Hier beschrijven we het gebruik van een nieuwe microplaattest om mechanische manipulatie van biomoleculen mogelijk te maken tijdens het uitvoeren van ensemble biochemische assays. Dit wordt bereikt met behulp van een microplaatdeksel dat is gemodificeerd met magneten om meerdere statische magnetische pincetten over de microplaat te creëren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Magnetische pincet in microplaatformaat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mechanobiologie beschrijft hoe de fysische krachten en mechanische eigenschappen van biologisch materiaal bijdragen aan fysiologie en ziekte. Doorgaans zijn deze benaderingen beperkte methoden met één molecuul, wat hun beschikbaarheid beperkt. Om aan deze behoefte te voldoen, werd een microplaattest ontwikkeld die mechanische manipulatie mogelijk maakt tijdens het uitvoeren van standaard biochemische testen. Dit wordt bereikt met behulp van magneten die in een microplaatdeksel zijn verwerkt om meerdere magnetische pincetten te maken. In dit formaat wordt kracht uitgeoefend op biomoleculen die zijn verbonden met paramagnetische kralen, wat overeenkomt met een typisch magnetisch pincet. De studie demonstreert de toepassing van deze tool met op FRET gebaseerde assays om eiwitconformaties te monitoren. Deze benadering is echter algemeen toepasbaar op verschillende biologische systemen, variërend van het meten van enzymatische activiteit tot de activering van signaalroutes in levende cellen.
Inleiding
Mechanobiologie richt zich op het begrijpen hoe de voortplanting van fysische krachten in en tussen cellen de cellulaire activiteit reguleert 1,2 en hoe dit correleert met de organisatie en dynamiek van zowel eiwitten als cellen.
Krachtmetingen met één molecuul hebben onthuld hoe kracht wordt gebruikt in biologische systemen, van afzonderlijke eiwitten tot hele cellen en weefsels 3,4,5,6,7. Deze uitdagende experimenten vereisen gespecialiseerde apparatuur en technische expertise. Omgekeerd kunnen standaard biochemische tests worden uitgevoerd met een hogere doorvoer in direct verkrijgbare commerciële apparatuur.
Hier beschrijft de studie een mechanobiologische test die het mogelijk maakt om manipulatie op basis van magnetische pincetten en biochemische tests samen uit te voeren8. Magneten worden op een 3D-geprint microplaatdeksel geplaatst (Figuur 1A-D), waardoor het gebruik van commerciële plaatlezers voor de testen mogelijk is. Er wordt kracht uitgeoefend op het biomolecuul van belang door het molecuul te koppelen aan paramagnetische deeltjes. De magneten oefenen dan spanning uit over het molecuul. Door de afstand tussen de deeltjes en magneten te veranderen, wordt de uitgeoefende kracht over het biomolecuul aangepast (Figuur 1E).
We vertegenwoordigen het gebruik van deze test met behulp van de op actine gebaseerde moleculaire motor, Myosine VI. Myosine VI wordt gereguleerd door intramoleculaire backfolding9. Van myosine VI is aangetoond dat het in een auto-geremde toestand bestaat, waarbij de binding van partnereiwitten, zoals NDP52, de ontvouwing van myosine VI10,11 veroorzaakt. Om deze testen uit te voeren, zullen we een dual-gelabeld construct van het myosine VI-staartdomein gebruiken met een N-terminale GFP en een C-Terminal RFP waarbij backfolding van het eiwit Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) genereert tussen GFP en RFP. De N-terminus draagt ook een biotinyleringslabel om het eiwit op het oppervlak te immobiliseren. We gebruiken deze test in combinatie met FRET-metingen om aan te tonen hoe kracht van invloed kan zijn op myosine VI back-folding.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voorbeeldeiwitten die nodig zijn voor dit experiment en een lijst met reagentia zijn te vinden in de Materiaaltabel. Equivalente eiwitten moeten worden geproduceerd voor het onderzoekssysteem van de gebruiker om conformatieveranderingen te meten.
1. 3D bedrukt magnetisch deksel
- Ontwerp een microplaatdeksel om de magneten in een microplaat met 24 putjes te huisvesten. Een voorbeeld van een CAD-bestand kan worden gedownload van GitHub12. De metingen zijn weergegeven in figuur 1.
NOTITIE: De hoogte van het voetstuk kan worden gewijzigd om de afstand tussen magneten en het oppervlak te veranderen om de uitgeoefende kracht te veranderen. Bovendien hangt de uiteindelijke kracht die op het deeltje wordt uitgeoefend af van de deeltjesgrootte en de opening tussen het paar magneten. Vergelijkingen voor het berekenen van de uitgeoefende kracht voor deeltjes van 1 μm en 2,8 μm bij openingen van 0,5 mm, 1 mm en 2 mm worden gegeven in Dos Santos et al.8. Gebruik vergelijking 1 voor de hier beschreven experimenten met deeltjes van 2,8 μm en een opening van 2 mm.
Vergelijking 1:
- 3D-print een microplaatdeksel met behulp van polyethyleentereftalaatglycol (PETG) op een 3D-printersysteem.
OPMERKING: Gebruik een printer met een laagresolutie van 0,02 mm voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. De impact van de nauwkeurigheid van printers werd besproken in Dos Santos et al.8. - Bevestig paren van 5 mm kubus Neodymium N42-magneten met lijm aan de sokkels met de magnetische polen georiënteerd om het veld te creëren dat naar de onderkant van de microplaat is gericht.
- Laat ten minste 1 positie leeg om te fungeren als een niet-magneetbediening.
- Bewaar in een afgesloten container van voldoende grootte om het deksel gemakkelijk te plaatsen en te verwijderen.
2. Wijziging van het microplaatoppervlak
- Neem een schone, niet-behandelde microplaat met glazen bodem en 24 putjes.
- Was de putjes 3x met 500 μL wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 50 mM NaCl) op kamertemperatuur.
- Voeg 200 μL biotine-BSA (0,2 mg/ml) toe aan de wasbuffer en laat het 15 minuten ongestoord op kamertemperatuur staan.
LET OP: Biotine-BSA wordt gebruikt voor zowel passiveren als bevestigen. Andere passiverings- en oppervlaktebevestigingsstrategieën kunnen worden gebruikt. Voor het eerste gebruik en optimalisatie kan de concentratie biotine-BSA worden gevarieerd tot 1 mg/ml. - Was de putjes 3x met 500 μL wasbuffer.
- Voeg 200 μL streptavidine (20 μg/ml) toe aan de wasbuffer en laat het 15 minuten ongestoord op kamertemperatuur staan.
OPMERKING: Voor het eerste gebruik kan de concentratie streptavidine worden gevarieerd tot 1 mg/ml. - Verwijder de oplossing en was de putjes vervolgens 3x met wasbuffer.
- Dek de putjes af met 500 μL wasbuffer.
- Bewaren bij 4 °C tot gebruik. Borden moeten op dezelfde dag worden gebruikt.
3. Monstervoorbereiding: Eiwitimmobilisatie
- Laat de oppervlaktegemodificeerde microplaat op kamertemperatuur komen.
- Was de putjes met 500 μL wasbuffer.
- Voeg 100 nM biotine-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (voorraadmonstereiwit) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in wasbuffer.
OPMERKING: Dit voorbeeldeiwit wordt geproduceerd zoals beschreven door Dos Santos et al.8. Concentraties en incubatietijden kunnen variëren, afhankelijk van het eiwit. - Was de putjes 3x met 500 μL wasbuffer.
- Stel de plaatlezer in om fluorescentiespectra voor GFP (excitatie 490 nm en emissie 510-600 nm) en RFP (excitatie 560 nm en emissie 580-650 nm) op te nemen om de aanwezigheid van de fusie-eiwitten te bevestigen.
- Als er een tekort aan eiwit is, verhoog dan de concentratie bij stap 3.3.
OPMERKING: Een slechte binding kan verband houden met onvoldoende biotine-BSA- en/of streptavidinebinding, en daarom kunnen de hoeveelheden 10-voudig worden verhoogd. - Voer indien mogelijk een putscanmeting uit om te bepalen of het fusie-eiwit over de microplaat is gebonden (Figuur 2).
OPMERKING: Deze meting registreert de fluorescentie-intensiteit op specifieke punten in de microplaatput. Het zal onthullen of het eiwit over de put is gebonden. - Zorg ervoor dat het signaal uniform is (binnen 5%) in het midden van de put waar de testmeting plaatsvindt.
4. Voorbereiding van magnetische kralen
- Vortex de injectieflacon met 2,8 μm paramagnetische kralen met recombinant eiwit A (materiaaltabel) gedurende 30 s om de kralen opnieuw te suspenderen.
- Breng het volume dat overeenkomt met 1 mg paramagnetische kralen over in een tube van 1,5 ml.
- Plaats de buis in een magnetische isolator (Materiaaltabel) en verwijder vervolgens het supernatant.
- Resuspendeer de korrels in 200 μl PBS door de oplossing voorzichtig op en neer te pipetteren.
- Plaats de buis in de magnetische isolator en verwijder vervolgens de supernatant.
- Herhaal de wasstap 3x.
- Verdun 10 μg anti-RFP-antilichaam in 200 μl PBS.
- Isoleer de kralen in de magnetische isolator en suspendeer ze vervolgens opnieuw in de antilichaamoplossing.
- Draai 10 minuten op 20 tpm bij kamertemperatuur op een tafelrotator.
- Plaats de buis in de magnetische isolator en verwijder de supernatant.
- Was 3x in PBS.
- Resuspendeer de korrels in 200 μL wasbuffer.
- Om de immobilisatie van antilichamen op de kralen te bevestigen, incubeer je de met antilichamen beladen kralen met een oplossing van >1 μM RFP-fusie-eiwit.
OPMERKING: Controleer visueel of het eiwit wordt geïsoleerd door de kralen. - U kunt ook de fluorescentie-intensiteit van het supernatans (excitatie 560 nm en emissie 580-650 nm) voor RFP meten in een fluorescentiespectrometer.
5. Monstervoorbereiding: Parelbevestiging
- Voeg 10 μg van de in wasbuffer verdunde paramagnetische kraal-antilichaamfusie (200 μl) toe aan de eiwitgebonden microplaatputjes.
- Plaats geen kralen in één controleput om te controleren of de kralen effect hebben op het fluorescerende signaal. Bereid een controlemonster voor zonder antilichamen om eventuele niet-specifieke interacties met de kralen te bepalen.
- Incubeer de microtiterplaat 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de putjes 3x met 500 μL wasbuffer.
- Indien lokaal beschikbaar, controleer dan of de kralen aan het oppervlak zijn gebonden met een helderveldmicroscoop. Als er een gebrek aan korrels is, verhoog dan de concentratie in stap 5.1 tot 500 μg/ml.
6. Gegevensverzameling
- Plaats de microplaat, zonder deksel, in een fluorescerende plaatlezer bij 25 °C.
- Stel de plaatlezer in om fluorescentiespectra voor GFP (excitatie 490 nm en emissie 510-600 nm) en RFP (excitatie 560 nm en emissie 580-650 nm) op te nemen om de aanwezigheid van de fusie-eiwitten te bevestigen.
NOTITIE: Meet/registreer de fluorescentiespectra via de onderkant van de microplaat om het deksel erop te plaatsen. Daarom moet een geschikte microplaatlezer worden gekozen. - Neem een FRET-fluorescentiespectrum op (excitatie 490 nm en emissie 510-650 nm), of monitor fluorescentie bij 510 nm en 610 nm met excitatie bij 490 nm. Deze is ingesteld volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Verwijder de microplaat van de lezer en voeg het magnetische deksel toe.
- Keer terug naar de plaatlezer en laat het monster 2 minuten staan.
- Herhaal de FRET-meting, zoals in stap 6.3.
7. Gegevensanalyse
- Exporteer de gegevens om ze te importeren in een spreadsheet (bijv. Excel).
- Extraheer handmatig de gegevens voor donor-GFP bij 510 nm en acceptor-RFP bij 610 nm.
- Bereken de relatieve FRET met behulp van vergelijking 2 voor elke voorwaarde.
Vergelijking 2:
A: acceptorintensiteit (RFP 610 nm), D: donorintensiteit (GFP 510 nm).
OPMERKING: Gebruik de recombinante RFP onder dezelfde excitatie- en emissievoorwaarden om de achtergrondexcitatie van de acceptor te controleren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2 toont een voorbeeld van een putscanmeting waarbij de fluorescentie-intensiteit van GFP met tussenpozen van 1 mm over de microplaatput is geregistreerd. Typische fluorescentiemetingen worden uitgevoerd op de middenpositie van de microplaatput (positie 8,8 in figuur 2); Het is daarom belangrijk dat er op deze plek gebonden eiwit aanwezig is. Zoals te zien is in figuur 2, is de intensiteit het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze benadering maakt het mogelijk om op kracht gebaseerde metingen gemakkelijk toe te passen in een microtiterplaat met behulp van fluorescerende plaatlezers. Belangrijk is dat dit testformaat ervan uitgaat dat er functioneel eiwit is wanneer het aan een oppervlak is gebonden. Daarom is voorkennis vereist voordat met deze metingen wordt begonnen om er zeker van te zijn dat er eiwitactiviteit is. Het is ook nuttig om ervoor te zorgen dat de binding van moleculen aan de paramagnetische kr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
We danken Cancer Research UK (A26206), de MRC (MR/M020606/1) en de Royal Society (RG150801) voor financiering.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 well glass-bottom microplate | Cellvis | P24-1.5H-N | Er zijn meerdere bronnen beschikbaar. Tenzij nodig, is het het beste om behandelde oppervlakken te vermijden en we gebruiken Imaging grade glass N1.5. |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab290 | Er zijn meerdere bronnen beschikbaar, maar moet worden gewaarborgd dat er minimale reactiviteit is met GFP. |
| Bench top light microscope | Optika | IM-3 | |
| Bench top Rotator | Cole-Palmer-Stuart | SB3 | |
| Biotin-BSA | Sigma Aldrich | A8549 | |
| CAD Software - Sketch Up Educator | Sketch Up | Alternatieve CAD-software kan worden gebruikt. Gebruikers moeten ervoor zorgen dat de bestandsindelingen compatibel zijn met hun 3D-printer. | |
| Dynabeads Protein A | Fisher Scientific | 10746713 | 2.8 µm paramagnetische kralen met recombinant Protein A |
| Impact contact adhesive | EVO-STIK | ||
| MagnaRack magnetic separation rack | ThermoFisher Scientific | CS15000 | Magnetische Isolator |
| NaCl | Fisher Scientific | 10316943 | |
| Neodymium N42 5mm cube Magnets | Supermagnete | W-05-N | |
| Plate Reader - ClarioStar | BMG Labtech | Alle plate reader systemen kunnen worden gebruikt waar metingen mogelijk zijn van onder de microplaat. De magneetdeksel sluit standaardmetingen van boven uit | |
| Streptavidin | Sigma Aldrich | 189730 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 10142400 | |
| Ultimaker PETG Filament | Ultimaker | ||
| Ultimaker S3 - 3D printer | Ultimaker |
Referenties
- Jansen, K. A., et al. A guide to mechanobiology: Where biology and physics meet. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, 3043-3052 (2015).
- Dos Santos, A., Toseland, C. P. Regulation of nuclear mechanics and the impact on dna damage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3178(2021).
- Dos Santos, A., et al. DNA damage alters nuclear mechanics through chromatin reorganization. Nucleic Acids Research. 49 (1), 340-353 (2020).
- Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171, 1397-1410 (2017).
- Lherbette, M., et al. Atomic force microscopy micro-rheology reveals large structural inhomogeneities in single cell-nuclei. Scientific Reports. 7, 8116(2017).
- Seo, D., et al. A mechanogenetic toolkit for interrogating cell signaling in space and time. Cell. 165, 1507-1518 (2016).
- Yao, M., et al. The mechanical response of talin. Nature Communications. 7, 11966(2016).
- Dos Santos, A., Fili, N., Pearson, D. S., Hari-Gupta, Y., Toseland, C. P. High-throughput mechanobiology: Force modulation of ensemble biochemical and cell-based assays. Biophysical Journal. 120, 631-641 (2021).
- Fili, N., Toseland, C. P. Unconventional myosins: How regulation meets function. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 67(2019).
- Fili, N., et al. Competition between two high- and low-affinity protein-binding sites in myosin VI controls its cellular function. Journal of Biological Chemistry. 295, 337-347 (2020).
- Fili, N., et al. NDP52 activates nuclear myosin VI to enhance RNA polymerase II transcription. Nature Communications. 8, 1871(2017).
- MagPlate at GitHub. , Available from: https://github.com/cptoseland/MagPlate (2021).
- Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6, 85-95 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
