Dit protocol presenteert een radioactief gelabelde aminozuuropnametest, die nuttig is voor het evalueren van aminozuurconsumptie in primaire cellen of in geïsoleerde botten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van aminozuurconsumptie in gekweekte botcellen en geïsoleerde botschachten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Botontwikkeling en homeostase is afhankelijk van de differentiatie en activiteit van botvormende osteoblasten. Osteoblastdifferentiatie wordt sequentieel gekenmerkt door proliferatie gevolgd door eiwitsynthese en uiteindelijk botmatrixsecretie. Proliferatie en eiwitsynthese vereisen een constante toevoer van aminozuren. Desondanks is er zeer weinig bekend over aminozuurconsumptie bij osteoblasten. Hier beschrijven we een zeer gevoelig protocol dat is ontworpen om aminozuurconsumptie te meten met behulp van radioactief gelabelde aminozuren. Deze methode is geoptimaliseerd om veranderingen in aminozuuropname te kwantificeren die geassocieerd zijn met osteoblastproliferatie of -differentiatie, medicijn- of groeifactorbehandelingen of verschillende genetische manipulaties. Belangrijk is dat deze methode door elkaar kan worden gebruikt om aminozuurconsumptie in gekweekte cellijnen of primaire cellen in vitro of in geïsoleerde botschachten ex vivo te kwantificeren. Ten slotte kan onze methode eenvoudig worden aangepast om het transport van een van de aminozuren te meten, evenals glucose en andere radioactief gelabelde voedingsstoffen.
Inleiding
Aminozuren zijn organische verbindingen die een amino (-NH2) en carboxyl (-COOH) functionele groepen bevatten met een variabele zijketen die specifiek is voor elk aminozuur. Over het algemeen staan aminozuren bekend als het basisbestanddeel van eiwitten. Meer recent zijn nieuwe toepassingen en functies van aminozuren opgehelderd. Individuele aminozuren kunnen bijvoorbeeld worden gemetaboliseerd om intermediaire metabolieten te genereren die bijdragen aan bio-energetica, functioneren als enzymatische cofactoren, reactieve zuurstofsoorten reguleren of worden gebruikt om andere aminozuren te synthetiseren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Veel studies tonen aan dat aminozuurmetabolisme van cruciaal belang is voor celpluripotentie, proliferatie en differentiatie in verschillende contexten 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblasten zijn secretoire cellen die de collageen type 1 rijke extracellulaire botmatrix produceren en afscheiden. Om hoge snelheden van eiwitsynthese tijdens botvorming te ondersteunen, vragen osteoblasten om een constante toevoer van aminozuren. Om aan deze vraag te voldoen, moeten osteoblasten actief aminozuren verwerven. In overeenstemming hiermee onthullen recente studies het belang van aminozuuropname en metabolisme in osteoblastactiviteit en botvorming 15,16,17,18,19,20.
Osteoblasten verwerven cellulaire aminozuren uit drie belangrijke bronnen: extracellulair milieu, intracellulaire eiwitafbraak en de novo aminozuurbiosynthese. Dit protocol zal zich richten op de evaluatie van aminozuuropname uit extracellulaire omgeving. De meest gebruikelijke methoden om de opname van aminozuren te meten, zijn afhankelijk van radioactief gelabelde (bijv. 3H of 14C) of zware isotoop gelabelde (bijv. 13C) aminozuren. Zware isotopomesten kunnen de opname en het metabolisme van aminozuren grondiger en veiliger analyseren, maar zijn tijdrovender en het duurt meerdere dagen om te voltooien, omdat het een dag duurt om monsters voor te bereiden en te derivatiseren en meerdere dagen om te analyseren op de massaspectrometer, afhankelijk van het aantal monsters21,22. Ter vergelijking: radioactief gelabelde aminozuuropnametests zijn niet informatief over het downstream-metabolisme, maar zijn goedkoop en relatief snel, omdat ze binnen 2-3 uur na het begin van het experiment kunnen worden voltooid 23,24. Hier beschrijven we een gemakkelijk te wijzigen basisprotocol dat is ontworpen om de opname van radioactief gelabelde aminozuren in gekweekte primaire cellen of cellijnen in vitro of individuele botschachten ex vivo te evalueren. De toepassing van deze twee protocollen kan worden uitgebreid naar andere radioactief gelabelde aminozuren en andere bot geassocieerde celtypen en weefsels.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muisprocedures die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Animal Studies Committees van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas in Dallas. Het stralingsprotocol werd goedgekeurd door de Radiation Safety Advisory Committee van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas in Dallas.
1. Aminozuuropname in cellen (Protocol I)
- Plaat 5 x 104 ST2 cellen in elk putje van een 12-well weefselkweekplaat. Plaatcellen in α-MEM met 10% FBS, 100 U/ml penicilline en 0,1 μg/ml streptomycine (pen/streptop). Plaat extra putten van cellen om het celnummer per voorwaarde te kwantificeren voor de normalisaties in stap 1.12. Incubeer cellen in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Kweek de cellen gedurende 2-3 dagen totdat ze samenvloeien.
- Bereid op de dag van het experiment de volgende oplossingen: 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7,4 en Krebs Ringers HEPES (KRH) buffer, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). Prewarm tot 37 °C.
- Aspirateer het medium en was de cellen tweemaal met 1 ml 1x PBS, pH 7,4.
OPMERKING: Dit protocol is ook geschikt voor het snel delen van niet-confluente cellen. In dit geval is het belangrijk om de radioactiviteit te normaliseren tot een absoluut celaantal of DNA-inhoud. Overweeg bovendien om de grootte van de kweekplaat of kolf te vergroten om het totale celnummer en de cpm-waarden te verhogen. Dit is belangrijk om empirisch op individuele basis te bepalen. - Aspirateer 1x PBS en was de cellen eenmaal met 1 ml KRH.
- Maak 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamine werkmedia door 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutaminevoorraad per 1 ml KRH te verdunnen.
OPMERKING: Voordat u radioactieve materialen gebruikt, neemt u contact op met het Office of Radiation Safety van uw thuisinstelling om goedkeuringen te verkrijgen. Alle procedures met betrekking tot straling moeten achter het plexiglas schild worden uitgevoerd. - Incubeer cellen met 0,5 ml KRH met 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamine werkmedia gedurende 5 min.
- Verzamel het radioactieve medium en doseer in de container met vloeibaar afval. Was de cellen drie keer kort met ijskoude KRH om de reactie te beëindigen. Verzamel en gooi alle wassingen in de container met radioactief vloeibaar afval.
- Voeg 1 ml 1% SDS toe aan elke put en trituur 10x om de cellen te lyseren en te homogeniseren. Breng de cellysaten over op buizen van 1,5 ml. Gooi celkweekplaten, serologische pipetten en pipetpunten weg in de container met vast radioactief afval.
- Centrifugeer bij > 10.000 x g gedurende 10 minuten. Breng de supernatanten over in scintillatieflacons die 8 ml van de scintillatieoplossing bevatten. Meng door de scintillatieflacons krachtig te schudden. Gooi buizen en pipetpunten weg in een container met vast radioactief afval.
- Lees radioactiviteit in tellingen per minuut (cpm) met behulp van een scintillatieteller. Gooi scintillatieflacons weg in de afvalcontainer van de scintillatieflacon.
- Trypsinize, resuspend en tel de cellen van de resterende niet-radioactieve platen van cellen (zie stap 1.1) om het aantal cellen in de gelyseerde, radioactieve culturen te schatten. Tel met behulp van een hemocytometer het aantal cellen per niet-radioactieve put voor elke experimentele toestand. Normaliseer de cpm vanaf stap 1.11 naar het geschatte celnummer van de niet-radioactieve platen.
- Na voltooiing van het experiment ontsmet u de celkweekkap, bank en alle instrumenten met een radioactiviteitsdecontaminatiespray. Voer ten slotte veegtests uit om ervoor te zorgen dat het werkgebied stralingsvrij is.
2. Aminozuuropname in vers geïsoleerd botweefsel (Protocol II)
- Prewarm KRH tot 37 °C.
- Euthanaseer een muis van 3 dagen oud en verwijder de huid op de armen. Disarticuleer de humeri van de schouder met een schaar en ontleed beide humeri. Verwijder alle extemporaneeuze weefsels met behulp van een scalpel en een tang. Verwijder de epifysen uit het bot.
OPMERKING: Naast humerii kan dit protocol worden aangepast aan neonatale femora, tibiae en calvariae, evenals humerii, femora en tibiae geïsoleerd van 2- en 4 maanden oude muizen (ongepubliceerde gegevens). - Spoel merg uit het bot en weeg de botschachten om te normaliseren in stap 2.14.
- Kook een opperarmbeen in 1x PBS bij 100 °C gedurende 10 minuten om het bot te decellulariseren. Het gedecellulariseerde gekookte bot wordt gebruikt als een negatieve controle.
OPMERKING: Als kwaliteitscontrole integreert paraffine de gekookte en niet-gekookte botten voor histologische vlekken om visueel te bevestigen dat koken effectief was bij het decellulariseren van het bot. - Balanceer beide humeri in 1 ml KRH gedurende 30 minuten in de celkweekincubator bij 37 °C.
- Maak een werkoplossing van 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-Arginine in KRH door 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Argininevoorraad per 1 ml KRH te verdunnen.
OPMERKING: Dit protocol is geschikt om de opname te evalueren van welke radioactief gelabelde voedingsstof dan ook wordt gekozen. L-[2,3,4-3 H]-glutamine, L-[14CU]-alanine en L-[2,3-3H]-proline zijn getest met vergelijkbare resultaten. Arginine-gegevens blijken het nut van dit protocol te benadrukken.
LET OP: Alle procedures met straling moeten achter het plexiglas schild worden uitgevoerd met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). - Incubeer zowel het experimentele als het gekookte controlebot afzonderlijk in KRH met 4 μCi / ml L-[2,3,4-3 H]-Arginine gedurende maximaal 90 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: Het is belangrijk om empirisch de incubatietijden voor verschillende aandoeningen te bepalen, waaronder de leeftijd van de muizen, verschillende skeletelementen en de soorten radioactief gelabelde aminozuren door een tijdsverloop uit te voeren. Verzadiging treedt meestal op na ongeveer 3-4 uur. De opname moet worden geëvalueerd op een tijdstip in de lineaire woede van opname. - Verwijder het radioactieve medium en gooi het weg in de container met vloeibaar radioactief afval. Was humeri drie keer met ijskoude 1 ml KRH om de reactie te beëindigen. Gooi alle wasbeurten weg in de container met vloeibaar radioactief afval.
- Breng elk bot over in een buis van 1,5 ml. Voeg 500 μL RIPA-buffer toe [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (w/v); 0,1% SDS (w/v)]. Gooi de kweekplaten, serologische pipetten en pipetpunten weg in een container met radioactief vast afval.
- Homogeniseer de humeri door 100 keer met een schaar in een RIPA-buffer te hakken.
- Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) het resulterende gehomogeniseerde bot gedurende 10 s.
OPMERKING: Sonicatie is ook bekend om aerosolen te produceren. Sonicatiestappen kunnen worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. Om aerosolvorming te verminderen, is het belangrijk om de buizen niet te overvullen. Sonicatie van kleine monstervolumes kan leiden tot onvolledige ultrasoonapparaat of monsterverlies als gevolg van schuimvorming. Als er schuimvorming optreedt, centrifugeer het monster gedurende 5 minuten om te bezinken. - Verduidelijk het lysaat door centrifugeren gedurende 10 minuten bij > 10.000 x g bij kamertemperatuur. Breng 200 μL van het supernatant over naar scintillatieflacons die 8 ml van de scintillatieoplossing bevatten. Meng door de scintillatieflacons krachtig te schudden. Gooi al het vaste radioactieve afval (bijv. gebruikte buizen, pipetpunten, platen, enz.) weg in de container met vast radioactief afval.
- Lees radioactiviteit (cpm) met behulp van de scintillatieteller. Gooi gebruikte scintillatieflacons weg in de container met radioactief afval die is bestemd voor scintillatieflacons.
- Trek de cpm van gekookt bot (basale waarde) af van de cpm van experimenteel bot. Normaliseer de radioactiviteit met botgewicht uit stap 2.3.
- Spuit de celkweekkap, instrumenten en bank in met radioactiviteitsontsmettingsmiddel. Voer veegtests uit om te bevestigen dat het werkgebied stralingsvrij is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Aminozuurtransport wordt gereguleerd door veel membraangebonden aminozuurtransporters die zijn gecategoriseerd in verschillende transportsystemen op basis van tal van kenmerken, waaronder substraatspecificiteit, kinetiek, evenals ion- en pH-afhankelijkheid25. De opname van glutamine kan bijvoorbeeld worden gemedieerd door de Na+-afhankelijke transportsystemen A, ASC, γ+L en N of het Na+-onafhankelijke Systeem L. De Na+-afhankelijke systemen onderscheiden zich door ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hierin beschreven protocol biedt een snelle en gevoelige benadering om de opname van aminozuren te evalueren als reactie op verschillende experimentele permutaties, hetzij in vitro of ex vivo. In vergelijking met in de handel verkrijgbare kits (bijv. Glutamine en Glutamaat Determination Kit), is deze methode veel gevoeliger, sneller en minder arbeidsintensief 16,17,25. In ons protocol evalueren we de opname...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen.
Dankbetuigingen
Het Karner-lab wordt ondersteund door R01-subsidies van het National Institute of Health (AR076325 en AR071967) aan C.M.K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillatieteller | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose oplossing | Sigma | G8769 | |
| Dissectiegereedschap | Forceps, schaar, scalpels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Vloeibare scintillatie flesjes | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride oplossing, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifugebuis, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Kaliumchloride | Sigma | P3911 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma | S6014 | |
| Natriumchloride | Sigma | S9888 | |
| Natriumdeoxycholaat | Sigma | D6750 | |
| Natriumdodecylsulfaat | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillatie oplossing) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobuteenzuur | Sigma | M2383 |
Referenties
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457(2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
