De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1385/1-59745-377-3:39">Springer Protocols</a> .

De auteurs hebben niets te onthullen.

pyrosequencing: een eenvoudige methode voor nauwkeurige genotyping

Farmacogenetische onderzoek voordelen eerste hand van de overvloed aan informatie die door de voltooiing van het Human Genome Project. Met zo&#39;n enorme hoeveelheid gegevens die beschikbaar komt een explosie van genotypering methoden. Pyrosequencing (R) is een van de meest grondige toch eenvoudige methoden tot op heden gebruikt om de polymorfismen te analyseren. Het heeft ook de mogelijkheid om tri-allelische, indels, korte-repeat polymorfismen, te identificeren, samen met het bepalen van allel percentages voor de methylering of samengevoegd monster beoordeling. Daarnaast is er een gestandaardiseerde controle volgorde die interne kwaliteitscontrole biedt. Deze methode heeft geleid tot een snelle en efficiënte single-nucleotide polymorfisme evaluatie met inbegrip van vele klinisch relevante polymorfismen. De techniek en de methodologie van Pyrosequencing wordt uitgelegd.

Pyrosequencing (R) is een van de meest grondige toch eenvoudige methoden tot op heden gebruikt om de polymorfismen te analyseren. Deze methode heeft geleid tot een snelle en efficiënte single-nucleotide polymorfisme evaluatie met inbegrip van vele klinisch relevante polymorfismen. De techniek en de methodologie van Pyrosequencing wordt uitgelegd.

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Geneticaonderzoek heeft enorm geprofiteerd van de publicatie van de menselijke genoomsequentie. Pyro sequencing is een uniek systeem dat de analyse van genetische variatie mogelijk maakt, evenals RNA Allelische onbalans, DNA, methyleringsstatus en genkopienummer. In deze video demonstreren we een basis pyro sequencing reactie voor genetische analyse.Hallo, ik ben Kristy King van het laboratorium van Dr.Charles Eby en Dr.Brian Gage in de afdeling Interne Geneeskunde van de Washington University School of Medicine. Vandaag laten we u een procedure voor pyro sequencing zien. Deze procedure is nuttig omdat het een van de meest grondige en eenvoudige methoden is die worden gebruikt om SNPs te analyseren.Pyro sequencing is gebaseerd op sequencing door synthese, waarbij gebruik wordt gemaakt van de afgifte van pyrofosfaat wanneer een nucleotide wordt opgenomen in een open drie prime DNA-streng. Zodra een plaat is geladen, worden nucleotiden opgenomen op basis van een sequentie die wordt geleverd door de software. Zodra het pyrofosfaat is vrijgegeven, wordt het gebruikt in een reactie die resulteert in de afgifte van een TP, die wordt gebruikt door luciferase om Lucifer om te zetten in oxy Lucifer, wat resulteert in de emissie van licht. Het toegelaten licht wordt verzameld door een CCD-camera en geregistreerd als pieken, ook wel pyro's genoemd.Alle nucleotiden die niet in de DNA-streng zijn opgenomen, worden afgebroken door AP pyra om achtergrondruis te voorkomen. Deze procedure omvat de volgende stappen. Assayontwerp, PCR-gelelektroforese voor kwaliteitscontrole en pyro sequencing.Dus laten we beginnen met pyro sequencing. Om pyro sequencing uit te voeren, moet eerst een PCR-product worden voorbereid. PCR voor pyro sequencing vereist meer cycli dan de meeste PCR's om ervoor te zorgen dat alle primer ruwweg 50 cycli wordt opgebruikt.Pyro sequencing vereist ook dat een van de PCR-primers gebiotinyleerd is. Ten slotte is het belangrijk op te merken dat een intern primer ook vereist is. Efficiënt assayontwerp kan worden uitgevoerd met software die wordt geleverd door pyro sequencing om ervoor te zorgen dat er geen besmetting aanwezig is.En om te bevestigen dat het PCR-product aanwezig is, moet een gel worden uitgevoerd op een paar monsters evenals een negatieve controle. Om de pyro sequencing plaat toe te voegen, moet 12 microliter van de pyro sequencing primer mix worden toegevoegd aan de 96-wel pyro sequencing plaat. Dit vereist een mengsel van 43,2 microliter van de interne primer, samen met 1396,8 microliter van een knielingsbuffer. Dek de pyro sequencing plaat af met kleeffolie.Als de instelling langer duurt dan 50 minuten voor elk van de 96-wel PCR-product, moet 70 microliter SRO speed mix worden toegevoegd dat 240 microliter streptavidine gecoate sero speeds bevat. 4, 560 microliter van bindbuffer, die is gemaakt van triss natriumchloride, EDTA en tween 20 en 3, 600 microliter van water en vervang het deksel stevig. Plaats de 96-wel PCR-productplaat met de bead mix in een plaatshaker gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.Zorg ervoor dat het deksel is beveiligd om kruisbesmetting tussen de putjes te voorkomen. Deze stap zorgt voor een grondige knieling van de strep ENC, gecoate spheros beads naar de biotin tag die zich op de PCR primer bevindt. Zet een werkstation op voor het voorbereiden van de platen.Dat omvat de reagentenbakken, PCR-product en bead mix lade en de pyro sequencing primer lade. Zorg ervoor dat de PCR-product en bead mix plaat evenals de pyro sequencing primer lade goed zijn uitgelijnd, zodat de negatieven in dezelfde oriëntatie zijn. Voordat u monsters overbrengt, schudt u het vacuümgereedschap, dat is uitgeschakeld in schoon water om eventuele korrels of puin dat erop kan zitten los te maken.Gooi het resterende water weg, vul de bak opnieuw en zet het vacuüm aan. Laat het vacuümgereedschap in de bak totdat al het water is verwijderd, wat ongeveer 30 seconden is. Plaats de filtertips van het vacuümgereedschap in de putjes van de PCR bead mix plaat en laat het erin blijven totdat al het vocht uit de plaat is verwijderd.Zacht schudden kan worden gebruikt om oppervlaktespanning te voorkomen. Plaats het vacuüm in de 70% ethanol bak wanneer het vocht door de buis begint te stromen. Laat de filtertips vijf seconden het ethanol opsluipen.Herhaal dit voor de 0,2 molare natriumhydroxide, die het DNA denatureert naar enkelstrengs PCR en voor de wasbuffer. Om het PCR-product te reinigen en te neutraliseren. Ontkoppel de vacuümslang van het vacuümgereedschap en plaats het vacuümgereedschap in de pyro sequencing plaat die het pyro sequencing primer in een knielings buffer mix bevat.Als de vacuümslang nog steeds is verbonden, wanneer deze in de pyro sequencing plaat wordt geplaatst, zal het primer mix doorgezogen worden. De tips veroorzaken dat u uw PCR-product verliest. Schud voorzichtig of schud de tips van het vacuüm in de putjes van de pyro sequencing plaat om uw PCR-product te verspreiden.Verwijder het vacuümgereedschap uit de pyro sequencing plaat zodra het schudden of schommelen voltooid is en sluit het vacuümgereedschap opnieuw aan op de slang en plaats het gereedschap in het schone water om het te reinigen voor de volgende plaat. Plaats de pyro sequencing plaat op een warmteblok gedurende twee minuten bij 80 graden Celsius. Verwijder de plaat na twee minuten uit de warmteblok en plaats deze op een koele ondergrond.Zodra het is afgekoeld, kan kleeffolie worden gebruikt om de plaat te bedekken, tenzij de plaat binnen 15 minuten wordt gebruikt om verdamping te voorkomen. En nu is het tijd om met pyro sequencing te beginnen. De eerste stap van pyro sequencing is het invoeren van de assaygegevens in de computer.Onder eenvoudige invoer, selecteert u de nieuwe invoer en voert u assayinformatie in, inclusief een ID-naam en de sequentie om te analyseren, die wordt geleverd door de assayontwerpsoftware en toelaat voor kwaliteitscontrole. Selecteer de dispensorvolgorde, die de sequentie rond de SNP plus controlebasen biedt. Selecteer ten slotte histogrammen om een visuele weergave te geven van hoe uw pigram eruit zou moeten zien. Nu is het tijd om een snip run in te voeren.Onder de snip runs en het algemene tabblad, voert u een runnaam in en selecteert u instrumentparameters voor de run.

pyrosequencing-a-simple-method-for-accurate-genotyping

Research

JoVE Journal

Biology

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Washington University in St. Louis.   Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

In This Article

Summary

Abstract

Protocol

Disclosures

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles