Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van hersenorganoïden uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Om hersenorganoïden in grote hoeveelheden en van hoge kwaliteit te verkrijgen, gebruiken we zelfgemaakte mini-bioreactoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Brain Organoid Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen in zelfgemaakte mini-bioreactoren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De iPSC-afgeleide hersenorganoïde is een veelbelovende technologie voor het in vitro modelleren van de pathologieën van het zenuwstelsel en het screenen van geneesmiddelen. Deze technologie is onlangs ontstaan. Het staat nog in de kinderschoenen en heeft een aantal beperkingen die nog niet zijn opgelost. De huidige protocollen staan niet toe dat het verkrijgen van organoïden consistent genoeg is voor het ontdekken van geneesmiddelen en preklinische studies. De rijping van organoïden kan tot een jaar duren, waardoor de onderzoekers meerdere differentiatieprocessen tegelijkertijd moeten starten. Het brengt extra kosten met zich mee voor het laboratorium op het gebied van ruimte en apparatuur. Bovendien hebben hersenorganoïden vaak een necrotische zone in het centrum, die lijdt aan voedings- en zuurstoftekort. Vandaar dat de meeste huidige protocollen een circulerend systeem voor kweekmedium gebruiken om de voeding te verbeteren.
Ondertussen zijn er geen goedkope dynamische systemen of bioreactoren voor organoïde teelt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren van hersenorganoïden in compacte en goedkope zelfgemaakte mini-bioreactoren. Dit protocol maakt het mogelijk om organoïden van hoge kwaliteit in grote hoeveelheden te verkrijgen.
Inleiding
Menselijke iPSC-afgeleide modellen worden veel gebruikt in de studies van neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen1. In het afgelopen decennium hebben 3D-hersenweefselmodellen, zogenaamde hersenorganoïden, in wezen traditionele 2D-neuronale culturenaangevuld 2. De organoïden vatten tot op zekere hoogte de 3D-architectuur van het embryonale brein samen en maken nauwkeurigere modellering mogelijk. Veel protocollen zijn gepubliceerd voor het genereren van organoïden die verschillende hersengebieden vertegenwoordigen: hersenschors3,4,5,cerebellum6,middenhersenen, voorhersenen, hypothalamus7,8,9en hippocampus10. Er zijn meerdere voorbeelden van het gebruik van organoïden om ziekten van het menselijk zenuwstelsel tebestuderen 11. Ook werden de organoïden geïmplementeerd in medicijnontdekkingen12 en gebruikt in studies van infectieziekten, waaronder SARS-Cov-213,14.
De hersenorganoïden kunnen tot enkele millimeters in diameter reiken. De binnenste zone van de organoïde kan dus lijden aan hypoxie of ondervoeding en uiteindelijk necrotisch worden. Daarom omvatten veel protocollen speciale bioreactoren8,shakers of microfluïdische systemen15. Deze apparaten kunnen grote hoeveelheden dure celkweekmedia vereisen. Ook zijn de kosten van dergelijke apparatuur meestal hoog. Sommige bioreactoren bestaan uit veel mechanische onderdelen waardoor ze moeilijk te steriliseren zijn voor hergebruik.
De meeste protocollen lijden aan het "batch-effect"16, dat aanzienlijke variabiliteit genereert tussen organoïden verkregen uit de identieke iPSC's. Deze variabiliteit belemmert het testen van geneesmiddelen of preklinische studies die uniformiteit vereisen. De hoge opbrengst van organoïden genoeg om organoïden van uniforme grootte te selecteren, kan dit probleem gedeeltelijk oplossen.
De factor tijd is ook een groot probleem. Matsui et al. (2018) toonden aan dat hersenorganoïden minstens zes maanden nodig hebben om volwassen te worden17. Trujillo et al. (2019) toonden ook aan dat elektrofysiologische activiteit in organoïden pas na zes maanden teeltoptrad 18. Vanwege de lange organische rijpingstijd lanceren de onderzoekers vaak nieuwe differentiatie voordat ze de vorige voltooien. Meerdere parallelle differentiatieprocessen vereisen extra kosten, apparatuur en laboratoriumruimte.
We hebben onlangs een mini-bioreactor ontwikkeld die voornamelijk de hierboven genoemde problemen oplost19. Deze zelfgemaakte bioreactor bestaat uit een ultralage hechting of onbehandelde petrischaal met een plastic knop in het midden. Deze plastic knop voorkomt verdringing van organoïden en hun conglutinatie in het midden van de petrischaal, die wordt veroorzaakt door de rotatie van de shaker. Dit artikel beschrijft hoe deze goedkope en eenvoudige zelfgemaakte mini-bioreactor het mogelijk maakt om in grote hoeveelheden hoogwaardige hersenorganoïden te genereren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Gebruik steriele techniek in het hele protocol, met uitzondering van stap 1.2 en 1.3. Verwarm alle kweekmedia en -oplossingen tot 37 °C voordat u ze op cellen of organoïden aanbrengt. Kweek cellen in een CO2-incubator bij 37 °C in 5% CO2 bij 80% luchtvochtigheid. Het protocolschema is weergegeven in figuur 1.
1. Petrischaaltjes omtvormen tot mini-bioreactoren
- Schroef steriele centrifugebuizen van 15 ml in ringen van 7-8 mm hoog; autoclaaf de ringen.
- Breek laaglijvende, onbehandelde of microbiologische petrischalen in kruimels. Los ongeveer 1 g plastic kruimels 's nachts op in 10 ml chloroform om vloeibaar plastic te bereiden.
LET OP: Werk in een zuurkast. - Controleer of het resulterende vloeibare plastic stroperig genoeg is om te pipetteren; de druppel behoudt een bolvorm en verspreidt zich niet over het oppervlak. Als het erg vloeibaar is, voeg dan meer plastic kruimels toe. Als het dik is, voeg dan chloroform toe.
- Maak een plastic knop in het midden van een steriele ultra-lage hechting 6-cm petrischaal. Er zijn twee even geschikte manieren, zoals hieronder beschreven.
- Plaats de geautoclaveerde plastic ring in het midden en laat het vloeibare plastic naar de binnenkant van de ring vallen.
- Zonder plastic ring, laat het vloeibare plastic op het midden van de petrischaal vallen.
- Laat de gerechten 2-3 uur open in een laminaire stroomkap tot ze klaar zijn. Behandel de gedroogde gerechten met ultraviolette straling gedurende 15-20 minuten.
2. Inductie van neuronale differentiatie van iPSC's
- Kweek iPSC's in het medium voor pluripotente stamcellen tot 75-90% confluentie in 35 mm petrischalen voorgecoat met een matrix bestaande uit extracellulaire eiwitten.
- Bereid medium A-SR voor. Zie tabel 1 voor nadere bijzonderheden.
- Aspirateer het teeltmedium en voeg 2 ml A-SR medium toe op dag 0 van differentiatie.
- Medium A bereiden (zie tabel 2).
- Kweek cellen in medium A gedurende twee weken vanaf dag 2-14, verfrissend medium in petrischalen om de andere dag.
3. De vorming van sferoïden uit neuro-epitheliale voorlopercellen op dag 14
- Maak op dag 14 sferoïden uit neuro-epitheliale voorlopercellen met behulp van een speciale 24-well kweekplaat met ongeveer 1.200 microwells in elke put(figuur 2C). Volg de onderstaande procedure.
OPMERKING: In deze differentiatiefase bevat een petrischaaltje van 35 mm meestal 3 - 3,5 x 106 neuro-epitheliale voorlopercellen. Zo is één petrischaaltje van 35 mm met neuro-epitheliale voorlopercellen voldoende voor 3 - 4 putten van 24-putjes kweekplaat met microwells. - Bereid een kweekplaat met 24 putten met microwells voor: voeg aan elke put 1 ml medium A toe. Centrifugeer kort bij 1.300 x g gedurende 5 minuten in zwenkbakrotor uitgerust met plaathouder. Controleer onder de microscoop dat er geen bubbels in microwells zijn.
- Bereid het medium B voor (tabel 3).
- Verwijder het medium uit de petrischaal met neuro-epitheliale voorlopercellen; was de cellen met 2 ml DMEM/F12. Behandel voor de celdetachement de cellen met 1,5 ml 0,48 mM EDTA-oplossing bereid in PBS. Controleer de celdetachement onder de microscoop.
- Oogst de cellen in een buis van 15 ml. Voeg 5 ml DMEM/F12 toe in de buis om de cellen te wassen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Verwijder de supernatant- en resuspendcellen in 2 ml medium B.
- Controleer de celconcentratie en levensvatbaarheid door Trypan Blue kleuring en een hemocytometer. Bereken het suspensievolume dat nodig is om in totaal 1 x10 6 levensvatbare cellen te bevatten.
- Breng de celsuspensie met 1 x10 6 cellen over in elke put van een 24-well plaat met microwells. Voeg medium B tot 2 ml toe aan elke put, pipetteer cellen voorzichtig meerdere keren op en neer en centrifugeer kort 100 x g gedurende 1 minuut om cellen in de microwells op te vangen.
OPMERKING: Het aantal cellen per put mag niet groter zijn dan 1 x 106. Anders fuseren sferoïden van naburige microwells. - Controleer onder de microscoop of cellen gelijkmatig verdeeld zijn in microwells. Herhaal pipetteren en centrifugeren als de cellen ongelijk verdeeld zijn.
- Incubeer de plaat een nacht om cellen te laten aggregeren in sferoïden.
4. Verkrijging en teelt van organoïden
- Controleer de volgende ochtend (dag 15) de kwaliteit van sferoïden onder de microscoop. Zorg ervoor dat ze transparant en glad zijn, indien gezond(Figuur 2A,B). Verzamel voorzichtig de sferoïden uit elke put in een buis van 15 ml, laat de sferoïden gedurende 2-3 minuten neerslaan door de zwaartekracht en verwijder vervolgens het supernatant.
- Voeg aan de sferoïden 2 ml van de matrix toe die in dezelfde tijd op ijs is ontdooid. Meng voorzichtig door te pipetteren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Om het overschot van de matrix te wassen, voegt u 8 ml medium B. Pipetteer voorzichtig aan de buis en centrifugeer de buis gedurende 1 minuut bij 100 x g.
OPMERKING: Overschrijd de tijd en de snelheid van centrifugeren niet om de onomkeerbare aggregatie van sferoïden te voorkomen. - Verwijder het supernatant. Voeg aan de buis 2 ml medium B toe, pipetteer voorzichtig. Verdeel de sferoïde suspensie over twee mini-bioreactoren, elk met 4 ml medium B. Plaats de mini-bioreactoren in een petrischaaltje van 15 cm om verdamping van water te voorkomen en besmetting te voorkomen.
- Zet de petrischaal met mini bioreactoren op een orbitale shaker. Cultiveer de organoïden met een rotatiesnelheid van 70-75 tpm.
- Bereid op dag 16 medium C voor(tabel 4).
- Breng de organoïden over in een buis van 15 ml. Laat ze gedurende 5 minuten naar de bodem vallen, adem het supernatant op, voeg 5 ml medium C toe. Breng de organoïden terug in de mini-bioreactoren.
OPMERKING: Pas op dat u de sferoïden, die transparant en nauwelijks zichtbaar zijn, niet verliest. - Kweek sferoïden in medium C gedurende twee weken en ververs het medium om de twee dagen. Laat aan het einde van deze twee weken ongeveer 100 sferoïden per mini-bioreactor over voor de volgende teelt. Vries overmatige sferoïden in een vriesmedium in vloeibare stikstof.
- Bereid op dag 30 medium D voor(tabel 5).
- Verander het teeltmedium in medium D, wat een rijpingsmedium is. Ververs het teeltmedium elke 2-3 dagen gedurende drie weken en gebruik vervolgens medium D zonder BDNF en GDNF.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocolschema is weergegeven in figuur 1. Het protocol omvatte vijf media waarin iPSC's gedurende ten minste één maand differentieerden in hersenorganoïden. De differentiatie werd gestart toen iPSC's de 75-90% confluentie bereikten(figuur 2A,B). De eerste tekenen van differentiatie naar neuronen werden waargenomen op dag 10-11 van iPSC-cultivatie in medium A toen cellen begonnen te clusteren in "rozetten" (Figuur 2C
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het beschreven protocol heeft twee cruciale stappen die het genereren van hoogwaardige organoïden van uniforme grootte mogelijk maken. Ten eerste groeien de organoïden uit sferoïden die bijna identiek zijn in celnummer en celvolwassenheid. Ten tweede bieden de zelfgemaakte bioreactoren elke organoïde een uniforme omgeving, waar organoïden zich niet verdringen of aan elkaar plakken.
De celkwaliteit en de toestand van celrijping zijn essentieel om het protocol uit te voeren. Het is van cruciaal ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidie 075-15-2019-1669 van het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie (RT-PCR-analyse) en door subsidie nr. 19-15-00425 van de Russian Science Foundation (voor al het andere werk). De auteurs bedanken ook Pavel Belikov voor zijn hulp bij de videobewerking. Figuren in het manuscript zijn gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well kweekplaat met microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronaal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serumvervanger |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripottent stamcelmedium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basaal medium voor neuronaal celonderhoud |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobiële middelen |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0,48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
Referenties
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820(2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790(2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
