Methodenartikel

Isolatie en cultuur van primaire menselijke gingivale epitheelcellen met behulp van Y-27632

5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62978

⸱

6 november 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een aangepaste methode voor de isolatie en kweek van menselijke gingivale epitheelcellen door de Rock-remmer, Y-27632, toe te voegen aan de traditionele methode. Deze methode is eenvoudiger, minder tijdrovend, verbetert de eigenschappen van stamcellen en produceert grotere aantallen epitheelcellen met een hoog potentieel, zowel voor het laboratorium als voor klinische toepassingen.

Samenvatting

Het gingivale weefsel is de eerste structuur die parodontale weefsels beschermt en een betekenisvolle rol speelt in veel orale functies. Het gingivale epitheel is een belangrijke structuur van gingivaal weefsel, vooral bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel. Het bestuderen van de functies van gingivale epitheelcellen heeft cruciale wetenschappelijke waarde, zoals het repareren van orale defecten en het detecteren van de compatibiliteit van biomaterialen. Omdat menselijke gingivale epitheelcellen sterk gedifferentieerde verhoornde cellen zijn, is hun levensduur kort en zijn ze moeilijk te passeren. Tot nu toe zijn er slechts twee manieren om gingivale epitheelcellen te isoleren en te kweken, een directe explantmethode en een enzymatische methode. De tijd die nodig is om epitheelcellen te verkrijgen met behulp van de directe explantmethode is echter langer en de celoverleving van de enzymatische methode is lager. Klinisch gezien is de verwerving van tandvleesweefsel beperkt, dus een stabiel, efficiënt en eenvoudig in vitro isolatie- en kweeksysteem is nodig. We verbeterden de traditionele enzymatische methode door Y-27632 toe te voegen, een Rho-geassocieerde kinase (ROCK) -remmer, die selectief de groei van epitheelcellen kan bevorderen. Onze aangepaste enzymatische methode vereenvoudigt de stappen van de traditionele enzymatische methode en verhoogt de efficiëntie van het kweken van epitheelcellen, wat aanzienlijke voordelen heeft ten opzichte van de directe explantmethode en de enzymatische methode.

Inleiding

De menselijke gingiva, de eerstelijns verdedigingsstructuur die parodontaal weefsel beschermt, is niet alleen een fysieke en chemische barrière1, maar scheidt ook verschillende klassen van ontstekingsmediatoren af die deelnemen aan immuunresponsen en een immuunbarrière vormen2,3. Het gingivale epitheel speelt een belangrijke rol bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel. Daarom is het bestuderen van de verdediging en immuniteit van het gingivale epitheel van groot belang voor het begrijpen van het optreden, de diagnose en de behandeling van parodontitis. De isolatie en kweek van gingivale epitheelcellen uit menselijk gingivaal weefsel is de eerste stap die nodig is voor het bestuderen van het gingivale epitheel. Een dergelijke procedure vereist basisoperaties zoals het produceren van zaadcellen voor weefselmanipulatie, in vitro modellen van parodontale geassocieerde ziekten en materialen voor het repareren van parodontale defecten.

Primaire gingivale epitheelcellen worden gekenmerkt door een lage delingsgraad in vitro4, onderzoekers zijn al tientallen jaren op zoek naar een optimale isolatie- en teeltmethode. Tot op heden worden twee verschillende technieken, een directe explantmethode en een enzymatische methode, vaak gebruikt in laboratoria om primaire gingivale epitheelcellen in vitrote verkrijgen4,5. De directe explantmethode heeft voordelen zoals de vereiste van een lagere hoeveelheid weefselmonsters en een eenvoudige isolatieprocedure, maar heeft de nadelen van een langere kweektijd en gevoeligheid voor besmetting5. Hoewel de enzymatische methode de benodigde kweektijd verkort, is de efficiëntie relatief laag en varieert afhankelijk van de gebruikte enzymen en het gebruikte medium. Kedjarune et al.6 toonden aan dat de directe explantmethode, die meer tijd nodig heeft voor subcultuur (2 weken), succesvoller bleek te zijn voor het kweken van gingivale epitheelcellen in vergelijking met de enzymatische methode. Bij het vergelijken van deze twee methoden vonden Klingbeil et al.7 echter dat de enzymatische methode de beste resultaten had voor primaire culturen van orale epitheelcellen en dat het mogelijk was om de optimale celopbrengst te verkrijgen binnen de kortste tijdsperiode (11,9 dagen versus 14,2 dagen).

Daarom was het belangrijk om een handigere en effectievere methode te ontwikkelen voor de isolatie en kweek van orale epitheelcellen4. We hebben eerder gemeld dat het toevoegen van Y-27632, een remmer van Rho-geassocieerd eiwitkinase (ROCK), de isolatieprocedure van menselijke primaire epidermale cellen en keratinocyten uit volwassen huidweefselsvereenvoudigt 8,9,10. We ontwikkelden G-medium, een nieuw geconditioneerd inentingsmedium dat spontaan epidermale van dermale cellen scheidt en de groei en opbrengst van primaire epidermale cellenondersteunt 8,9,10. In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe serumvrije isolatie- en kweektechniek voor gingivale epitheelcellen door G-medium te combineren met Y-27632. In essentie is onze methode gebaseerd op een vereenvoudiging van de traditionele tweestaps enzymatische methode, dus hebben we onze nieuwe methode vergeleken met de directe explantmethode. Deze gemodificeerde enzymatische methode verkort aanzienlijk de tijd die nodig is om gingivale epitheelcellen te scheiden van gingivaal weefsel en verhoogt de efficiëntie van het kweken van gingivale epitheelcellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke weefsels die in dit protocol worden gebruikt, zijn verse volwassen gingivale weefsels die worden weggegooid bij extracties van aangetaste tanden op de afdeling Maxillofaciale Chirurgie volgens de richtlijnen van de Ethische Commissie voor Menselijk Onderzoek van de instelling (Protocolnr. GR201711, Datum: 27-02-2017).

1. Voorbereidingen

  1. Verzamel verse volwassen gingivale weefsels in buisjes van 15 ml met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 3% penicilline / streptomycine (P / S) en houd de weefsels op 4 ° C.
    OPMERKING: Behandel de weefsels zoals hieronder beschreven binnen 24 uur na excisie.

2. Bereid reagentia en kweekmedium

  1. Bereid de wasoplossing voor: 3% P / S. Meng 50 ml PBS met 1,5 ml penicilline (100 E / ml) en 1, 5 ml streptomycine (100 mg / l).
  2. Bereid 500 ml groeifactorbevattend medium (G-medium genoemd): DMEM / F12 (3: 1) medium met 1% P / S, 2% B27 supplement, 20 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 40 ng / ml fibroblastgroeifactor 2 (FGF2) en 40 μg / ml fungizone.
  3. Bereid enzymverteringsoplossingen voor de nieuwe methode: Los 125 mg Dispase-poeder en 125 mg Type I collagenasepoeder op in 50 ml DMEM.
    OPMERKING: Filtreer alle enzymoplossingen door een zeef van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
  4. Bereid 500 ml van het medium om de enzymatische spijsvertering te neutraliseren: 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% P / S in het DMEM-medium.

3. Directe explantmethode

  1. Gingivale weefselvoorbehandeling
    1. Was gingivaal weefsel met 5 ml 75% ethanol gedurende 30 s. Spoel vervolgens tweemaal met 5 ml van de wasoplossing (stap 2.1) gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Voer alle wasbeurten uit in celkweekschalen met een diameter van 50 mm.
  2. Gingivale epitheelcelkweek
    1. Snijd het tandvleesweefsel in 1 mm3 stukken en strooi ze in een celkweekschaal van 100 mm. Gebruik fijne puntige tang en oogheelkundige schaar voor de snijbewerkingen.
    2. Voeg het G-medium (stap 2.2) toe aan de kweekschaal. Incubeer vervolgens de kweekschaal in een 5% CO2-incubator bij 37 °C. Gebruik een omgekeerde microscoop (40x) om de weefsels elke 24 uur te onderzoeken.
    3. Verwijder de gingivale weefselstukken wanneer de epitheelcellen zich hebben voortgeplant tot een diameter van 2-5 mm rond de weefselstukken. Vervang het G-medium elke 2-4 dagen.

4. De nieuwe gewijzigde enzymatische methode

  1. Gingivale weefselvoorbehandeling
    1. Volg hiervoor dezelfde stappen als beschreven voor de directe explantmethode, stap 3.1.1.
  2. Vertering van tandvleesweefsel
    1. Snijd het tandvleesweefsel in kleine stukjes, ongeveer <1 mm groot, met twee gesteriliseerde mesjes. Herhaal het proces van versnipperen met twee chirurgische messen.
    2. Voeg 1 ml dispase + collagenase-oplossing van 1,5 ml toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml die de stukjes gingivaalweefsel bevat en incubeer de buis vervolgens gedurende 15-20 minuten in een incubator bij 37 °C.
    3. Wanneer het weefsel transparant en vlokig wordt, voegt u 1 ml van de neutralisatieoplossing toe om de spijsvertering te beëindigen. Meng de oplossing grondig door 10-15 keer op en neer te pipetteren. Passeer de oplossing door een gaasfilter van 100 μm.
    4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
    5. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel aan de onderkant in 10 ml groeifactorbevattend medium (stap 2.2). Breng de celsuspensie over naar een celkweekschaal van 100 mm. Voeg 10 μM Y-27632 toe aan de celkweekschaal.
    6. Kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. Vervang de oude G-medium om de 2 dagen door het verse G-medium. Observeer de cellen op dag 1 en dag 3.

5. Cel passaging

  1. Haal de schaal uit de couveuse, verwijder het gebruikte medium en was twee keer met PBS. Voeg 2 ml 0,05% trypsine toe voor elke schaal van 100 mm.
    OPMERKING: Schud het gerecht om ervoor te zorgen dat er voldoende contact is tussen de Trypsin-oplossing en de bodem van het gerecht.
  2. Laat de schaal ongeveer 5 min bij 37 °C in een couveuse staan voor het verteringsproces.
  3. Gebruik een microscoop (40x) om de cellen te onderzoeken en zorg ervoor dat de meeste cellen zijn gescheiden van de bodem van de schaal.
  4. Voeg 2 ml van de neutralisatieoplossing toe om de spijsvertering te stoppen en breng de cellen over in een buis van 15 ml. Pipetteer 10-15 keer op en neer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g.
  5. Verwijder het supernatant langzaam. Resuspend de cellen met 10 ml G-medium en tel het aantal cellen.
  6. Voeg ongeveer 1 x 106 cellen in 10 ml G-medium en 10 μM Y-27632 toe aan elke schaal van 100 mm.
  7. Vernieuw de G-medium en Y-27632 elke 2 dagen. Bekijk de cellen op dag 1 en dag 5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont een schematisch diagram van de directe explantmethode en de gemodificeerde enzymatische methode. De directe explantmethode heeft tijdens het hele proces geen spijsverteringsenzym nodig. Daarentegen heeft de traditionele enzymatische methode meestal twee sets spijsverteringsenzymen nodig, dispase en collagenase, om de epitheelplaat van de onderliggende fibroblastlaag te scheiden en vervolgens trypsine om de epitheelcellen in suspensie vrij te maken. Onze nieuwe methode laat de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gingivale weefsel is een belangrijke structuur die parodontale integriteit en gezondheid handhaaft. Gingivale epitheelcellen spelen een belangrijke rol bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel en kunnen worden gebruikt in wetenschappelijk onderzoek en klinische toepassingen en aanverwante gebieden, waaronder orale biologie, farmacologie, toxicologie en mondslijmvliesdeficiënties18. Daarom is het noodzakelijk om een stabiele en efficiënte methode te ontwikkelen om orale epithee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Key Program van Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) en het Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2019GSF108107) aan X.W.; het Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2018GSF118240) aan J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project van de provincie Shandong (2018WS163) tot Z.X., en het Medical and Health Science and Technology Development Project van de provincie Shandong (2019WS045) tot J.S.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NamenAfkortingen & Opmerkingen
Countess geautomatiseerde celtellerShanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd.BBA0218ACAutomatisch celtelling
CO2 IncubatorThermo Scientific51026333Voor celincubatie
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific75004380Celcentrifuge
CelcultuurschaalEppendorf30702115Voor celcultuur
50 ml CentrifugeerbuisKIRGEN171003Voor celcentrifugering
1,5 ml microcentrifugebuisjesKIRGEN190691JVoor celvertering
CelzeefCorning incorporated431792Celfiltratie
Fosfaat gebufferde oplossingSolarbio Life ScienceP1020-500Wasoplossing
DMEMThermo ScientificC11995500Onderdeel van neutralisatiemedium
Gedefinieerd K-SFMLife Technologies10785-012Gingival epitheel  cellen kweekmedium
Penicilline StreptomycineThermo Scientific15140-122Antibiotica
Fetaal bovien serumBiological Industries04-001-1AC5Onderdeel van neutralisatiemedium
0,05% TrypsineLife Technologies25300-062Voor HGGEPCs dissociatie
VerdunningsmediumLife Technologies50-9701Voor coating matrix
DispaseGibco17105-041Voor HGGEPCs isolatie
Collageenase Type ILife Technologies17100-017Voor HGGEPCs isolatie
F12 voedingsmix, HamsLife Technologies31765035Onderdeel van G-medium
B27 SupplementLife Technologies17504044Groeifactor in G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Groeifactor in G-medium
Y-27632Gene OperationIAD1011ROCK inhibitor
FungizoneGibco15290026Preparaat voor G-medium
EGF Recombinant Human ProteinGibcoPHG0311Groeifactor in G-medium
Celtelling Kit-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04Voor celproliferatie assay
Konijn Anti-Menselijke CK18Abcamab82254Voor immunofluorescence kleuring om differentiatie marker van HGGEPCs te controleren
Konijn Anti-Menselijke Cytokeratine10Abcamab76318Voor immunofluorescence kleuring om differentiatie marker van HGGEPCs te controleren
Muis anti-menselijke VimentinCell Signaling Technology3390Voor immunofluorescence kleuring van Gingival fibroblasten
Konijn Anti-Menselijke pan-ckBD550951Voor immunofluorescence kleuring om differentiatie marker van HGGEPCs te controleren
konijn anti-Ki67Abcam15580Voor immunofluorescence kleuring om differentiatie marker van HGGEPCs te controleren
konijn anti-p63Biolegend619002Voor immunofluorescence kleuring om differentiatie marker van HGGEPCs te controleren
konijn anti-p75NGFRAbcamab52987Voor immunofluorescence kleuring om differentiatie marker van HGGEPCs te controleren

Referenties

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van primaire cellenenzymatische methodeROCK remmergingivaal weefselcelkweekweefselverteringcollagenase verteringorale regeneratie

Gerelateerde artikelen