedetecteerd, weergegeven in een experiment waarbij slecht.......

Discussion

In de meeste peptidomics-studies is een van de kritieke stappen zonder twijfel de monstervoorbereiding die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om de aanwezigheid van peptidefragmenten gegenereerd door proteasen na een paar minuten post-mortem te voorkomen. De eerste studies op hersenextracten bereid uit niet-microgolfmonsters toonden een groot aantal eiwitfragmenten aan die aanwezig waren in de 10-kDa-microfiltraten. Er zijn verschillende benaderingen beschreven om peptidespectra van eiwitafbraak te voorkomen: gerichte

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa cut-off filters	Merck Millipore	UFC801024	Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	11213
analytical column (EASY-Column)	EASY-Column	(SC200)	10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Fluorescamine	Sigma-Aldrich	F9015
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	252549
Formaldehyde-13C, d2, solution	Sigma-Aldrich	596388
Formaldehyde-d2 solution	Sigma-Aldrich	492620
Formic acid	Sigma-Aldrich	33015
Fume hood	Quimis	Q216
Hydrochloric acid - HCl	Sigma-Aldrich	258148
LoBind-Protein retention tubes	Eppendorf	EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific	LTQ Velos
Microwave oven	Panasonic	NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC	Thermo Fisher Scientific	LC140
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions Inc.	VERSION 8.5
Phosphate-buffered saline	Invitrogen	3002	tablets
precolumn (EASY-Column)	Thermo Fisher Scientific	(SC001)	2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1
Refrigerated centrifuge	Hermle	Z326K	for conical tubes
Refrigerated centrifuge	Vision	VS15000CFNII	for microtubes
Reversed-phase cleanup columns   (Oasis HLB 1 cc Cartridge)	Waters	186000383	Oasis HLB 1 cc Cartridge
Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN	Sigma-Aldrich	190020
Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN	Sigma-Aldrich	156159
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763	NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Sonicator	Qsonica	Q55-110
Standard peptide	Proteimax		amino acid sequence: LTLRTKL
Triethylammonium buffer - TEAB 1 M	Sigma-Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid - TFA	Sigma-Aldrich	T6508
Ultra purified water	Milli-Q	Direct-Q 3UV
Vacuum centrifuge	GeneVac	MiVac DNA concentrator
Water bath	Cientec	266
Xcalibur Software	ThermoFisher Scientific	OPTON-30965