Dit protocol presenteert een radioactief gelabelde aminozuuropnametest, die nuttig is voor het evalueren van aminozuurconsumptie in primaire cellen of in geïsoleerde botten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van aminozuurconsumptie in gekweekte botcellen en geïsoleerde botschachten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Botontwikkeling en homeostase is afhankelijk van de differentiatie en activiteit van botvormende osteoblasten. Osteoblastdifferentiatie wordt sequentieel gekenmerkt door proliferatie gevolgd door eiwitsynthese en uiteindelijk botmatrixsecretie. Proliferatie en eiwitsynthese vereisen een constante toevoer van aminozuren. Desondanks is er zeer weinig bekend over aminozuurconsumptie bij osteoblasten. Hier beschrijven we een zeer gevoelig protocol dat is ontworpen om aminozuurconsumptie te meten met behulp van radioactief gelabelde aminozuren. Deze methode is geoptimaliseerd om veranderingen in aminozuuropname te kwantificeren die geassocieerd zijn met osteoblastproliferatie of -differentiatie, medicijn- of groeifactorbehandelingen of verschillende genetische manipulaties. Belangrijk is dat deze methode door elkaar kan worden gebruikt om aminozuurconsumptie in gekweekte cellijnen of primaire cellen in vitro of in geïsoleerde botschachten ex vivo te kwantificeren. Ten slotte kan onze methode eenvoudig worden aangepast om het transport van een van de aminozuren te meten, evenals glucose en andere radioactief gelabelde voedingsstoffen.
Inleiding
Aminozuren zijn organische verbindingen die een amino (-NH2) en carboxyl (-COOH) functionele groepen bevatten met een variabele zijketen die specifiek is voor elk aminozuur. Over het algemeen staan aminozuren bekend als het basisbestanddeel van eiwitten. Meer recent zijn nieuwe toepassingen en functies van aminozuren opgehelderd. Individuele aminozuren kunnen bijvoorbeeld worden gemetaboliseerd om intermediaire metabolieten te genereren die bijdragen aan bio-energetica, functioneren als enzymatische cofactoren, reactieve zuurstofsoorten reguleren of worden gebruikt om andere aminozuren te synthetiseren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muisprocedures die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Animal Studies Committees van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas in Dallas. Het stralingsprotocol werd goedgekeurd door de Radiation Safety Advisory Committee van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas in Dallas.
1. Aminozuuropname in cellen (Protocol I)
- Plaat 5 x 104 ST2 cellen in elk putje van een 12-well weefselkweekplaat. Plaatcellen in α-MEM met 10% FBS, 100 U/ml penicilline en 0,1 μg/ml streptomycine (pen/streptop). Plaat extra putten van cellen om het celnummer per voorwaar....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Aminozuurtransport wordt gereguleerd door veel membraangebonden aminozuurtransporters die zijn gecategoriseerd in verschillende transportsystemen op basis van tal van kenmerken, waaronder substraatspecificiteit, kinetiek, evenals ion- en pH-afhankelijkheid25. De opname van glutamine kan bijvoorbeeld worden gemedieerd door de Na+-afhankelijke transportsystemen A, ASC, γ+L en N of het Na+-onafhankelijke Systeem L. De Na+-afhankelijke systemen onderscheiden zich door .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hierin beschreven protocol biedt een snelle en gevoelige benadering om de opname van aminozuren te evalueren als reactie op verschillende experimentele permutaties, hetzij in vitro of ex vivo. In vergelijking met in de handel verkrijgbare kits (bijv. Glutamine en Glutamaat Determination Kit), is deze methode veel gevoeliger, sneller en minder arbeidsintensief 16,17,25. In ons protocol evalueren we de opname.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen.
Dankbetuigingen
Het Karner-lab wordt ondersteund door R01-subsidies van het National Institute of Health (AR076325 en AR071967) aan C.M.K.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillatieteller | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose oplossing | Sigma | G8769 | |
| Dissectiegereedschap | Forceps, schaar, scalpels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Vloeibare scintillatie flesjes | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride oplossing, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifugebuis, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Kaliumchloride | Sigma | P3911 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma | S6014 | |
| Natriumchloride | Sigma | S9888 | |
| Natriumdeoxycholaat | Sigma | D6750 | |
| Natriumdodecylsulfaat | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillatie oplossing) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobuteenzuur | Sigma | M2383 |
Referenties
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
