Interferometrische reflectiebeeldvorming met één deeltje Karakterisering van individuele extracellulaire blaasjes en populatiedynamiek

Summary

Dit protocol presenteert interferometrische reflectiebeeldvorming met één deeltje die is ontworpen voor uitgebreide metingen op meerdere niveaus van de grootte van extracellulaire blaasjes (EV), het aantal EV's, het EV-fenotype en de colokalisatie van EV-biomarkers.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn blaasjes ter grootte van een nanometer met een lipidedubbellaag die door de meeste cellen worden uitgescheiden. EV's dragen een groot aantal verschillende biologische moleculen, waaronder eiwitten, lipiden, DNA en RNA, en worden gepostuleerd om cel-tot-cel communicatie in diverse weefsels en organen te vergemakkelijken. Onlangs hebben EV's veel aandacht getrokken als biomarkers voor diagnostiek en therapeutische middelen voor verschillende ziekten. Er zijn veel methoden ontwikkeld voor de karakterisering van EV's. De huidige methoden voor EV-analyse hebben echter allemaal verschillende beperkingen. Het ontwikkelen van efficiënte en effectieve methoden voor EV-isolatie en -karakterisering blijft dus een van de cruciale stappen voor dit geavanceerde onderzoeksveld naarmate het volwassener wordt. Hier bieden we een gedetailleerd protocol waarin een interferometrische reflectiebeeldsensor met één deeltje (SP-IRIS) wordt geschetst, als een methode die in staat is om EV's van ongezuiverde biologische bronnen en gezuiverde EV's te detecteren en te karakteriseren door middel van andere methodologieën. Deze geavanceerde techniek kan worden gebruikt voor uitgebreide metingen op meerdere niveaus voor de analyse van EV-grootte, EV-telling, EV-fenotype en biomarkercolokalisatie.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraanblaasjes van cellulaire oorsprong ter grootte van een nanometer die kunnen worden geïsoleerd uit tal van biologische vloeistoffen, waaronder bloed, moedermelk, speeksel, urine, gal, pancreassap en hersen- en peritoneale vloeistoffen. Afleiding van EV's vindt plaats via drie hoofdmechanismen: apoptose, afgifte via fusie van multivesiculaire lichamen met het plasmamembraan en blebbing van het plasmamembraan¹. Bewijs voor EV-overdracht van donorcelcomponenten naar naburige of verre cellen en weefsels suggereert dat deze met membraan omsloten pakketten een belangrijke rol kunnen spelen bij zowel paracriene als langeafstands- of endocriene signaleringscascades ^1,2,3. Omdat EV's een momentopname kunnen geven van het fenotype van een cel, is het potentieel voor hun gebruik als diagnostische en therapeutische hulpmiddelen voor de behandeling van verschillende ziekten een actief onderzoeksgebied geworden 4,5,6,7,8.

Er zijn veel methoden ontwikkeld die gericht zijn op EV-karakterisering 9,10,11,12,13. De meeste van deze methoden bieden unieke en waardevolle informatie over populaties van EV's, voornamelijk in bulk. Hoewel een subset van deze technieken details kan verschaffen over stoffen in of op afzonderlijke EV's, kunnen er beperkingen zijn aan het karakteriseren van EV's op het niveau van enkele EV's. Immuno-elektronenmicroscopie kan bijvoorbeeld worden gebruikt om afzonderlijke EV's en hun samenstelling te begrijpen, maar deze techniek heeft een lage doorvoer, is ernstig beperkt in zijn vermogen om te worden gebruikt voor het beschrijven van populatiedynamiek, en vereist een aanzienlijke ontwikkeling van methoden¹⁴.

Onlangs heeft de ontwikkeling en commercialisering van de single-particle interferometric reflectance imaging sensor (SP-IRIS)-techniek, via het ExoView-platform, individuele EV-karakterisering mogelijk gemaakt met behulp van een routinematige en eenvoudige geautomatiseerde gegevensverzamelingsmethode. De kern van deze technologie is de chip, een Si/SiO₂ dubbele laag van 1 cm x 1 cm, die de interferometrische meting van afzonderlijke biologische nanodeeltjes mogelijk maakt. De chip is bezaaid met een microarray van individuele gefunctionaliseerde antilichaamvlekken, waardoor multiplexed detectie van maximaal zes verschillende opnametypen mogelijk is. Standaardchips bevatten de gebruikelijke tetraspanine-markers (CD81, CD63 en CD9) voor opname tijdens de incubatiestap, en de gebruiker kan extra aangepaste opnameplekken toevoegen om verschillende populaties EV's te isoleren die gescheiden zijn van de tetraspanins. Na de incubatiestap heeft elke veroveringsplek veel EV's aan zich gebonden die de bijbehorende markering uitdrukken. Deze gevangen EV's kunnen vervolgens eenvoudig worden gewassen, gedroogd en gescand in de lezer om de grootte van de blaasjes die aan de opnameplek zijn gebonden tussen 50-200 nm te kwantificeren om een nummergewogen grootteverdeling te geven via SP-IRIS¹⁵. Het systeem biedt ook drie fluorescerende detectiekanalen voor immunolabeling van de gevangen EV's, en biedt zowel de gemiddelde fluorescerende intensiteit, die niet wordt beperkt door de grootte zoals SP-IRIS-metingen, als colokalisatieaspecten voor elke fluorescerende kleuring. Dit stelt de gebruiker in staat om populaties van afzonderlijke EV's te definiëren op basis van de weergave van vier verschillende biomarkers per EV (opname plus drie immunofluorescerende labels). Het systeem kan verder gaan dan het meten van oppervlakte-eiwitten met immunofluorescentie, aangezien een optioneel vrachtprotocol de gebruiker in staat stelt om te onderzoeken naar inwendige eiwitten van de gevangen EV's en luminale epitopen van membraanoverspannende oppervlaktemarkeringen, en de gebruiker in staat stelt om de integriteit van het EV-membraan te controleren. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol waarin de stappen worden beschreven die nodig zijn om consistente gegevens te verkrijgen over de grootte en het aantal EV's, met maximaal vier verschillende biomarkers op één EV-niveau op grote populaties EV's. Deze techniek kan worden gebruikt op zowel onbewerkte biologische vloeistoffen als EV's die zijn geïsoleerd met behulp van een willekeurig aantal technieken, zoals ultracentrifugatie, ultrafiltratie, precipitatiemiddelen, immunoaffiniteitsopname, microfluïdica en chromatografie met uitsluiting van grootte.

Het hieronder beschreven protocol maakt gebruik van extracellulaire blaasjes (EV) die zijn afgeleid van HEK 293-celkweekmedia en van het muizenserum met behulp van een gevestigde isolatiemethode¹⁶. Het protocol is toegepast op tal van andere biologische vloeistoffen, celkweekmedia en gezuiverde extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit biologische vloeistoffen. Dit protocol is opgedeeld in een tweedaagse procedure met de workflow voor een typisch experiment weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1: Analyseworkflow. Testworkflow voor het kiezen van het type analyse dat voor het monster moet worden voltooid tussen grootte en telling, aantal maten en oppervlaktekleuring, en aantal maten en vrachtkleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Serummonsters werden verzameld van muizen volgens een goedgekeurd Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) in het protocol van het University of Kansas Medical Center (KUMC). Het gebruik van deze biologische monsters in deze experimenten werd ook goedgekeurd door KUMC.

1. Voorbereiding van het monster (dag 1)

1. Bepaal de EV-concentratie met behulp van nanodeeltjestracking of een gelijkwaardige techniek.
2. Verdun het monster met de incubatieoplossing tot een concentratie van 5 x 10^7-5 x 10⁸ EVs/ml; er is minimaal 50 μL nodig.
   OPMERKING: Voor monsters waarin de EV-concentratie onbekend is, kan een totaal eiwit van 1 μg/ml als vervangende maat worden gebruikt. Als het monster naar verwachting een lage concentratie zal hebben, voer dan ten minste een verdunning van 1:1 uit in de incubatieoplossing voordat u het laadt.
3. Plaats een plaat met 24 putjes op een vlakke ondergrond, vrij van trillingen en bruuske bewegingen.
   OPMERKING: Om het contrast te vergroten, kan een wit vel papier onder de plaat worden gelegd.
4. Voeg water toe aan de gebieden rond de putten (Figuur 2).

Figuur 2: Plaatlay-out met 24 putjes. De locaties waar ddH₂O moet worden gebruikt (blauwe kleurstof is alleen voor visualisatiedoeleinden toegevoegd) en de putjes waarin de chips zullen worden bewaard, worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Chips voorbereiden en voorscannen

1. Haal de verzegelde plaat met 48 putjes met frites uit de koelkast van 4-8 °C en laat ze op kamertemperatuur komen (~15 min) voordat u de verzegeling opent.
   OPMERKING: Dit is essentieel om condensatie op de spanen te voorkomen, die de vlekken kunnen beschadigen. Als er condensatie op het oppervlak wordt waargenomen bij het verwijderen van de chip uit de verpakking, wacht dan langer voordat u andere chips verwijdert.
2. Ga verder met stap 8 om de boorkop op te halen ter voorbereiding op de pre-scanrun (Afbeelding 3).
   OPMERKING: De pre-scangegevens worden gebruikt om alle deeltjes te identificeren die detecteerbaar zijn op de opnameplekken voorafgaand aan de incubatie met het monster, zodat ze tijdens de analysestap kunnen worden verwijderd.

Afbeelding 3: Afbeelding van de klauwplaat die wordt gebruikt om de chip in de machine te laden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Verwijder met een pincet het gewenste aantal spanen (één spaander per monster) van de plaat met 48 putjes en laad de spanen rechtstreeks in de klauwplaat voor de prescan. Wanneer alle chips die bedoeld zijn om voor het experiment te worden gebruikt, zijn geladen en vooraf gescand zoals beschreven in stap 8, gaat u verder met stap 2.4.
   OPMERKING: Zorg er bij het hanteren van spanen voor dat u de vierkanten in het midden niet aanraakt, aangezien de antilichaamopvangplekken zich in dit gebied bevinden en zullen worden beschadigd als ze door het pincet worden aangeraakt (Afbeelding 4).

Figuur 4: Behandeling van de chip en de juiste behandeling van de chip. (A) Gele stippellijn geeft de locatie van de gevlekte antilichamen of de functionele kant van de chip aan. Chip-ID bevindt zich onder de lijn ("58"). Figuur toont ook de juiste bediening. (B) Toont ongepaste behandeling van de chip aan. (C) Niet-functionele kant van de chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Plaats elke vooraf gescande chip met het gefunctionaliseerde oppervlak naar boven in de vooraf voorbereide plaat met 24 putjes. Het gefunctionaliseerde oppervlak is gemakkelijk te herkennen aan de duidelijke nummering, uitlijningsrasters en de drie zwarte vakken in het midden. De niet-gefunctionaliseerde kant is een plat zilverkleurig uniform oppervlak.
5. Gebruik een pincet met fijne punt om ervoor te zorgen dat elke chip gecentreerd is in de put (Figuur 5).
   OPMERKING: Het centreren van de chip in de put is van cruciaal belang, want als de chip de wand van de put raakt, kan het monster na het laden worden afgevoerd.

Figuur 5: Demonstratie van de juiste plaatsing van de spanen in de put. (A) De spanen moeten in het midden van de put worden geplaatst, zonder dat de hoeken de zijkanten van de put raken. (B) Afbeelding van onjuiste plaatsing van de chip, waarbij de hoeken de zijkanten van de put raken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Laden en incuberen van de chip en het monster

1. Pipetteer 35 μL van het voorbereide monster (uit stap 1) op de chip.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat u geen luchtbellen toevoegt of de chip aanraakt met de pipetpunt, omdat dit de gelijkmatige verdeling van het monster op de chip kan verhinderen of de antilichaamvlekken op de chip kan beschadigen. Het monster moet zich over het gehele spaanoppervlak verspreiden. Indien het monster tijdens het laden van de spaan wordt afgevoerd, wordt een extra monster aan de put toegevoegd tot een volume van 250 μl of wordt een incubatieoplossing tot 250 μl toegevoegd en wordt de gewijzigde verdunningsfactor voor dat monster genoteerd.
2. Sluit de plaat af met behulp van de meegeleverde plaatfilm om verdamping van het monster te voorkomen.
3. Incubeer het monster/de chip een nacht (~16 uur) in de afgesloten plaat bij kamertemperatuur in een ruimte die vrij is van trillingen of beweging.
   OPMERKING: Na de nachtelijke incubatie kiest de gebruiker de juiste optie voor dag 2 voor zijn onderzoeksvraag. Als alleen de grootte en het aantal EV's gewenst zijn, gaat u verder met stap 4 (dag 2). Als analyse van meerdere oppervlaktemarkeringen gewenst is, gaat u verder met stap 5 (dag 2).

4. Bepalen van de grootte en het aantal EV's (dag 2)

1. Voeg 1 ml oplossing A toe aan de zijkant van elk putje dat een chip bevat, zorg ervoor dat u de oplossing niet rechtstreeks op de chip toevoegt of de chip bekrast met de pipetpunt.
2. Plaats de plaat op een orbitale schudder die gedurende 500 minuten op ~3 tpm bij kamertemperatuur draait.
   OPMERKING: Als de spanen op de plaat rammelen, verlaag dan onmiddellijk de snelheid zodat de vloeistof ronddwarrelt maar er geen geratel is.
3. Verwijder 750 μL vloeistof. Vermijd het kantelen van de plaat tijdens het verwijderen van vloeistof om te voorkomen dat de spaan per ongeluk uitdroogt.
4. Voeg 750 μL oplossing B toe met behulp van de techniek beschreven in stap 4.1 en schud bij ~500 rpm gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
5. Herhaal stap 4.3-4.4 nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten met Oplossing B.
6. Verwijder aan het einde van de laatste wasbeurt 750 μL van de oplossing en laat 250 μL Solution B in het putje over.
7. Voeg 750 μL dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) toe en schud op ~500 rpm gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
8. Vul een petrischaaltje van 10 cm met 50 ml ddH₂O en breng met een pincet één chip per keer van het putje in het schaaltje.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de chip horizontaal overbrengt en zorg ervoor dat deze niet droogt. Er kunnen maximaal acht spanen worden gewassen voordat de ddH₂O wordt vervangen.
9. Houd in de ddH₂O de chip met een pincet aan de randen vast en draai deze drie omwentelingen in de schaal om het vuil te verwijderen.
10. Verwijder de chip in een hoek van 45° uit het water en plaats de chip op absorberend papier met de chip-ID naar boven (Figuur 6).
    OPMERKING: Chips zijn nu klaar om gelezen te worden. Ga naar stap 8 voor het scannen op de SP-IRIS-lezer.

Afbeelding 6: Correcte manier om de spaan onder een hoek van 45° uit het ddH₂O water te verwijderen. (A) Uitzicht vanaf de bovenkant en (B) Zicht vanaf de zijkant die de hoek aangeeft waaronder de spaan moet worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Bereiding van antilichaamoplossing (dag 2)

1. Voeg 300 μL blokkeeroplossing per chip toe aan een buis van de juiste grootte (0,5 tot 3 ml).
2. Voeg 0,6 μL antilichaam toe per 300 μL van de blokkerende oplossing. Meng voorzichtig door op de tube te tikken en snel te draaien.
   OPMERKING: Antilichamen voor humaan CD9, CD81 en CD63 of muizen CD9, CD81 en CD63 zijn opgenomen in de juiste kits. Als andere fluorescerend geconjugeerde antilichamen gewenst zijn, bepaal dan de optimale kleuringsconcentratie met behulp van een typische titratie over een bereik van 0,1 tot 10 μg/ml met een constante monsterbelasting zoals u zou doen voor flowcytometrie.

6. Bepaling van de grootte, het aantal en fenotypering van EV's met immunofluorescerende kleuring

1. Voeg 1 ml oplossing A toe aan de zijkant van elk putje dat een chip bevat, en zorg ervoor dat u de oplossing niet rechtstreeks op de chip toevoegt of de chip bekrast met de pipetpunt.
2. Plaats de plaat op een orbitale schudder die gedurende 500 minuten op ~3 tpm bij kamertemperatuur draait.
   OPMERKING: Als de spanen op de plaat rammelen, verlaag dan onmiddellijk de snelheid zodat de vloeistof ronddwarrelt maar er geen geratel is.
3. Verwijder 750 μL van de vloeistof. Vermijd het kantelen van de plaat tijdens het verwijderen van vloeistof om te voorkomen dat de spaan per ongeluk uitdroogt.
4. Voeg 750 μL oplossing A toe met behulp van de techniek beschreven in stap 6.1 en schud bij ~500 tpm gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
5. Herhaal stap 6.3 en 6.4 twee keer voor een totaal van drie wasbeurten met Oplossing A.
6. Verwijder aan het einde van de laatste wasbeurt 750 μL van de oplossing en laat 250 μL Solution A in het putje over.
   OPMERKING: Als de gebruiker Cargo Stains wenst, gaat u op dit punt verder met stap 7. Zo niet, ga dan verder met stap 6.7
7. Voeg 250 μL van de antilichaamoplossing (stap 5) toe aan elke chip in het putje. Dek de plaat af met folie ter bescherming tegen licht en schud gedurende 1 uur op de orbitale schudder bij kamertemperatuur.
8. Voeg 500 μL oplossing A toe, zodat het totale volume per putje ~1.000 μL is.
9. Verwijder onmiddellijk 750 μL en voeg 750 μL oplossing A toe en schud met ~500 tpm op de orbitale shaker gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
10. Verwijder 750 μL van de oplossing en voeg 750 μL Solution B toe en schud op ~500 rpm gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
11. Herhaal stap 6.10 nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
12. Voeg 750 μL dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) toe en schud op ~500 rpm gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
13. Vul een petrischaaltje van 10 cm met 50 ml ddH₂O en breng met een pincet een chip uit het putje in de schaal.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de chip horizontaal overbrengt en zorg ervoor dat deze niet droogt. Er kunnen maximaal acht spanen worden gewassen voordat ze worden vervangen door verse ddH₂O.
14. Houd in de ddH₂O de chip met een pincet aan de randen vast en draai deze drie omwentelingen in de schaal om vuil te verwijderen.
15. Verwijder de chip in een hoek van 45° uit het water en plaats de chip op absorberend papier met de chip-ID naar boven (Afbeelding 6).
    OPMERKING: Chips zijn nu klaar om gelezen te worden. Ga naar stap 8 (Gegevensverzameling) voor instructies over het instellen van de chips voor scannen op de lezer.

7. Optionele bekleuring van de lading

OPMERKING: Dit protocol maakt het mogelijk om interne en oppervlaktemarkeringen gelijktijdig te labelen.

1. Met 250 μL oplossing A die in elk putje achterblijft, voegt u 250 μL Oplossing C toe aan elk putje.
2. Plaats onmiddellijk op de orbitale schudder en stel in op ~200 tpm gedurende precies 10 minuten.
   OPMERKING: In deze stap en stap 7.8 hieronder zijn zowel de timing als de lagere schudsnelheid van cruciaal belang; Zorg ervoor dat de snelheid slechts langzaam wervelt in de putten en gebruik een timer.
3. Voeg na 10 minuten incubatie met oplossing C 500 μl oplossing A toe aan elk putje.
4. Verwijder onmiddellijk 750 μL en voeg 750 μL Oplossing A toe en schud met ~500 tpm op de orbitale shaker gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
5. Herhaal stap 7.4 nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
6. Verwijder aan het einde van de laatste wasbeurt 750 μL van de oplossing en laat ~250 μL van de oplossing in het putje met de chip over.
7. Voeg 250 μL Oplossing D toe aan elk putje.
8. Plaats deze onmiddellijk op de orbitale schudder die is ingesteld op ~200 tpm gedurende precies 10 minuten.
9. Voeg na 10 minuten incubatie met oplossing C 500 μl oplossing A toe aan elk putje.
10. Verwijder onmiddellijk 750 μL en voeg 750 μL oplossing A toe en schud met ~500 tpm op de orbitale shaker gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
11. Herhaal stap 7.10 twee keer voor in totaal drie wasbeurten.
12. Verwijder 750 μl van de oplossing na de laatste wasbeurt en keer terug naar stap 6.7 hierboven voor het kleuren en voltooien van het testprotocol.

8. Gegevensverzameling

OPMERKING: De procedure voor het verzamelen van gegevens van de chips met behulp van de ExoView R100 is geautomatiseerd en vereist geen invoer door de gebruiker. Gedetailleerde instructies zijn te vinden in de gebruikershandleiding en de bijbehorende video voor het laden van de chipdrager, of "chuck", en data-acquisitie¹⁷.

1. Schakel het EV-karakteriseringsplatform in met behulp van de twee aan/uit-schakelaars aan de achterkant van het instrument en start vervolgens de scannersoftware door te dubbelklikken op het bureaubladpictogram.
   OPMERKING: Wanneer de scannersoftware start, wordt de lezer automatisch ingesteld op het startscherm en wordt de gebruiker vervolgens gevraagd om "Open de deur om chips te laden".
2. Open de deur aan de voorkant van de lezer door de zilveren hendel op te tillen. Hierdoor wordt de fase uitgeworpen, waardoor de gebruiker toegang krijgt tot de klauwplaat en een nieuwe scan in de software kan instellen.
3. Identificeer de locatie waar de gebruiker de gegevens wil opslaan door op de map Opslaan te klikken en een gewenste locatie te selecteren voor de gegevens die moeten worden opgeslagen.
   OPMERKING: Het is vaak handig om de opslaglocatie een inzichtelijke naam te geven, zoals de naam van het experiment, en vervolgens twee submappen te maken, één voor pre-scans en één voor post-scans. Dit maakt het vinden en matchen van de gegevens tijdens de analyse eenvoudiger.
4. Als u de chips wilt scannen, zoekt u de chipfiles op de besturingscomputer.
   OPMERKING: Chipfiles zijn kaarten van de lay-out van de antilichaamvlek op de gebruikte chip en stellen de scanner in staat om te weten waar hij op elke chip moet scannen. In elke kit zit een USB-sleutel met daarin de chipfiles voor de chips. Deze moeten bij ontvangst van de kit op een locatie op de besturingscomputer worden opgeslagen, waar gebruikers ze betrouwbaar kunnen vinden.
5. Laad de spanen op de klauwplaat met het nummer op de spanen naar de hendel op de klauwplaat gericht, en selecteer vervolgens in het vervolgkeuzemenu Chip op de computer elke chip uit de lijst met chipbestanden en plaats deze op de juiste overeenkomende locatie in de virtuele klauwplaat in de scannersoftware. Als dit is voltooid, verschijnt er een prompt op het scherm waarin de gebruiker wordt gevraagd de boorkop op het werkgebied te plaatsen.
6. Plaats de geladen boorkop op het podium; de magnetische uitlijning op de boorkop verplaatst deze automatisch naar de juiste locatie op het podium en klik vervolgens op OK naast Plaats de boorkop op het podium. De scanner begint dan met de geautomatiseerde gegevensverzameling.
   OPMERKING: Gegevens zijn klaar om te worden geanalyseerd zodra de software meldt dat de scanstatus van elke chip is geslaagd.

9. Gegevensanalyse

1. Dubbelklik op ExoView Analyzer op het bureaublad van de besturings-pc. Nadat de software is opgestart, klikt u op de knop Gegevens vooraf scannen en selecteert u de maplocatie voor de prescan-gegevensset in sectie 8.3.
2. Klik op de knop Postscan Data en selecteer de maplocatie voor de postscan dataset in sectie 8.3.
   OPMERKING: Als de gegevens in beide mappen correct worden gedetecteerd, zal de software voor ten minste enkele van de chips een "X" aantal gedetecteerde chips weergeven naast de knop Chipfile-locatie. Als de gedetecteerde chips op de juiste manier worden opgeslagen, moeten ze overeenkomen met het aantal gescande chips.
3. Klik op Volgende onder aan het gebied voor het laden van gegevens.
4. In het vervolgkeuzemenu van de metatabel heeft elke chip een cel. Voer de monsternamen, verdunningsfactoren en welke markeringen worden gekleurd in elk detectiekanaal in door in het overeenkomstige vak te klikken en de informatie in te typen; als u klaar bent, klikt u nogmaals op Volgende .
   OPMERKING: Deze metagegevens worden samen met de gegevens opgeslagen.
5. Vorm kwaliteitscontrole (QC) door op het tabblad Uitschakelen te klikken onder de knop QC in de linkerbovenhoek.
   OPMERKING: Met deze functie kunnen specifieke sondes en spanen worden uitgeschakeld voor analyse. De software geeft twee verschillende waarschuwingen met betrekking tot de gegevens, een voor hoge tellingen die kunnen aangeven dat een bepaalde opname verzadigd is, en een hoge variatiecoëfficiënt (CV) die aangeeft wanneer een van de replica's van een opnametype verschilt van de andere.
   1. Klik op een waarschuwingsplek voor een hoog CV, onderzoek de plekken die door de software worden opgeroepen en kijk of er duidelijke fysieke schade is; wanneer de schade is geïdentificeerd, klikt u op het spotnummer om die spot in de analyse uit te schakelen.
   2. Herhaal dit totdat alle waarschuwingen zijn geëvalueerd en klik vervolgens op Volgende.
6. Voer de cutoff-analyse voor door te klikken op het tabblad Cutoff naast het tabblad Disable onder de QC-knop linksboven.
   OPMERKING: Hiermee wordt de fluorescentierespons van de controlespot in een grafiek weergegeven en wordt de gebruiker twee instellingen aangeboden, een minimum en maximum voor elk kleurkanaal (rood/groen/blauw). Het instellen van de cutoff-waarde voor elk fluorescerend detectiekanaal is de enige gegevensaanpassing die moet worden gemaakt en is relatief eenvoudig. Belangrijk is dat de uiteindelijke grenswaarde die wordt gekozen, consistent moet zijn in een experiment en, zoals opgemerkt, binnen de vuistregels moet vallen voor 300-400 a.u. in rood en groen, en 400-700 a.u. voor blauw in typische experimenten; De software heeft ook voor deze bereiken kleurgecodeerde hulplijnen voor de gebruiker.
   1. Klik op het tabblad Groene kleur om de gegevens voor dat kanaal te laden en de huidige cutoffs weer te geven. Bij het onderzoeken van de isotype negatieve controlespot zou men detectiegebeurtenissen kunnen zien met zeer lage fluorescentie-intensiteiten; In dit geval moeten gebruikers doorgaans verwachten dat ze de green tussen 300-400 AU instellen.
      1. Verhoog het minimum voor elk van de detectiekanalen totdat de "Gem % Inc" (het gemiddelde % van de gedetecteerde deeltjes op de controleplek boven de grenswaarde) onder het gegevensdisplay geen waarschuwingen heeft, zoals aangegeven door rode of gele markering in die cel.
         OPMERKING: De maximale waarde hoeft over het algemeen niet te worden aangepast ten opzichte van de standaardwaarde, maar kan worden verlaagd om heldere deeltjes uit te filteren of de fluorescerende detectie te beperken tot een smaller bereik.
      2. Klik op de knop Volgende .
   2. Klik op het tabblad Rode kleur om de gegevens voor dat kanaal te laden en de huidige cutoffs weer te geven. Nogmaals, als je de isotype negatieve controleplek onderzoekt, zou men detectiegebeurtenissen kunnen zien met zeer lage fluorescentie-intensiteiten; In dit geval moeten gebruikers doorgaans verwachten dat ze het rood tussen 300-400 AU instellen. Volg dezelfde procedures als vermeld in de stappen 9.6.1.1-9.6.1.3.
   3. Klik op het tabblad Blauwe kleur om de gegevens voor dat kanaal te laden en de huidige cutoffs weer te geven. Nogmaals, bij het onderzoeken van de negatieve controleplek van het isotype, volgt u dezelfde procedures als vermeld in de stappen 9.6.1.1-9.6.1.3.
      OPMERKING: Het blauwe kanaal is uniek in die zin dat het antilichaam in de spot op voldoende niveaus autofluorescerend is om een iets hogere grenswaarde van 400-700 a.u. te vereisen, zelfs voor blanco chips.
7. Klik na voltooiing van de Cutoff-analyse op de Volgende en de heatmap-plot verschijnt, die een overzicht geeft van de deeltjesbinding in het experiment. Er zijn verschillende visualisatietools die de gebruiker kan gebruiken om de gegevens te plotten. Deze grafieken en bijbehorende onbewerkte gegevens kunnen aan een rapport worden toegevoegd door op de knop Plotrapport toevoegen te klikken.
   OPMERKING: De heatmap is de standaard gegevensweergave die een weergave van alle voorbeelden en alle opnames van een bepaalde detectie toont. De standaardweergave is het totaal dat de unieke EV's kwantificeert die aan elke veroveringsplek zijn gebonden.
8. Klik op de knop Rapport exporteren en selecteer een opslaglocatie voor het rapport.
   OPMERKING: Het rapport wordt geopend in een browser. Zoek het spreadsheetbestand met gefilterde deeltjeslijst dat bij het rapport is gevoegd; dit is de informatie die u bij EVTRACK moet indienen.
9. Ga door met het toevoegen van rapporten met behulp van de verschillende selecties van Samples en Capture types in de vervolgkeuzemenu's bovenaan het scherm. De weergegeven gegevens worden gecontroleerd met de selectie van kanaalherkenningsknoppen linksboven. Stel een bepaald fenotype/sampleselectie/opnamekanaal in door op elke kleurknop te klikken om dat detectiekanaal uit (grijs) of aan (gekleurd) uit te schakelen.
10. Klik op de knop Plot aan rapport toevoegen om de gewenste plots samen te voegen tot een rapport.
11. Klik op Rapport exporteren en definieer de opslaglocatie voor het eindrapport.

Results

Figuur 7 (linkerpaneel) toont een driekleurig samengesteld beeld van EV's afgeleid van HEK293-geconditioneerde media die zijn gebonden aan de CD63-spot op de chip en gekleurd zijn voor CD81, CD63 en CD9 in de volgende kanalen: respectievelijk groen, rood en blauw. Figuur 7 (paneel rechtsboven) is een ingezoomde afbeelding die laat zien dat elk van de vastgelegde EV's co-lokalisatie van een of meer kleuren met verschillende inten...

Discussion

De huidige EV-karakteriseringsmethoden zijn grotendeels gebaseerd op gezuiverde EV's, wat wordt beperkt door de huidige experimentele beperkingen van EV-zuiveringsmethoden 9,10,11,12,13. Interferometrische reflectiebeeldvorming met één deeltje (SP-IRIS) is een effectieve technologie die zuiveringsstappen kan elimineren die no...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-cm steriele Petri-schaal	Fisher	FB0875712
15mL steriele buis	n/a	diversen
24-wels celcultuurplaat, platte bodem	Fisher	08-772-1
Blocking Solution	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Chipbestanden	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Chips	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Chuck	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Corning Easy Grip wegwerpbare polystyreen steriele flessen 250 ml	Fisher	09-761-4
Corning Easy Grip wegwerpbare polystyreen steriele flessen 500 ml	Fisher	09-761-10
De-ioniseerd (DI) water	Fisher	LC267404
EMS stijl pincetten met koolstofvezel uiteinden	Fisher	50-193-0842
ExoView Human Tetraspanin Kit	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Capture voor hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control  + stains voor hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16 Chips per kit
ExoView R100 Imager	NanoView Biosciences	EV-R100	Interferometrische microscoop inclusief hoge specificatie camera inclusief 3 kleur fluorescentie en label vrij meting en tellen van extracellulaire vesikels
Fluorescent gelabelde huma CD9 IgG antilichaam	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Fluorescent gelabelde human CD63 IgG antilichaam	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Fluorescent gelabelde human CD81 IgG antilichaam	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Incubatie Solution	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Orbitale shaker of microplaat shaker met digitale instellingen in staat om te schudden bij 500 rpm	n/a	diversen
Plaat Seal	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Solution A	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Solution B	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Solution C	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Solution D	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	Te vinden in ExoView Human Tetraspanin Kit.
Vierkante/platte punt pincet	Fisher	50-239-62
Rechte sterke punt Boley stijl pincet	Fisher	16-100-124
Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals	Fisher	AB-0558