Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62974

⸱

8 september 2021

 ,  , 
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we het gebruik van de single-molecule beeldvormingsmethode, DNA Curtains, om het biofysische mechanisme van EWS-FLI1-condensaten te bestuderen die zich op DNA assembleren.

Samenvatting

De fusiegenen die het gevolg zijn van chromosomale translocatie zijn gevonden in veel solide tumoren of leukemie. EWS-FLI1, dat behoort tot de FUS/EWS/TAF15 (FET) familie van fusie-oncoproteïnen, is een van de meest betrokken fusiegenen in Ewing-sarcoom. Deze FET-familie fusie-eiwitten herbergen meestal een laagcomplex domein (LCD) van FET-eiwit op hun N-terminus en een DNA-bindend domein (DBD) op hun C-terminus. Ews-FLI1 is bevestigd biomoleculaire condensaten te vormen op zijn doelbindingsloci als gevolg van LCD-LCD- en LCD-DBD-interacties, en deze condensaten kunnen RNA-polymerase II rekruteren om de gentranscriptie te verbeteren. Hoe deze condensaten op hun bindingsplaatsen worden geassembleerd, blijft echter onduidelijk. Onlangs werd een biofysicamethode met één molecuul - DNA Curtains - toegepast om deze assemblageprocessen van EWS-FLI1-condensaten te visualiseren. Hier worden de gedetailleerde experimentele protocol- en data-analysebenaderingen besproken voor de toepassing van DNA-gordijnen bij het bestuderen van de biomoleculaire condensaten die zich op doel-DNA assembleren.

Inleiding

Transcriptionele regulatie is een cruciale stap voor nauwkeurige genexpressie in levende cellen. Veel factoren, zoals chromosomale modificatie, transcriptiefactoren (TF's) en niet-coderende RNA's, nemen deel aan dit gecompliceerde proces 1,2,3. Onder deze factoren dragen TF's bij aan de specificiteit van transcriptionele regulatie door specifieke DNA-sequenties die bekend staan als promotors of versterkers te herkennen en vervolgens andere functionele eiwitten te rekruteren om transcriptie 4,5,6,7 te activeren of te onderdrukken. Hoe deze TF's erin slagen om naar hun doellocaties in het menselijk genoom te zoeken en te interageren met DNA bedekt met histonen en niet-histon DNA-bindende eiwitten, heeft wetenschappers decennialang verbijsterd. In de afgelopen jaren zijn verschillende klassieke modellen voor het doelzoekmechanisme van TF's gebouwd om te beschrijven hoe ze "schuiven", "hoppen", "springen" of "intersegmentoverdracht" langs de DNA-keten 8,9,10,11. Deze modellen zijn gericht op het zoekgedrag op het DNA van één enkel TF-molecuul. Recente studies tonen echter aan dat sommige TF's vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) ondergaan, hetzij alleen in de kern, hetzij met het Mediator-complex12. De waargenomen druppeltjes van TF's zijn geassocieerd met de promotor- of enhancerregio's, wat de rol van biomoleculaire condensaatvorming in transcriptie en het driedimensionale genoom 13,14,15 benadrukt. Deze biomoleculaire condensaten zijn gekoppeld aan membraan-ontbrekende compartimenten in vivo en in vitro. Ze worden gevormd via LLPS, waarbij modulaire biomacromolecules en intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) van eiwitten twee belangrijke drijvende krachten zijn van multivalente interacties16. Tf's zoeken dus niet alleen DNA, maar functioneren ook synergetisch binnen deze condensaten 4,17,18. Tot op heden blijft de biofysische eigenschap van deze transcriptiecondensaten op DNA onduidelijk.

Daarom was deze studie gericht op het toepassen van een single-molecule methode - DNA Curtains - om de vorming en dynamiek van de transcriptiecondensaten gevormd door TF's op DNA in vitro direct in beeld te brengen. DNA Curtains, een high-throughput in vitro beeldvormingsplatform om de interactie tussen eiwitten en DNA te bestuderen, is toegepast in DNA-reparatie 19,20,21, target search22 en LLPS 17,23,24. De flowcel van DNA Curtains is bedekt met gebiotinyleerde lipide bilayers om het oppervlak te passiveren en de biomoleculen op het oppervlak te laten diffunderen. De nanogefabriceerde zigzagpatronen beperken de beweging van DNA. Gebiotinyleerde Lambda DNA-substraten kunnen langs de barrièreranden worden uitgelijnd en worden uitgerekt door de georiënteerde bufferstroom. Dezelfde begin- en eindsequenties van alle moleculen maken het mogelijk om het eiwit op DNA te volgen en beschrijven de positieverdeling van de bindingsgebeurtenissen25,26. Bovendien helpt de combinatie van DNA-gordijnen met totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) de achtergrondruis te minimaliseren en signalen op één molecuulniveau te detecteren. DNA Curtains zou dus een veelbelovende methode kunnen zijn om de dynamiek van transcriptiecondensaatvorming op DNA-motieven te onderzoeken. Dit artikel beschrijft het voorbeeld van een FUS/EWS/TAF15 (FET) familiefusie oncoproteïne, EWS-FLI1, gegenereerd door chromosomale translocatie. Lambda-DNA met 25× GGAA - de bindingssequentie van EWS-FLI127 - werd gebruikt als dna-substraat in de DNA Curtains-experimenten om te observeren hoe EWS-FLI1-moleculen LLPS ondergaan op DNA. Dit manuscript bespreekt het experimentele protocol en de methoden voor gegevensanalyse in detail.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van de lipide bilayer master mix

  1. Spoel glazen injectieflacons met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) en 99% ethanol en droog ze in een droogoven van 60 °C.
  2. Maak de lipide master mix door 1 g van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 100 mg polyethyleenglycol-gereageerde (PEGylated) lipiden (18:1 van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy (polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout) (PEG2000 DOPE) en 25 mg biotinyled lipiden (18:1 van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(cap biotinyl) (natriumzout) (Biotinyl Cap DOPE)) op te lossen in 10 ml chloroform.
  3. Bereid 1 ml aliquots van de lipidemastermix per injectieflacon en bewaar ze bij -20 °C in schone glazen injectieflacons.
    OPMERKING: Bewaar de opgeloste lipide in glazen injectieflacons en bedek de dop van de injectieflacon met parafilm tijdens opslag.

2. Bereiding van liposoomoplossing

  1. Spoel een glazen injectieflacon van 2 ml met ddH2O en 99% ethanol en droog deze grondig in een droogoven van 60 °C.
  2. Spoel een glazen spuit van 250 μL met chloroform en breng vervolgens 200 μL van het lipidemastermengsel over in de injectieflacon met droog glas.
  3. Gebruik een stikstofspuitpistool om N2 zachtjes te laten stromen terwijl u de injectieflacon continu in één richting draait.
    OPMERKING: De N2 helpt de chloroform te verdampen en de resterende lipiden vormen een dunne film op de wand van de glazen injectieflacon. Pas de stikstofstroom aan om in het begin zeer zacht te zijn en verhoog de stroom wanneer er een witte film in de injectieflacon verschijnt; voltooi dit verdampingsproces binnen 5 minuten.
  4. Breng de glazen injectieflacon gedurende 16-24 uur over naar een vacuümdroogoven bij kamertemperatuur (RT) voor volledige verwijdering van de chloroform uit de lipiden.
  5. Voeg 2 ml verse lipidenbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 100 mM NaCl) toe aan de glazen injectieflacon en los de lipiden op bij RT gedurende 2 uur. Vortex de oplossing meerdere keren en breng deze over in een polypropyleen kweekbuis van 5 ml.
  6. Soniceer de lipide-oplossing op ijs met een micro-tip sonicator om kleine unilamellaire blaasjes te vormen, met behulp van de volgende instellingen: 6 s aan-12 s uit (20% amplitude) gedurende 6 cycli, dan 6 s aan-6 s uit (30% amplitude) gedurende 3 cycli, ten slotte 10 s aan (40% amplitude).
    OPMERKING: De temperatuurstijging tijdens ultrasoonapparaat kan resulteren in het barsten van schuim en de liposomen vernietigen. Controleer daarom de toestand van het schuim en de temperatuur en vul het ijs regelmatig aan.
  7. Filtreer de liposomen door een 0,22 μm nylon spuitfilter, aliquot, en bewaar het bij 4 °C.
    OPMERKING: Omdat hun mobiliteit afneemt bij langdurige opslag, moeten de liposomen binnen 2-3 maanden worden gebruikt of vers worden bereid voor gebruik.

3. Sequentie klonen en biotinyleren van Lambda DNA

  1. Invoeging van de bindmotieven in Lambda DNA
    1. Verwerk het doelfragment met de bindingsmotieven en Lambda-DNA met NheI en XhoI. Ligaat het doelfragment met Lambda DNA met behulp van T4 ligase 's nachts bij RT.
    2. Kweek E.coli VCS257-cellen in antibioticavrij LB-medium totdat de OD600 0,6 bereikt. Bewaar de bacteriën bij 4 °C voor later gebruik.
    3. Verwarm de ligatieoplossing gedurende 20 minuten op 65 °C om de T4-ligase te denatureren.
    4. Ontdooi het Lambda-faagextract, meng het voorzichtig met het geligeerde product door te pipetteren met stompe uiteinden en incubeer het mengsel op RT gedurende 2 uur.
    5. Voeg 500 μL SM-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl en 8 mM MgCl2, gefilterd door een filter van 0,22 μm) en 20 μL chloroform toe aan het verpakkingsmengsel uit stap 3.1.4, meng goed en centrifugeer de oplossing.
      OPMERKING: De activiteit van het verpakkingsextract kan gedurende langere perioden op 4 °C worden gehouden.
    6. Bereid het reactiemengsel door 10 μL verpakkingsextract met 90 μL SM-buffer en 100 μL vcs257-cellen (vanaf stap 3.1.2) door elkaar te mengen en het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 °C te incuberen.
      OPMERKING: De concentratie van de verpakkingsoplossing is afhankelijk van de dichtheid van de faagplakken op de volgende dag; het kan worden verdund of toegevoegd als dat nodig is.
    7. Neem ~ 5 ml gesmolten topagar (22 g / L NZCYM-bouillon met 15 g / L agar) in een buis van 15 ml. Zodra de bovenste agar is afgekoeld tot ~42 °C, voegt u het reactiemengsel (vanaf stap 3.1.6) langzaam toe met behulp van een stompe pipet en giet u de vloeistof op een antibioticavrije LB-agarplaat. Bewaar de plaat een nacht in een incubator van 37 °C.
    8. Bevestig de positieve plaques tussen de transparante faagplaques op de bovenste agarplaat door PCR. Breng de positieve plaques met een pipet over op een nieuwe bovenste agarplaat en bewaar de plaat een nacht in een incubator van 37 °C.
    9. Voeg 400 μL VCS257-cellen toe aan 400 μL buffer met 10 mM MgCl2 en 10 mM CaCl2, ent één plaque in dit celmengsel en incubeer deze in een 37 °C shaker bij 250 rpm gedurende 15 min.
    10. Voeg 800 μL van deze suspensie die de faagplaque bevat toe aan 200 ml NZCYM-bouillon in een kolf van 2 L en incubeer deze in een shaker van 37 °C bij 125 tpm.
    11. Meet OD600 van de bacteriële suspensie na ~ 4 uur teelt. Houd er rekening mee dat de OD600-waarde eerst stijgt en vervolgens daalt naar een dieptepunt bij ~ 0,2. Stop de incubatie wanneer de OD600-waarde weer gaat stijgen, voeg 500 μL chloroform toe en schud bij 80 tpm gedurende nog eens 5 minuten.
      OPMERKING: De toename van OD600 na de trog zal snel optreden; daarom moet de OD600-waarde vaker worden gemeten wanneer deze daalt tot 0,3 om overmatige VCS257-celgroei in de cultuur te voorkomen.
    12. Breng de faagcultuur over in een fles van 500 ml, voeg 11,7 g NaCl toe en schud de fles. Incubeer de fles op ijs gedurende 10 minuten.
    13. Breng de suspensie gelijkmatig over in vier buizen van 50 ml. Centrifugeer de buizen op 12.000 x g gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Al deze centrifugatiestappen in rubriek 3.1 moeten bij 4 °C worden uitgevoerd.
    14. Breng de supernatanten over in vier nieuwe buizen van 50 ml en centrifugeer opnieuw met dezelfde snelheid gedurende 5 minuten.
    15. Verzamel de supernatanten, voeg 10% (w/v) PEG8000 poeder toe en draai op 4 °C om gedurende 30 minuten te incuberen.
    16. Centrifugeer de suspensies uit stap 3.1.15 bij 12.000 x g gedurende 15 minuten om de faagpellets te verkrijgen.
    17. Resuspensieer de pellets in 1 ml faagverdunningsbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl en 10 mM MgCl2) in vier buizen en giet alle 4 ml van deze mengsels in een buis van 50 ml.
    18. Voeg RNase A (10 mg/ml) en DNase I (4 mg/ml) toe aan 20 μg/ml en 5 μg/ml eindconcentraties en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om overtollige nucleïnezuren af te breken.
    19. Voeg 4,5 ml 300 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,76 ml 0,5 m ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1,67 ml 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 75 μl proteïnase K (10 mg / ml) toe aan de buis en incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
    20. Voeg 4,5 ml voorgekoeld kaliumacetaat van 3 M toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
    21. Centrifugeer op 8.000 x g gedurende 10 minuten en draai het supernatant nog eens 5 minuten op 10.000 x g.
    22. Voeg 70% volume isopropanol toe aan het verzamelde supernatant (vanaf stap 3.1.21) met voldoende menging, incubeer bij RT gedurende 2 minuten en centrifugeer vervolgens bij 8.000 x g gedurende 10 minuten. Gooi de isopropanol weg en draai opnieuw gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: De DNA-pellet wordt vóór de eerste 10 minuten centrifugatie uitgesmeerd; de pellet wordt geconcentreerd op de bodem van de buis na de tweede 5 minuten centrifugatie.
    23. Was het neergeslagen DNA met 2-3 ml 70% ethanol en draai het opnieuw gedurende 1 minuut. Droog de pellet bij 4 °C gedurende 2 uur en resuspenseer het DNA vervolgens in 500 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 1 mM EDTA) een nacht bij RT.
    24. Breng het DNA over naar een buis van 1,5 ml en draai het gedurende 3 minuten op 18.000 x g . Breng het DNA over naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Voer het gezuiverde Lambda-DNA uit en bewaar het bij -20 °C.
  2. Biotine-Lambda DNA voorbereiding
    1. Smelt 50 μL gezuiverd Lambda-DNA met gekloonde motieven bij 65 °C gedurende 10 min.
      OPMERKING: Aangezien Lambda-DNA ~ 48 kbp lang is, moet het worden verwarmd voordat het pipettert om DNA-breuken te voorkomen.
    2. Meng 50 μL Lambda DNA, 1 μL Biotine primer (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) en 54 μL ddH2O samen. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 65 °C en laat het op de bank liggen om af te koelen tot RT.
    3. Voeg 12 μL 10x T4 ligasebuffer en 3 μL T4 ligase toe en incubeer bij RT gedurende enkele uren of een nacht.
    4. Voeg een gelijk volume fenol-chloroform (1:1) mengsel toe aan het ligatieproduct, meng onmiddellijk goed en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 2 minuten bij RT.
    5. Breng de bovenste waterige fase met het DNA voorzichtig over in een nieuwe buis, voeg een gelijk volume chloroform toe, meng goed en centrifugeer vervolgens gedurende 2 minuten op 12.000 x g .
    6. Breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis, voeg een gelijk volume isopropanol en 10% van het volume van 3 M natriumacetaat toe en incubeer bij RT gedurende 2 minuten. Centrifugeer het mengsel bij 12.000 x g gedurende 5 min.
    7. Verwijder het supernatant, was de pellet met 75% ethanol en centrifugeer vervolgens op 12.000 x g gedurende 5 minuten.
    8. Verwijder de 75% ethanol, droog het DNA aan de lucht bij RT gedurende 10 minuten en gebruik 120 μL TE-buffer om het DNA op te lossen.
    9. Voeg 60 μL buffer A (30% (g/v) PEG8000 en 30 mM MgCl2) toe aan 120 μL van de oplossing uit stap 3.2.8 en draai gedurende 20-24 uur bij 4 °C.
    10. Centrifugeer het mengsel op 18.000 g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
    11. Gebruik 180 μL voorgekoelde 75% ethanol om de pellet te wassen en herhaal stap 3.2.10.
    12. Droog de pellet op RT en gebruik 100 μL TE150-buffer om het DNA op te lossen.

4. Nanogefabriceerde zigzag barrières

  1. Reinig dia's in aceton gedurende 20 minuten door ultrasoonapparaat en breng ze over naar een nieuwe glazen container met 1 M NaOH voor ultrasoonapparaat gedurende nog eens 20 minuten. Meng 90 ml H2SO4 met 30 ml H2O2 en dompel de dia's gedurende 30 minuten onder in dit mengsel. Spoel de dia's af met aceton en isopropanol en droog de dia's met N2.
    OPMERKING: Het mengen van H2SO4 en H2O2 is een exotherm proces; neem adequate veiligheidsmaatregelen tijdens de operatie.
  2. Bedek de gereinigde dia achtereenvolgens met polymethylmethacrylaat (PMMA), PMMA 49,5 kDa en de bovenste laag geleidende beschermende coating. Gebruik elektronenbundellithografie om de zigzagbarrières te schrijven (figuur 1A).
  3. Was de dia's met ddH2O om de geleidende beschermende coating te verwijderen en droog de dia's met N2.
  4. Deponeer een laag chroom van 30 nm (Cr) met behulp van een magnetron sputtermachine en verwijder de resterende PMMA-lagen met aceton.
    OPMERKING: Eén flowcel kan worden hergebruikt voor meer dan 20 DNA Curtains-experimenten. Om de flowcell opnieuw te gebruiken, wast u deze met ethanol, wasmiddel en NaOH.

5. Zuivering van EWS-FLI1 eiwit

OPMERKING: De waarneming van 500 nM EWS-FLI1 op Lambda DNA met 25× GGAA motieven dient als een goed voorbeeld voor de toepassing van DNA Gordijnen op condensaatvorming. EWS-FLI1 is een fusie-eiwit dat de N-terminal van EWSR1 (1-265) en de C-terminal van FLI1 (220-453) combineert. Een mCherry-tag werd gefuseerd met de N-terminal van het EWS-FLI1-fusie-eiwit voor visualisatie.

  1. Kloon het EWS-FLI1-gen tot een gereconstitueerde pRSF-vector of een andere geschikte prokaryote expressievector.
  2. Transformeer de plasmidecodering 7x His-mCherry-EWSFLI1 in de E.coli BL21(DE3) stam; kweek een enkele kolonie in 5 ml LB-medium bij 37 °C 's nachts. Wanneer de OD600-waarde 0,6-0,8 bereikt na overdracht op 2 L LB-medium, voegt u 0,5 mM IPTG toe en schudt u de celcultuur bij 18 °C gedurende 16-18 uur.
  3. Centrifugeer de cultuur om het supernatant te verwijderen en resuspensieer de cellen met lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M ureum; 10 mM imidazool; 1,5 mM bèta-mercaptoethanol (β-ME); en 5% glycerol).
  4. Na ultrasoonapparaat en centrifugatie bij 18000 × g gedurende ~ 30 minuten, laadt u het supernatant op Ni-NTA-hars in evenwicht gebracht in een 5-voudig volume van lysisbuffer en wast u de hars vervolgens met een 10-voudig volume wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M ureum, 40 mM imidazool, 1,5 mM β-ME en 5% glycerol).
  5. Eluteer het gebonden eiwit met 15 ml elutiebuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M ureum, 500 mM imidazool, 1,5 mM β-ME en 5% glycerol) en concentreer de elutie tot ~500 μL.
  6. Laad de geconcentreerde eiwitoplossing op een gelfiltratiekolom en analyseer de producten door SDS-polyacrylamide-gel-elektroforese. Vries het gezuiverde eiwit snel in vloeibare stikstof in en bewaar het bij -80 °C.

6. Voorbereiding van een DNA Curtains flowcell

  1. Bereid een flowcell voor met zigzag nanogefabriceerde barrières voor een DNA Curtains-experiment en bepaal de stroomrichting. Om dit te doen, sluit u de in- en uitgangsbuizen in de juiste richting aan.
  2. Was de flowcell met 2,5 ml lipidenbuffer met twee spuiten van 3 ml. Zorg ervoor dat er geen bubbel in de flowcel zit.
  3. Verwijder de spuit uit de uitgang en injecteer 1 ml van de liposoomoplossing (40 μL liposoomvoorraad uit rubriek 2 en 960 μL lipidenbuffer) driemaal met 5 minuten incubatie na elke injectie.
  4. Voor de genezingsstap wast u de flowcel langzaam met 2,5 ml lipidenbuffer en incubeert u gedurende 30 minuten bij RT.
    OPMERKING: De genezingstijd kan indien nodig langer zijn; als er bubbels verschijnen, voert u dubbele genezing uit door stap 5.3 en 5.4 te herhalen om de bellen te verwijderen.
  5. Bereid 30 ml runderserumalbumine (BSA) buffer (40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol en 0,5 mg/ml BSA voor oppervlaktepassivering). Was na 30 minuten genezing de flowcel met 2,5 ml BSA-buffer vanaf de uitgangszijde.
    OPMERKING: De BSA-voorraad is een oplossing van 20 mg / ml die bij 4 °C is bewaard en binnen 1-2 weken moet worden gebruikt. De BSA-concentratie in de buffer kan worden aangepast aan de oppervlakteconditie.
  6. Injecteer 800 μL streptavidinbuffer (10 μL van een 1 mg/ml streptavidinvoorraad, 790 μL BSA-buffer) in de stroomcel vanaf de ingangszijde in twee stappen met 10 minuten incubatie na elke stap.
    OPMERKING: De streptavidin verankert het DNA op de lipiden vanwege de multivalentie door een brug te slaan tussen de gebiotinyleerde lipiden en het gebiotinyleerde DNA.
  7. Was de flowcell met 2,5 ml BSA-buffer om alle vrije streptavidinmoleculen te verwijderen.
  8. Verdun het Biotine-Lambda DNA met gekloonde motieven uit rubriek 3 met behulp van BSA-buffer (2,5 μL DNA en 998 μL BSA-buffer). Injecteer Lambda DNA 4 keer langzaam met intervallen van 5 minuten.
  9. Schakel de microscoop en het wetenschappelijke Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS)-systeem in tijdens de injectie. Was de slang met 10 ml ddH2O. Spoel het prisma en de slangconnector af met water, 2% vloeibare cuvettereiniger en 99% ethanol. Bereid de beeldvormingsbuffer voor door KCl en dubbelstrengs DNA-kleurstof toe te voegen aan de BSA-buffer om eindconcentraties van respectievelijk 150 mM en 0,5 nM te verkrijgen en ten minste 20 ml van de beeldvormingsbuffer op te nemen in een spuit van 30 ml.
  10. Stel de flowcell in op het microscoopstadium en sluit deze aan op het microfluïdische systeem.
  11. Gebruik een stroomsnelheid van 0,03 ml / min om de DNA-moleculen gedurende 10 minuten naar de barrière te spoelen, gedurende 30 minuten te incuberen met de stroom gestopt en schakel deze vervolgens uit om het DNA lateraal te laten diffunderen.
    OPMERKING: Het doel van deze incubatie van 30 minuten is om het DNA-molecuul gelijkmatiger voor de barrière te laten verdelen door eenvoudige diffusie, omdat DNA-moleculen de neiging hebben zich op te hopen aan de kant van de barrière die gesloten is voor de ingang waar ze worden ingespoeld. De incubatietijd kan indien nodig worden aangepast.

7. Beeldvorming van EWS-FLI1 condensatievorming op DNA-gordijnen

  1. Open de beeldbewerkingssoftware, zoek en markeer de posities van de 3 × 3 zigzagpatronen onder helderveld.
  2. Zet de stroom aan op 0,2 ml/min om het DNA gedurende 10 minuten te kleuren met de dubbelstrengs DNA-kleurstof.
  3. Verdun mCherry-EWS-FLI1 met de beeldbuffer tot de concentratie van 100 nM in 100 μL in de buis.
  4. Laad het eiwitmonster door de klep met een glazen spuit van 100 μL en verander het debiet in 0,4 ml/min.
  5. Schakel de 488 nm-laser in en scan elk gebied vooraf om de DNA-distributiestatus te controleren; selecteer het gebied waarin de DNA-moleculen gelijkmatig verdelen. Stel het laservermogen in op 10% voor de 488 nm laser en 20% voor de 561 nm laser. Gebruik de vermogensmeter om het werkelijke laservermogen in de buurt van het prisma te meten: 4,5 mW voor de 488 nm laser en 16,0 mW voor de 561 nm laser.
  6. Beeldacquisitie
    1. Begin met het verkrijgen van beelden met intervallen van 2 s met zowel 488 nm als 561 nm lasers tegelijkertijd.
    2. Verander de klep van de handmatige modus naar de injectiemodus om de beeldvormingsbuffer het eiwitmonster na 60 s in de flowcel te laten spoelen.
      OPMERKING: Dit proces duurt ~ 30 s en het gezichtsveld wordt bedekt met mCherry-signalen zodra de EWS-FLI1-eiwitten de stroomcel bereiken.
    3. Om de vrije EWS-FLI1 te verwijderen, moet u de flowcel met de beeldbuffer gedurende 5 minuten wassen met alleen de 561 nm-laser ingeschakeld. Stop de stroom en incubeer bij 37 °C gedurende 10 min.
    4. Schakel de stroom in op 0,4 ml / min om het DNA uit te breiden en verkrijg beelden met intervallen van 2 s tussen verschillende frames om gegevens met hoge doorvoer van EWS-FLI1-condensaatvorming te verkrijgen.

8. Intensiteitsanalyse voor mCherry-EWS-FLI1

  1. Importeer de gegevens als afbeeldingsreeksen in ImageJ-software, kies de puncta op 25× GGAA-sites in een vierkant van 8× 8 pixels en sla de afbeelding op in .tif indeling.
  2. Bereken de intensiteit als de som van de intensiteit in het vierkant van 8×8 pixels, inclusief de hele puncta, en verwijder de achtergrond door de intensiteit van de achtergrond af te trekken in een gebied van dezelfde grootte in de buurt van het vierkant van 8 x 8 pixels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het schema van DNA-gordijnen wordt weergegeven in figuur 1A, figuur 1B en figuur 1D. De gekloonde doelsequentie met 25 ononderbroken herhalingen van GGAA wordt gevonden in de NORB1-promotor in Ewing-sarcoom. Deze doelvolgorde is cruciaal voor EWS-FLI1 recruitment28. EWS-FLI1-moleculen werden gevisualiseerd door de mCherry-gelabelde EWS-FLI1-signalen te detecteren die werden verkregen met een 561 nm-l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Aangezien benaderingen met één molecuul uiterst gevoelig zijn voor de inhoud van het reactiesysteem, moet extra inspanning worden geleverd om een goede kwaliteit van alle materialen en oplossingen te garanderen tijdens de DNA Curtains-experimenten, met name de lipiden die zijn bereid in secties 1 en 2 en de buffers die in sectie 5 worden gebruikt. Reagentia met een hogere zuiverheidsgraad moeten worden gebruikt om buffers te bereiden en buffers moeten vers worden bereid voor de bepaling met één molecuul

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
488 nm diodepumped solid-state laserCoherentOBIS488LS
561 nm diodepumped solid-state laserCoherentOBIS561LS
AgarRhawnR003215-50g
biotinylated DOPEAvanti870273P
Bovine Serum AlbuminSigmaA7030
ChloroformAmresco1595C027
Coating Electra 92Allresist GmbHAR-PC 5090.02De conductieve beschermende coating
Deoxyribonuclease I bovienSigmaD5139-2MG
DOPCAvanti850375P
DTTSigmaD9779
Glass coverslipFisher Scientific12-544-7
Hellmanex IIISigmaZ805939-1EA
KClSigma60130
Lambda DNANEBN3013S
Lambda Packing ExtractsEpicentreMP5120
MgCl2SigmaM2670
NaClSigmas3014
NanoportIdexN-333-01
NheI-HFNEBR3131S
Nikon Inverted MicroscopeNikonEclipse Ti
NZCYM BrothSigmaN3643-250G
PEG-2000 DOPEAvanti880130P-1G
PEG-8000Amresco25322-68-3
PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%Allresist GmbHAR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2%Allresist GmbHAR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS cameraPHOTOMETRICSPrime95B
proteinase KNEBP8107S
Silica glass slideG.Finkenbeiner
Six-way injection valveIdexMXP9900-000
StreptavidinThermoS888Verdund met ddH2O
Syringe pumpHarvard ApparatusPump11 Elite
T4 DNA LigaseNEBM0202S
Tris baseSigmaT6066
XhoINEBR0146V
YOYO-1 Iodide (491/509)InvitrogenY3601Verdund met DMSO

Referenties

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

DNA-gordijnenfasescheidingfusie-oncoproteïnentranscriptiefactorcondensatenbiomoleculaire condensatenelektroforetische mobiliteitsverschuivingmicrofluïdische flowcelmCherry-labeling
Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.