De speekselklier van volwassen muggen (SG) is vereist voor de overdracht van alle door muggen overgedragen pathogenen naar hun menselijke gastheren, inclusief virussen en parasieten. Deze video toont een efficiënte isolatie van de SG's van de larvale (L4) stadium Anopheles gambiae muggen en de voorbereiding van de L4 SG's voor verdere analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie en immunostaining van larvale speekselklieren van Anopheles gambiae muggen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Muggen speekselklieren (SG's) zijn een noodzakelijk toegangspoortorgaan voor de overdracht van door insecten overgedragen pathogenen. Ziekteverwekkende stoffen, waaronder virussen en de Plasmodium-parasieten die malaria veroorzaken, hopen zich op in de secretoire holtes van SG-cellen. Hier zijn ze klaar voor overdracht naar hun gewervelde gastheren tijdens een volgende bloedmaaltijd. Omdat volwassen klieren zich vormen als een uitwerking van larvale SG-kanaalknopresten die na de vroege pop SG-histolyse blijven bestaan, is de larvale SG een ideaal doelwit voor interventies die de overdracht van ziekten beperken. Inzicht in de ontwikkeling van larvale SG kan helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van de morfologie en functionele aanpassingen en helpen bij de beoordeling van nieuwe interventies die zich op dit orgaan richten. Dit videoprotocol demonstreert een efficiënte techniek voor het isoleren, fixeren en kleuren van larvale SL's van Anopheles gambiae muggen. Klieren ontleed van larven in een 25% ethanoloplossing worden gefixeerd in een methanol-glaciaal azijnzuurmengsel, gevolgd door een koude acetonwassing. Na een paar spoelingen in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), kunnen SG's worden gekleurd met een breed scala aan markerkleurstoffen en / of antisera tegen SG-uitgedrukte eiwitten. Deze methode voor larvale SG-isolatie kan ook worden gebruikt om weefsel te verzamelen voor in situ hybridisatieanalyse, andere transcriptomische toepassingen en proteomische studies.
Inleiding
Malaria is een grote bedreiging voor de volksgezondheid en veroorzaakt bijna 230 miljoen infecties en naar schatting 409.000 sterfgevallen in 20191. De meeste sterfgevallen zijn in Sub-Sahara Afrika en worden veroorzaakt door de parasiet Plasmodium falciparum, waarvan de insectenvector Anopheles gambiaeis, het onderwerp van deze videodemonstratie. Hoewel de cijfers wijzen op een aanzienlijke daling van het jaarlijkse sterftecijfer sinds de eeuwwisseling (>300.000 minder jaarlijkse sterfgevallen), nemen de veelbelovende dalingen van de ziektecijfers waargenomen van 2000 tot 2015 af, wat suggereert dat er behoefte is aan nieuwe benaderingen om de overdracht van ziekten te beperken2. Een van de veelbelovende aanvullende strategieën voor het beheersen en mogelijk elimineren van malaria is het richten op de capaciteit van muggenvectoren met behulp van CRISPR / Cas9-gebaseerde genbewerking en gene-drive3,4,5. Het is inderdaad de targeting van de muggenvector (door het uitgebreide gebruik van langdurige met insecticide behandelde klamboes) die de grootste impact heeft gehad op het verminderen van ziekteoverdracht6.
Vrouwelijke muggen verwerven Plasmodium-gametocyten van een geïnfecteerde mens tijdens een bloedmaaltijd. Na bevruchting, rijping, midgut epitheel traversal, populatie-uitbreiding en hemocoelnavigatie in hun obligate muggengastheren, dringen honderden tot tienduizenden Plasmodium-sporozoïeten de mug-SG's binnen en vullen de secretoire holtes van de samenstellende secretoire cellen. Eenmaal in de secretoire holtes hebben de parasieten directe toegang tot het speekselkanaal en zijn ze dus klaar voor overdracht naar een nieuwe gewervelde gastheer bij het volgende bloedmaal. Omdat SG's van cruciaal belang zijn voor de overdracht van malaria-veroorzakende sporozoïeten naar hun menselijke gastheren, en laboratoriumstudies suggereren dat SG's niet essentieel zijn voor bloedvoeding, muggenoverleving of vruchtbaarheid7,8,9, vormen ze een ideaal doelwit voor transmissieblokkerende maatregelen. Volwassen mug SG's vormen zich als een uitwerking van "kanaalknop" overblijfselen in de larvale SG's die blijven bestaan na vroege pop SG histolysis10, waardoor de larvale SG een ideaal doelwit is voor interventies om de overdracht van ziekten in een volwassen stadium te beperken.
Het karakteriseren van het larvale stadium van SG-ontwikkeling kan niet alleen helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van de morfologie en functionele aanpassingen, maar kan ook helpen bij het beoordelen van nieuwe interventies die zich op dit orgaan richten door genbewerking van belangrijke SG-regulatoren. Omdat alle eerdere studies van larvale speekselklierarchitectuur dateren van vóór immunostaining en moderne beeldvormingstechnieken10,11, hebben we een protocol ontwikkeld voor het isoleren en kleuren van speekselklieren met een verscheidenheid aan antilichamen en celmarkers12. Deze video demonstreert deze benadering van de extractie, fixatie en kleuring van larvale SL's uit Anopheles gambiae L4-larven voor confocale beeldvorming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van oplossingen en hulpmiddelen
- Bereiding van dissectie-oplossing
- Om de ontleedoplossing te bereiden, voegt u 2,5 ml 100% ethanol toe aan 7,5 ml gedestilleerde H2O in een buis van 15 plastic. Keer de buis 3 keer om om te mengen.
OPMERKING: Deze oplossing kan enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard.
- Om de ontleedoplossing te bereiden, voegt u 2,5 ml 100% ethanol toe aan 7,5 ml gedestilleerde H2O in een buis van 15 plastic. Keer de buis 3 keer om om te mengen.
- Bereiding van 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voorraad
- Om 10x PBS-bouillon te bereiden, voegt u 17,8 g Na2HPO4•2H 2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl en 2 g KCl toe aan 800 ml gedeïoniseerd water. Meng met een roerstaaf op een roerplaat tot de vaste stoffen volledig zijn opgelost. Stel het uiteindelijke volume in op 1 L met gezuiverd water.
OPMERKING: Deze oplossing kan enkele maanden bij kamertemperatuur worden bewaard.
- Om 10x PBS-bouillon te bereiden, voegt u 17,8 g Na2HPO4•2H 2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl en 2 g KCl toe aan 800 ml gedeïoniseerd water. Meng met een roerstaaf op een roerplaat tot de vaste stoffen volledig zijn opgelost. Stel het uiteindelijke volume in op 1 L met gezuiverd water.
- Bereiding van 1x PBS
- Voeg 10 ml 10x PBS toe aan 90 ml H2O in een steriele glazen fles. Sluit de deksel goed en keer 3x om om te mengen.
OPMERKING: De oplossing kan enkele weken bij 4 °C worden bewaard.
- Voeg 10 ml 10x PBS toe aan 90 ml H2O in een steriele glazen fles. Sluit de deksel goed en keer 3x om om te mengen.
- Voorbereiding van fixatief.
- Voeg 600 μL methanol toe aan 200 μL ijsazijn. Maak de oplossing elke keer vers.
- Constructie van stopverfplaat (een weefselkweekschaal gevuld met siliconenrubber)
- Meng de componenten (1:50) epoxy (1 g) en water (50 ml) en giet het mengsel in een petrischaaltje. Wacht tot de componenten zijn opgedroogd voordat u ze gebruikt.
OPMERKING: Eenmaal geconstrueerd, kan de stopverfplaat jarenlang worden gebruikt.
- Meng de componenten (1:50) epoxy (1 g) en water (50 ml) en giet het mengsel in een petrischaaltje. Wacht tot de componenten zijn opgedroogd voordat u ze gebruikt.
2. Klierdissectie (Figuur 1A)
- Verzamel L4-larven in een laat stadium (~ 10 dagen na het uitkomen; Figuur 2) van voerbakken met behulp van een plastic transferpipet.
OPMERKING: Zie deze handige online handleiding voor standaard muggenhouderij en larvale cultuur13.- Plaats een stopverfplaat op het podium van een ontleedmicroscoop en breng larven over op de stopverfplaat.
OPMERKING: Bij het aliquoteren van larven voor de eerste dissectie, is het nuttig om ~ 10 larven tegelijk op de dia over te brengen met behulp van een plastic transferpipet.
- Plaats een stopverfplaat op het podium van een ontleedmicroscoop en breng larven over op de stopverfplaat.
- Plaats een druppel dissectie-oplossing (1:3 EtOH:H2O) op de stopverfplaat, los van de 10 larven.
- Gebruik een plastic transferpipet of glazen wegwerppipet om één L4-larve in de 25% EtOH-druppel te plaatsen.
- Neem een tang (# 5), één in elke hand, en pak met de niet-dominante hand de kop van de larve vast. Gebruik de dominante hand, pak de larve met een tang net onder het hoofd en trek zachtjes met minimale constante kracht, zodat het hoofd loskomt van de rest van het lichaam en de klieren aan het hoofd blijven vastzitten. Gooi het lichaamsgedeelte van het geslachte karkas van de larve weg.
OPMERKING: Zet bij het ontleden een papieren handdoek in de buurt om de larvenkarkassen te verzamelen. - Verzamel de kop/klieren in 1 ml 1x PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Gebruik 1 ml PBS voor ~ 40 ontlede klieren met hun gehechte hoofden. Wacht tot de koppen/SG's naar de bodem van de buffer zinken.
3. Fixatie voor antilichaamkleuring (Figuur 1B)
- Giet de PBS af vanaf de bovenkant van de microcentrifugebuis met behulp van een glazen transferpipet, vermijd de kleverige muggenweefsels en verwijder zoveel mogelijk van de PBS-oplossing zonder de weefsels te beschadigen. Vervang de oplossing door 800 μL van een 3:1 mengsel van methanol tot ijsazijn. Plaats de tube 's nachts op 4 °C (12-24 uur aanbevolen; 19 uur bij voorkeur).
- Giet de volgende dag de oplossing af en vervang deze door 1 ml koude 100% aceton. Laat staan voor 90 s.
- Verwijder de aceton en spoel de weefsels drie keer voorzichtig af met telkens 1 ml 1x PBS.
OPMERKING: De monsters moeten langzaam omhoog drijven met de stroom en vervolgens terugvallen naar de bodem van de buis tegen de tijd dat elke PBS-toevoeging is voltooid.
4. Immunostaining (Figuur 1B)
- Voeg primair antilichaam (bijv. Rab11) toe bij de juiste verdunning (1:100) in 200 μL van het totale volume van 1x PBS. Draai de inhoud van de buis voorzichtig rond met een pipetpunt. Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was driemaal met 1 ml 1x PBS (pipetteer de oplossing voorzichtig in en uit de pipet).
- Voeg secundair antilichaam (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) toe bij de juiste verdunning (1:200) in 200 μL van het totale volume. Draai de inhoud van de buis voorzichtig rond met een pipetpunt. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 90 min.
- Voeg in dit stadium kleurstoffen, zoals Nile Red (lipiden, 5 μL van 1 μg/μL) en/of Hoechst (DNA, 3 μL van 1 μg/μL), toe aan 200 μL PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende nog eens 60 minuten. Was drie keer voorzichtig met 1x PBS.
5. Montage van gekleurde wartels voor microscopie (Figuur1C)
- Pipetteer 200 μL 100% glycerol op een microscoopglaasje.
OPMERKING: Aangezien glycerol stroperig is, laat u de pipetpunt in de vloeistof totdat deze het juiste volume bereikt. Er werd geen weefselkrimp waargenomen bij het rechtstreeks overgaan in 100% glycerol. Onderzoekers kunnen echter 30% en 50% glycerolwassingen in de buizen doorlopen voordat de monsters naar 100% glycerol worden verplaatst. - Breng de gekleurde koppen (tot 20 per dia) met de aangehechte klieren (samen met andere interne structuren) over naar het microscoopglaasje met een zachte borstel(figuur 3A). Verdeel de monsters zodat ze gelijkmatig over de glasplaat worden verdeeld.
OPMERKING: Bij het deponeren van klieren op een afdekschuif met een borstel, kan een tang worden gebruikt om de SG's voorzichtig te oriënteren, zodat ze allemaal in dezelfde richting zijn gericht. - Kijk onder een ontleedmicroscoop, scheid de larvale kop van de klieren met behulp van twee paar tangen en trek de twee weefsels voorzichtig in tegengestelde richtingen.
OPMERKING: Omdat het een uitdaging is om de SG's volledig te isoleren, verwijdert u eenvoudig de koppen, waardoor de SG's en bijbehorende interne structuren achterblijven. Zelfs als de SG's geassocieerd blijven met andere weefsels, zijn ze gemakkelijk te herkennen wanneer ze gekleurd zijn met Hoechst en andere markers(figuur 3B,C). - Verwijder en gooi de koppen weg en herhaal het scheidingsproces voor elke SG.
OPMERKING: Wanneer u de koppen verwijdert, plaatst u een papieren handdoek in de buurt om ze te verzamelen. - Plaats voorzichtig een 1,5 mm dikke deklip aan de bovenkant (vermijd luchtbellen) en sluit af met heldere nagellak.
- Bewaren bij 4 °C in een lichtdichte verpakking.
OPMERKING: Voorbereide dia's van gekleurde klieren kunnen tot zes maanden tot een jaar in het donker bij 4 ° C worden bewaard zonder noemenswaardige kwaliteitsveranderingen. Als glycerol begint te lekken naarmate de maanden verstrijken, til dan voorzichtig de coverslip op en pipetteer meer glycerol om gaten te vullen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Speekselklieren zijn relatief eenvoudig te ontleden van alle larven van stadium 4. Mannelijke en vrouwelijke larven kunnen in het late L4-larvale stadium worden onderscheiden door een rode streep langs de dorsale thorax van vrouwtjes maar niet van mannetjes (figuur 2). We zien ook dat de morfologie van de antenne veel uitgebreider is bij mannelijke dan bij vrouwelijke L4-larven (figuur 2), vergelijkbaar met de verschillen die in deze structuur worden waargenomen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hierin beschreven protocol is aangepast van een Drosophila SG dissectieprotocol en een volwassen muggendissectieprotocol14,15,16. De meeste markers drongen echter niet door het keldermembraan (gegevens niet getoond) bij gebruik van de volwassen dissectie- en SG-kleuringsmethoden. Aanpassingen van het volwassen protocol omvatten het ontleden van de klieren in een 25% EtOH-oplossing, het wassen van de klieren met een combinati...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen het Johns Hopkins Malaria Research Institute bedanken voor de toegang tot en het fokken van An. gambiae larven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Aceton | Millipore Sigma | 179124 | |
| Borstel met zachte borstels | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Dekglasjes (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glazuur azijnzuur | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Juwelierstangen, Dumont nr. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nagellak | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipide) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Papierhanddoeken/doekjes | ULINE | S-7128 | |
| Petrischaal (om putty-schaal te maken) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipetpunten | Gilson | Tips E200ST | |
| Kunststof overdrachtspipet | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primaire antilichamen (bijv. Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Muis anti-Crb (Cq4) of Konijn anti-Rab11 | |
| Secundaire antilichamen met fluorescerende tags (bijv. Alexa Fluor 488 Goat-anti Konijn) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Siliconenhars en verharder voor putty-schaal | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Glijbanen, aan één kant ontdooid voor het labelen | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Tarwekiemen Agglutinine | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referenties
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553(2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672(2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115(1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617(2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
- Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
