Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen

5.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63000

⸱

26 oktober 2021

 , 
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In dit artikel

Samenvatting

Het beoordelen van oxidatieve fosforylering met behulp van respirometers met hoge resolutie is een integraal onderdeel geworden van de functionele analyse van mitochondriën en cellulair energiemetabolisme. Hier presenteren we protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme met behulp van kamer- en microplaatgebaseerde respirometers met hoge resolutie en bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat.

Samenvatting

Hoge resolutie respirometrie (HRR) maakt het mogelijk om oxidatieve fosforylering in realtime te monitoren voor analyse van individuele cellulaire energietoestanden en beoordeling van ademhalingscomplexen met behulp van gediversifieerde substrate-uncoupler-inhibitor titratie (SUIT) protocollen. Hier wordt het gebruik van twee respirometrie-apparaten met hoge resolutie gedemonstreerd en wordt een basisverzameling protocollen gepresenteerd die van toepassing zijn op de analyse van gekweekte cellen, skelet- en hartspiervezels en zachte weefsels zoals de hersenen en de lever. Protocollen voor gekweekte cellen en weefsels zijn voorzien voor een kamergebaseerde respirometer en gekweekte cellen voor een op microplaten gebaseerde respirometer, beide met standaard ademhalingsprotocollen. Voor vergelijkende doeleinden worden CRISPR-gemanipuleerde HEK293-cellen met een tekort aan mitochondriale translatie die meerdere deficiënties van het ademhalingssysteem veroorzaken, met beide apparaten gebruikt om cellulaire defecten in de ademhaling aan te tonen. Beide respirometers maken een uitgebreide meting van cellulaire ademhaling mogelijk met hun respectieve technische verdiensten en geschiktheid, afhankelijk van de onderzoeksvraag en het model dat wordt bestudeerd.

Inleiding

Mitochondriën vervullen de belangrijkste energievoorziening en zijn een gecompartimenteerd organel dat bijdraagt aan essentiële cellulaire bio-energetische en metabole processen zoals anabolisme van nucleotiden, lipiden en aminozuren, ijzer-zwavelclusterbiogenese en zijn betrokken bij signalering zoals gecontroleerde celdood 1,2,3 . Mitochondriale bio-energetica door oxidatieve fosforylering draagt bij aan bijna alle cellulaire processen in de cel, en bijgevolg worden mitochondriale disfuncties van primaire of secundaire oorsprong geassocieerd met een breed spectrum van ziekteomstandigheden 4,5. Mitochondriale disfunctie omvat niet alleen veranderingen in structuur of mitochondriale dichtheid, maar ook in de kwaliteit en regulatie van het ademhalingssysteem6. Dit kwalitatieve element omvat substraatcontrole, koppelingskarakteristieken, posttranslationele modificaties, cristaedynamica en respiratoire supercomplexen 7,8. Daarom is een nauwkeurige analyse van mitochondriale bio-energetica voor experimentele en diagnostische benaderingen om het energiemetabolisme van de cel te beoordelen belangrijk voor gezondheid en ziekte.

Mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) is een opeenvolging van reacties binnen het ademhalingssysteem of elektronenoverdrachtsysteem (ETS) voor de opwekking van cellulaire energie via adenosinetrifosfaat (ATP)9. De multi-enzymatische stap om energie uit elektronenstroom door complexen I en II naar complex IV te benutten, genereert een elektrochemische protongradiënt over het binnenste mitochondriale membraan, vervolgens gebruikt voor fosforylering van adenosinedifosfaat (ADP) naar ATP via complex V (F1FO ATP-synthase) (figuur 1A).

Ten eerste worden twee-elektronendragers gegenereerd tijdens de tricarbonzuurcyclus (TCA), glycolyse en pyruvaatoxidatie: nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en dihydroflavine adenine dinucleotide (FADH2). NADH wordt geoxideerd bij complex I (NADH-dehydrogenase), waarbij twee elektronen worden overgebracht naar co-enzym Q (chinon wordt gereduceerd tot quinol), terwijl protonen in de intermembraanruimte (IMS) worden gepompt. Ten tweede oxideert complex II (Succinaatdehydrogenase) FADH2 en voedt de elektronen naar co-enzym Q zonder protonen te pompen. Ten derde worden bij complex III (Cytochroom c oxidoreductase) elektronen uit co-enzym Q overgebracht naar cytochroom c, terwijl protonen in het IMS worden gepompt. Ten vierde brengt cytochroom c de elektronen over naar complex IV (Cytochroom c-oxidase), het laatste complex om protonen te pompen, en waar zuurstof functioneert als een elektronenacceptor om protonen te assimileren en uiteindelijk water te vormen. Het is deze zuurstof die mitochondriën verbruiken die kan worden gemeten door een oxygraaf. Ten slotte worden de protonen gegenereerd uit complex I, complex III en complex IV gebruikt om complex V te roteren, waardoor ATP 9 wordtgegenereerd.

Belangrijk is dat elektronenoverdracht niet alleen op een lineaire manier plaatsvindt, anders aangeduid als de elektronentransportketen. In plaats daarvan kunnen elektronen via meerdere ademhalingswegen naar de co-enzym Q-pool worden overgebracht en convergente elektronenstroom vergemakkelijken. NADH-substraten en succinaat kunnen bijvoorbeeld binnenkomen via respectievelijk complex I en complex II. Elektronen uit vetzuuroxidatie kunnen worden gedoneerd via het elektronoverdrachtsflavoproteïnecomplex. Een uitgebreide analyse van OXPHOS vereist inderdaad een holistische benadering met geschikte brandstofsubstraten (figuur 1A).

figure-introduction-1
Figuur 1: Mitochondriale oxidatieve fosforylering en specifieke substraat- en inhibitorprotocollen. (A) Mitochondrion en schema van het elektronenoverdrachtssysteem (CI-CIV) en mitochondriaal F1F0 ATP-synthase (CV). Alle structuren zijn afkomstig van PDB. De cijfers tonen alleen substraten en remmers die in dit onderzoek worden beschreven). (B) Monsterspoor van zuurstofflux in intacte HEK293-cellen met behulp van het standaardprotocol in een mHRR-apparaat. (C) Monsterspoor van zuurstofflux in intacte HEK293-cellen met behulp van een standaardprotocol in een cHRR-apparaat. (D) Monsterspoor van zuurstofflux in gepermeabiliseerde menselijke fibroblasten van een gezonde donor met het respectieve SUIT-protocol. Afkortingen: 1 = Routinematige ademhaling van intacte cellen; 2 = toestand 2; 3 = toestand 3(I); 4 = Toestand 3(I) met cytC; 5 = toestand 3 (I+II); 6 = Lek(OM); 7 = ETS-capaciteit; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenon, AM = Antimycine, ATP = Adenosinetrifosfaat, Az = Azide, OM = Oligomycine, FCCP = Carbonylcyanide p-trifluoro-methoxyfenyl-hydrazone; Asc = Ascorbaat, TMPD = N,N,N′,N′-tetramethyl-p-fenyleendiamine, Succ = Succinaat, M = Malaat, P = Pyruvaat, ADP = Adenosinedifosfaat, NAD = Nicotinamide adenine dinucleotide, IMS = Intermembrane ruimte, FAD = Flavin adenine dinucleotide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van mitochondriale OXPHOS-capaciteit met behulp van HRR is een instrumentele biochemische methode van diagnostische waarde geworden, niet alleen voor primaire mitochondriale defecten10,11, maar ook uitbreidend naar alle andere gebieden van de biologie, zoals kanker en veroudering12. HRR maakt de bepaling van cellulaire ademhaling mogelijk door de analyse van mitochondriale OXPHOS-capaciteit, die direct individuele of gecombineerde mitochondriale respiratoire complexe deficiëntie weerspiegelt, en indirect geassocieerd is met cellulaire disfunctie en veranderd energiemetabolisme9. Methodologisch worden ademhalingsmetingen uitgevoerd met behulp van cellen, weefsel of geïsoleerde mitochondriën 11,13,14, met bevroren materiaal dat slechts gedeeltelijk geschikt is 15,16. Bevroren weefsel blijkt een intact ETS te hebben met behoud van supercomplexe stabiliteit15. In tegenstelling tot traditionele TCA-tussenproducten worden de respectieve substraten dus rechtstreeks in het ETS ingevoerd. De koppeling tussen de ETS- en ATP-synthese gaat echter verloren omdat de membraanintegriteit wordt aangetast door bevriezingsschade (ijskristalvorming).

Ademhalingsexperimenten vinden normaal gesproken plaats bij een fysiologische temperatuur van 37 °C voor endothermen in niet-permeabiliseerde of permeabiliseerde cellen of weefsel. Terwijl de eerste de cytosolische metabole context beschouwt, levert de laatste de energetische bijdrage van individuele OXPHOS-complexen en de ATPase door de toevoeging van specifieke substraten (en remmers). De sequentie en variatie van substraten en remmers hebben geleid tot de ontwikkeling van een breed scala aan SUIT-protocollen17 en assays18 om verschillende wetenschappelijke vragen over de OXPHOS-functie aan te pakken (beoordeeld onder12). Het basisprotocol van cellulaire ademhaling beoordeelt vier verschillende toestanden: i) routinematige ademhaling - de ademhaling in een respectievelijk ademhalingsmedium zonder toevoeging van substraten of remmers die maar endogene substraten consumeren. Deze toestand kan algemene OXPHOS of secundair geïnduceerde ademhalingsdefecten onthullen die bijvoorbeeld worden veroorzaakt door veranderde metabolietprofielen. Vervolgens onthult de toevoeging van de ATPase-remmer oligomycine de permeabiliteit van het binnenste mitochondriale membraan voor protonen, gedefinieerd als ii) lekademhaling. Daaropvolgende titratie van een protonofoor zoals de ontkoppelaar carbonylcyanide p-trifluor-methoxyfenyl-hydrazone (FCCP) maakt het mogelijk om de toestand te bepalen waarin de ETS-capaciteit maximaal is in een open-transmembraan protoncircuitmodus, gedefinieerd als iii) ontkoppelde ademhaling. Belangrijk is dat een ontkoppelde toestand ook kan optreden door experimentele interventies door overmatige mechanische schade aan de mitochondriale membranen. Omgekeerd verwijst de niet-gekoppelde toestand naar respiratoire ontkoppeling door een intrinsiek mechanisme dat fysiologisch wordt gecontroleerd. Ten slotte bepaalt volledige remming van het ETS door toevoeging van de complexe III-remmer antimycine en complexe I-remmer rotenon het resterende zuurstofverbruik (ROX) van niet-mitochondriale zuurstofverbruikende processen (figuur 1A-C).

Mitochondriale bio-energetica bestaat uit vijf verschillende ademhalingstoestanden19,20. Toestand 1 ademhaling is zonder extra substraten of ADP, behalve wat endogeen beschikbaar is. Na de toevoeging van ADP, maar nog steeds geen substraten, wordt toestand 2 ademhaling bereikt. Wanneer substraten worden toegevoegd, waardoor elektronenoverdracht en ATP-synthese mogelijk zijn, wordt toestand 3-ademhaling bereikt. In deze toestand kan OXPHOS-capaciteit worden gedefinieerd bij verzadigde concentraties van ADP, anorganisch fosfaat, zuurstof, NADH- en succinaatgebonden substraten. Toestand 4 ademhaling of LEAK ademhaling kan worden gedefinieerd als een toestand zonder ADP of chemisch geremde ATP-synthasen met voldoende substraten. Ten slotte, wanneer alle zuurstof is uitgeput (anoxisch) in een gesloten kamer, wordt toestand 5 ademhaling waargenomen.

Er bestaan verschillende methoden om cellulaireenergietoestanden 14 te beoordelen met twee apparaten die de huidige real-time beoordeling van OXPHOS domineren door analyse van het zuurstofverbruik, gemeten als de functie van de afname van zuurstof in de loop van de tijd in een gesloten kamersysteem met verschillende toepasbaarheid afhankelijk van het experimentele model en de onderzoeksvraag: de Oroboros 2k hoge resolutie respirometer en de Seahorse XF extracellulaire flux analyzer. Beide apparaten registreren het zuurstofverbruik als een afname van picomol (pmol) van zuurstof (O2) per seconde als een absolute waarde in de kamer of microplaatput. Het specifieke zuurstofverbruik per massa wordt verkregen door het respectieve zuurstofverbruik te normaliseren in een specifiek bufferrecept per aantal cellen (miljoenen), weefselgewicht (mg) of eiwithoeveelheid.

De O2k (Oroboros Instruments) is een gesloten tweekamersysteem uitgerust met een polarografische zuurstofsensor (afgekort als kamergebaseerde hoge resolutie respirometer: cHRR). Elke experimentele kamer bevat 2 ml vloeistof die homogeen wordt gehouden door magnetische roerders. De polarografische zuurstofsensor maakt gebruik van een amperometrische benadering om de zuurstof te meten: het bevat een gouden kathode, een zilver / zilverchloride-anode en tussendoor een KCI-oplossing die een elektrochemische cel creëert waarop een spanning (0,8 V) wordt toegepast. Zuurstof uit het testmedium diffundeert door een gefluoreerd ethyleenpropyleenmembraan van 25 μm (O 2-permeabel) en ondergaat reductie aan de kathode, waardoor waterstofperoxide wordt geproduceerd. Aan de anode wordt zilver geoxideerd door waterstofperoxide, waardoor een elektrische stroom wordt gegenereerd. Deze elektrische stroom (ampère) is lineair gerelateerd aan de partiële zuurstofdruk. De partiële druk van zuurstof en de zuurstofoplosbaarheidsfactor van het testmedium worden gebruikt om de zuurstofconcentratie te berekenen. Aangezien de partiële zuurstofdruk afhankelijk is van de experimentele temperatuur en polarografische metingen temperatuurgevoelig zijn, moeten temperatuurschommelingen nauwkeurig (±0,002 °C) worden geregeld door een Peltier-verwarmingsblok. De temperatuur kan worden geregeld binnen een bereik van 4 °C en 47 °C.

De Seahorse XF extracellulaire flux analyzer (Agilent) is een op platen gebaseerd systeem met 24- of 96-well microplaatformaat waarin drie fluorescentie-elektroden het zuurstofverbruik in de loop van de tijd in elke put meten (afgekort als microplaatgebaseerde hoge resolutie respirometer: mHRR). Er zijn maximaal vier poorten in de testcartridge beschikbaar voor geautomatiseerde injectie tijdens de test. Een test bevat meerdere cycli, elk met drie fasen: 1) mengen, 2) wachten en 3) meten. Tijdens de meetfase worden sensorsondes in de microplaat neergelaten, waardoor een tijdelijk gesloten kamer ontstaat met een volume van 7-10 μL om het uitgestraalde licht te meten. Dit licht wordt uitgezonden door polymeer-ingebedde fluoroforen op de punt van de sensorsondes, die O2 detecteren op basis van fosforescentie-doven. De intensiteit van het fluorescentiesignaal is evenredig met O2 en wordt beïnvloed door de temperatuur van de sensor en het testmedium. Daarom vereist nauwkeurige zuurstofschatting een relatieve benadering met een achtergrondput zonder monster. Het herstellen van de zuurstofconcentratie vindt plaats tijdens de mengfase wanneer de sensor op en neer beweegt om het volume boven de tijdelijke kamer te mengen. Elke cyclus berekent één zuurstofverbruik. De temperatuur kan worden geregeld binnen een bereik van 16 °C en 42 °C.

HRR is de gouden standaard om cellulaire bio-energetica te beoordelen bij primaire en mitochondriën-geassocieerde ziekten en algemeen cellulair metabolisme. In deze studie worden basisprotocollen voor HRR gegeven om de OXPHOS-functie in cellen en weefsels te beoordelen.

figure-introduction-2
Figuur 2: Workflow voor cel- en weefselpreparaten voor cHRR en celvoorbereiding voor mHRR-respirometrie. (A) Overzicht van verstrekte protocollen. (B) Zoogdiercellen (stap 1.2): HEK293-pellet gelijk aan 3 x 106 cellen (linkerpaneel). Niet-vezelig weefsel (stap 1.3): Bereiding van murine cerebellum lysaat in 2 ml teflon potter (middenpaneel). Saponine-geïnduceerde skeletspierpermeabilisatie (stap 1.4) rechterpaneel) voor cHRR-respirometrie. (C) Standaard lay-out voor het zaaien van microplaten (stap 2.4) en de samenvloeiingscontrole voor de analyse van eukaryote cellen (HEK293) voor mHRR-respirometrie. (D, E) Schema van injectiepoortbelasting voor mHRR-respirometrie (stap 2.4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de National Animal Experiment Review Board en het Regional State Administrative Agency for Southern Finland. Mannelijke C57BL/6JOlaHsd muizen (4-6 maanden oud) werden gebruikt in deze studie. Toestemming voor het gebruik van menselijke cellijnen werd verkregen van de institutionele ethische commissie van de Universiteit van Helsinki.

1. Hoge resolutie respirometrie: Kamer-gebaseerde respirometer (cHRR)

OPMERKING: De experimenten in dit gedeelte van het protocol werden uitgevoerd met behulp van de Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabel van Materialen)

  1. Kalibratie van zuurstofsensoren
    1. Voer respirometers vooraf uit bij 37 °C in 2,1 ml mitochondriaal ademhalingsmedium (MiR05, tabel 1, oplosbaarheidsfactor: 0,92) gedurende >45 min en voer zuurstofkalibratie uit zoals beschreven21. Ga verder als de basislijnvariatie binnen ± 4 pmol/s ligt.
      OPMERKING: Grote fluctuaties in het achtergrondsignaal kunnen wijzen op vereist onderhoud van het sensormembraan of sporen van remmers die in de kamer achterblijven van eerdere experimenten. Een instrumentele correctie van de zuurstofflux op de achtergrond wordt aanbevolen voorafgaand aan een reeks experimenten25.
    2. Noteer zuurstofkalibratiewaarden om de prestaties van het sensormembraan in de loop van de tijd te controleren.
      OPMERKING: Dit onthult de sensorfunctie, signaal-ruisstabiliteit en wanneer sensormembraanonderhoud vereist is. Afhankelijk van de omgevingsdruk wordt tussen de 180-200 μmol zuurstof opgelost in MiR05.
    3. Verwijder alle vloeistof in de kamer voordat een monster in het ademhalingsmedium wordt toegevoegd.
      OPMERKING: Evalueer het volume van de ademhalingskamers om regelmatig precies 2 ml te zijn.
  2. Voorbereiding van cellen voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Kweek HEK293 cellen in 10 cm2 diameter schotels in Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) met hoge glucose aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), GlutaMax, Niet-essentiële aminozuren en Na-Pyruvaat22 en uridine23 ter ondersteuning van OXPHOS-defect metabolisme in een incubator bij 37 °C bij 5% CO2.
      OPMERKING: Elk type eukaryote cel kan worden gekweekt. Voor de meeste celtypen leidt het kweken van een schaal van 10 cm2 tot voldoende cellen (meestal >3 x 106 cellen). Controleer routinematig op mycoplasma-infectie om effecten op het cellulaire metabolisme en de ademhaling te voorkomen.
    2. Kweek cellen zonder 90% confluentie te overschrijden (figuur 2C).
      OPMERKING: Cellen met >90% confluency kunnen groeiafhankelijke remmende effecten op de ademhaling vertonen (indien niet gesynchroniseerd of post-mitotisch).
    3. Was de cellen met 1x PBS, maak ze los met 1 ml warm 0,25% trypsine, deactiveer trypsine door warme DMEM (5 ml/10 cm2 plaat) toe te voegen en tel de cellen met een hemocytometer.
    4. Centrifugeer de celoplossing voorzichtig gelijk aan 2,5 x 106 cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant volledig en resuspensieer in 2,5 ml warme MiR05 (1 x 106 cellen / ml) (figuur 2A).
    5. Voor suspensiecellen, tel en verwijder oplossing gelijk aan 2,5 x 106 cellen, pellet en ga verder zoals vermeld in stap 1.2.4.
    6. Voer het SUIT-protocol uit voor permeabilisatieoptimalisatie (stap 1.6), permeabiliseerde cellen of weefsels (stap 1.5) of intacte cellen (stap 1.7)
      OPMERKING: Voor consistente resultaten wordt aanbevolen om de celconcentratie constant te houden (bijv. 1 x 106 cellen / ml). Hoewel de ademhaling onafhankelijk is van de celdichtheid in de respirometer24, bevinden substraten en remmers zich in vergelijkbare concentraties tijdens experimenten als het aantal cellen constant wordt gehouden.
  3. Voorbereiding van niet-vezelig weefsel (bijv. Hersenen, lever) voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Snijd een homogeen stuk weefsel weg, 30-40 mg in gewicht, of gebruik het hele orgaan (muis cerebellum in dit geval).
      OPMERKING: Als weefsel niet onmiddellijk wordt gebruikt, houd dan 2 ml ijskoude MiR05 in waardoor conservering tot 2 uur voor de meeste weefsels mogelijk is. Individuele weefselopslagtijden moeten in tijdreeksen worden beoordeeld.
    2. Dep het zakje droog met een Whatman-filterpapier (let op: zacht weefselmateriaal heeft de neiging om te plakken).
    3. Doe het stukje van 30-40 mg in een ijsgekoelde 2 ml polytetrafluorethyleen potter Elvehjem homogenisator.
    4. Voeg een geschikte hoeveelheid MiR05 toe om 20 mg / ml te verkrijgen om de weefsel-bufferverhouding te behouden. Houd de totale hoeveelheid >1,5 ml en <2 ml om onvoldoende of overmatige vloeistof voor een geschikte mechanische permeabilisatie te voorkomen.
    5. Breng de stamper in, lyseer het weefsel langzaam door de stamper voorzichtig in te trekken en vermijd het genereren van een vacuüm dat overmatige weefselschade veroorzaakt.
    6. Voer in totaal 7 slagen uit (1x gedefinieerd als één op- en neergaande slag) totdat ze worden gelyseerd (zichtbaar als een troebele vloeistof zonder groot vuil) (figuur 2B).
      OPMERKING: Het aantal slagen voor geschikte lysis moet voor elk weefsel worden getest door de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan te beoordelen via cytochroom C-respons (stap 1.5.11). Hard-to-lyse bindweefsel of vaatdelen kunnen achterblijven.
    7. Decanteer het gelyseerde weefsel in een centrifugebuis van 15 ml.
    8. Was de binnenkant van de pottenbakker met een gelijke hoeveelheid MiR05 die wordt gebruikt in de lyseerstap (bijv. 1,5 ml) en voeg toe aan de buis van 15 ml die nu 3-4 ml MiR05 bevat bij 10 mg / ml weefsellysaat.
    9. Voeg 2 ml gewone MiR05 per kamer toe om op te warmen tot 37 °C.
    10. Draai de buis voor een gelijke verdeling voordat u 500 μL (gelijk aan 5 mg) van elk lysaat per kamer langzaam pipetteert om de spanning van koud tot 37 °C te minimaliseren.
    11. Wacht >3 minuten tot de inhoud van de kamer is opgewarmd tot 37 °C voordat u de kamer sluit. Verwijder overtollig vocht bovenop de stop (hoeveelheid per kamer na sluiting: 4 mg).
    12. Voer het SUIT-protocol uit voor standaard permeabilized (stap 1.5).
  4. Voorbereiding van vezelig weefsel (skeletspieren, hartspier) voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Extraheer het harde weefsel, verwijder het bindweefsel en vet uit de spieren met een scherpe tang in 2 ml ijskoude BIOPS (tabel 2) onder een dissectiemicroscoop.
    2. Scheid de vezelbundels (~ 4 mg) langs de lengteas met een scherpe tang. Plaag de vezels voldoende uit om een mesh-achtige structuur te verkrijgen (figuur 2B).
      OPMERKING: Een goede mechanische vezelscheiding en permeabilisatie wordt aangegeven door het verlies van het rode pigment myoglobine en verhoogde doorschijnendheid.
    3. Was en permeabiliseer de vezelbundel in saponine (50 μg/ml in BIOPS, vers bereid) gedurende 20 minuten bij 4 °C (vezels worden doorschijnend, wat duidt op volledige permeabilisatie, figuur 2B).
    4. Was de vezels twee keer in MiR05 gedurende 5 minuten per wasbeurt op 4 °C.
    5. Dep droog met filtreerpapier en weeg voordat u het toevoegt aan de kamer gevuld met 2,1 ml MiR05.
    6. Introduceer stoppers zonder volledig te sluiten, oxygeneer vervolgens de kamers met 2 ml pure O2 met behulp van een spuit van 20 ml en sluit de kamers door de stoppen in een roterende beweging te draaien. Houd de O2-concentratie tijdens het experiment tussen 300-500 μM om zuurstofdiffusiebeperking te voorkomen.
  5. Protocol voor het beoordelen van routinematige ademhaling in cellen of weefsels
    1. Voeg een monster toe aan de kamer zoals vermeld in stap 1.5.2-1.5.3.
    2. Voeg 2,3 ml warme MiR05-celsuspensie toe (standaardinvoer: 1 x 106 cellen / ml zoals in stap 1,2 of 2 mg weefsel / ml zoals in stap 1.3)
    3. Skelet- en hartspier (stap 1.4): Voeg ~4 mg saponine-permeabilized vezels toe aan voorgewarmde 2,3 ml warme MiR05 met inachtneming van stappen 1.4.4-1.4.6
    4. Draai kamers op 37 °C en een roersnelheid van 700 tpm. Wacht >3 minuten om media te laten ontgassen en sluit de kamers door de stop in een roterende beweging te draaien. Peltier blokstabilisatie geeft aan dat de ingestelde temperatuur wordt bereikt.
    5. (OPTIONEEL) Verander de roersnelheid naar 300 tpm om de resterende bubbels door het capillair van de stop te laten ontsnappen.
    6. Zuig overtollige vloeistof bovenop de stop. Wacht 10 minuten totdat een stabiel zuurstoffluxsignaal is bereikt met elk monstertype om routine/toestand 1 ademhaling te registreren, figuur 1B).
    7. Voor ademhalingsmetingen in gepermeabiliseerde cellen en weefsel, gaat u verder met stap 1.6. Voor intacte cellen met stap 1.8.
  6. Protocol voor OXPHOS-analyse in gepermeabiliseerde cellen of weefsels
    1. Gebruik gelyseerd (gepermeabiliseerd) weefselmonster of permeabiliseer cellen door 1 μL digitonine (8,1 mM digitoninevoorraad in dimethylsulfoxide (DMSO)) toe te voegen voor een uiteindelijke concentratie van 5 μg / ml om cellen te permeabiliseren. De flux zal dalen en zou moeten stabiliseren op >5 min.
      LET OP: Digitonine is acuut toxisch voor de luchtwegen, in contact met de huid, of wanneer het wordt ingeslikt.
      OPMERKING: Injectie van alle chemicaliën wordt uitgevoerd met precisieglasspuiten. Gebruik spuiten alleen voor aangegeven chemicaliën om kruisbesmetting te voorkomen en was grondig in water en EtOH na gebruik. Geblokkeerde spuiten kunnen ultrasone trillingen vereisen in warme ddH2O of een reinigingsdraad om chemische verstoppingen los te maken. Trek altijd een overschot van de betreffende voorraadoplossing in de spuit om te voorkomen dat er lucht in de kamers wordt gebracht. Inspecteer de binnenkant van de kamers voor het inbrengen van lucht na elke injectie. Noteer elke stap totdat de flux plateaus bereikt.
    2. Voeg snel achter elkaar toe: 5 μL 0,4 M malaat (M) voor een eindconcentratie van 1 mM, 5 μL 2,0 M pyruvaat (P; vers bereid), voor een eindconcentratie van 5 mM, 4 μL van 2,5 M glutamaat (G) voor een eindconcentratie van 5 mM.
    3. Voeg na een eerder fluxplateau 5 μL (10 μL voor spierweefsel) van 0,5 M adenosinedifosfaat (ADP, aliquots bewaard bij -80 °C) toe voor een eindconcentratie van 1,25 mM.
      OPMERKING: Weefsel zoals spieren kunnen een andere concentratie nodig hebben om verzadiging te bereiken.
    4. Voeg 5 μL 4 mM cytochroom C (cytC) toe voor een eindconcentratie van 10 μM.
      OPMERKING: Optioneel voor cellen om de kwaliteit van permeabilisatie te beoordelen.
    5. Voeg 16 μL 1,25 M succinaat (S) toe voor een eindconcentratie van 10 mM. (OPTIONEEL) Voeg 3 μL 0,5 M ADP toe voor een eindconcentratie van 2 mM om de verzadiging van de ADP-concentratie te regelen.
    6. Voeg voor cellen en niet-vezelig weefsel 2 μL 1 mg/ml oligomycine (OM) toe voor een eindconcentratie van 1 μg/ml.
      LET OP: Alle gebruikte ETS-remmers zijn zeer giftig.
      OPMERKING: Oligomycine kan titratie vereisen voor optimale concentratie, omdat het de ETS-capaciteit kan onderdrukken en wordt weggelaten voor spierweefsel. Reoxygeneer hier wanneer spierweefsel wordt getest en als O2 lager is dan 300 μM.
    7. Titreer FCCP uit een voorraad van 2 mM, voeg 0,6 μL toe met daaropvolgende stappen van 0,2 μL totdat er geen toename van de ademhaling en ademhaling maximaal is ontkoppeld (theoretisch: niet-gekoppeld).
    8. Voeg 1 μL 1 mM rotenon (ROT) toe voor een eindconcentratie van 0,5 μM. Voeg 2 μL 1 mg/ml antimycine (AM) voorraad toe voor een eindconcentratie van 1 μg/ml.
    9. Reoxygeneer de kamers om een vergelijkbaar zuurstofniveau (~ 150 μM) in alle kamers te bereiken door de zuiger langzaam op te tillen in draaiende beweging.
    10. Voeg 5 μL 0,8 M ascorbaat toe voor een eindconcentratie van 2 mM onmiddellijk gevolgd door 5 μL van 0,2 M N,N,N′,N′-tetramethyl-p-fenyleendiamine (TMPD) voor een eindconcentratie van 0,5 mM om complexe IV-activiteit te beoordelen (optioneel).
    11. Voeg 5 μL 4 M azide toe voor een eindconcentratie van 10 mM onmiddellijk wanneer de piek O2 flux wordt bereikt met TMPD. Ga door met de run gedurende >5 minuten om de automatische oxidatie van TMPD te testen voor complexe IV-basisniveauberekening.
    12. Hertel de cellen om het aantal cellen voorafgaand aan de run te bevestigen en ga verder met stap 1.9.
      OPMERKING: Digitonine-permeabilisatie (alleen voor cellen) moet worden getitreerd in proefexperimenten om maximale flux te bereiken en de mitochondriale membraanintegriteit niet te beïnvloeden (zie stap 1.7). Gepermeabiliseerde monsters (vooral spierweefsel) met >10% toename van de ademhalingsfrequentie na toevoeging van cytochroom c moeten worden uitgesloten van verdere analyse vanwege schade aan het buitenste mitochondriale membraan. Een korte tijdsdip in flux na de toevoeging van EtOH-opgeloste chemicaliën wordt verwacht.
  7. Protocol om optimale permeabilisatiecondities voor cellen te bepalen
    1. Voeg cellen toe zoals beschreven in stap 1.2 en 1.5.2.
    2. Neem 10 μL van 10 mg/ml digitonine en voeg 10 μL DMSO toe om te verdunnen tot 5 mg/ml.
    3. Voeg 1 μL rotenon (1 mM bouillon) toe. Voeg 10 μL succinaat (2 mM bouillon) en 5 μL ADP (0,5 M bouillon) toe.
    4. Titreer herhaaldelijk 1 μL digitonine (2,5 mg per stap) totdat de ademhaling niet verder toeneemt en maximaal is.
      OPMERKING: Een afname van de ademhaling duidt op een overmatige concentratie digitonine.
  8. Protocol voor OXPHOS-analyse in intacte cellen
    1. Voeg na routinematige ademhaling (stap 1.6.1-1.6.6) 2 μL 0,01 mM oligomycine toe voor een eindconcentratie van 10 nM.
    2. Titreer FCCP uit 2 mM voorraad, voeg 0,6 μL toe met daaropvolgende stappen van 0,2 μL totdat er geen verdere toename van de ademhaling en ademhaling maximaal is ontkoppeld (theoretisch: niet-gekoppeld)
    3. Voeg 1 μL 1 mM rotenon toe voor een eindconcentratie van 0,5 μM. Voeg 2 μL 1 mg/ml antimycinebouillon toe voor een eindconcentratie van 1 μg/ml.
    4. Reoxygeneer de kamer tot hetzelfde zuurstofniveau (~ 150 μM) door de zuiger langzaam in draaiende beweging op te tillen.
    5. Voeg 5 μL 0,8 M ascorbaat toe voor een uiteindelijke concentratie van 2 mM. Voeg onmiddellijk 5 μL van 0,2 M TMPD toe voor een eindconcentratie van 0,5 mM om complexe IV-activiteit te beoordelen.
      OPMERKING: Bereid een nieuwe batch voor voor een grotere reeks experimenten, omdat TMPD gevoelig is voor automatische oxidatie. De activiteit kan in de loop van de tijd afnemen wanneer deze bij -20 °C wordt bewaard.
    6. Voeg 5 μL 4 M azide toe voor een eindconcentratie van 10 mM onmiddellijk wanneer de piek O2 flux wordt bereikt met TMPD. Ga >5 minuten door om de automatische oxidatie van TMPD te testen voor complexe IV-basisniveauberekening.
    7. Cellen opnieuw tellen om het aantal cellen voorafgaand aan de uitvoering te bevestigen en ga verder met stap 1.9.
  9. Post-run monsterverzameling
    1. Verzamel precies 1 ml MiR05-suspensie uit elke kamer (met roerders aan) in een buis van 1,5 ml met 1,5 ml.
    2. Centrifugeer bij 1000 x g voor gepermeabiliseerde cellen of bij 20.000 x g voor weefsellysaat. Verwijder het supernatant en vries de pellet in bij -80 °C voor verdere verwerking (punt 3).
  10. Analyse van SUIT-protocollen
    1. Analyseer de zuurstofflux (pmol/s, genormaliseerd tot input) op elk plateau na toevoeging van een substraat of remmer (figuur 1C en figuur 3A). Exporteer de waarden naar een spreadsheet.
    2. Trek de waarde van het resterende zuurstofverbruik (ROX, figuur 1C en figuur 3C) af van alle waarden van elke experimentele run. Trek azide resterende ademhaling af van TMPD om complexe IV-ademhaling te verkrijgen.
    3. Zet de absolute waarden uit die zijn genormaliseerd voor cel (figuur 3A, B) of weefselinvoer (figuur 5A, B). Bereken de fluxcontroleverhoudingen (stap 1.11) of normaliseer ze naar eiwitinvoer (figuur 3C).
  11. Berekening van de fluxregelverhouding
    1. Verkrijg een index van ademhalingsfunctie en koppelingscontrole met behulp van fluxcontroleverhoudingen (FCR)9,26.
      OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de intrinsieke mitochondriale kwaliteit te beoordelen, onafhankelijk van mitochondriale kwantiteit. Bovendien zijn fluxcontroleverhoudingen (FCR) vergelijkbaar binnen dezelfde cellijnen die reagenskwaliteitscontrole mogelijk maken (de respectieve FCR's worden verkregen door de aangegeven genummerde referentiewaarden in figuur 1B-D en figuur 3C).
    2. Bereken de respiratoire controleverhouding voor de koppeling van OXPHOS aan LEAK met behulp van vergelijking 1.
      Vergelijking 1: FCRADP = 5/6 = Toestand 3 / Toestand 4
    3. Bereken de FCR om nadh-afhankelijke ademhaling te beoordelen met behulp van vergelijking 2
      Vergelijking 2:FCR-toestand 3 (I) = 3/5 = toestand 3 (I) / toestand 3 (I+II)
    4. Bereken de FCR om de Succinaatafhankelijke ademhaling te beoordelen met behulp van vergelijking 3.
      Vergelijking 3:FCR-toestand 3 (II) = 8/7 = Srot /ETS-capaciteit
    5. Bereken de FCR die gekoppeld aan ontkoppeld moet worden beoordeeld met behulp van vergelijking 4.
      Vergelijking 4: FCRgekoppeld/ontkoppeld = 5/7 = toestand 3 (I+II) /ETS-capaciteit
    6. Om de mitochondriale buitenmembraanintegriteit te testen, gebruikt u vergelijking 5.
      Vergelijking 5: % mitochondriale buitenmembraanschade = 3/4 = toestand 3 (I) / toestand 3 (I) met cyt c

2. Hoge resolutie respirometrie: Microplaat-gebaseerde respirometer (mHRR)

OPMERKING: De experimenten in dit gedeelte van het protocol werden uitgevoerd met behulp van de Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer (Materiaaltabel)

  1. Celkweek
    1. Kweek elk type cel. Adherenten (bijv. Collageen, laminine) kunnen worden gebruikt om de celaanhechting te vergemakkelijken. Hier worden HEK293-cellen gekweekt zoals voorheen (stap 1.3).
    2. De dag voor het experiment maakt u de cellen los en brengt u ze over in een aangewezen mHRR 96-well microplaat om ideale samenvloeiing te verkrijgen op de dag van het experiment (80% -100%) (figuur 2C).
      OPMERKING: Voor mHRR zijn de dichtheden van microplaatcellen van cruciaal belang. Individuele groei-eigenschappen van cellijnen of behandelingen die de groei beïnvloeden, moeten worden verantwoord om vergelijkbare samenloop op de dag van het experiment te garanderen.
  2. Voorbereiding van cellen voor respirometrie met hoge resolutie
    1. Oogst en resuspendeer de cellen voldoende voorafgaand aan het zaaien
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om cellen uit dezelfde verdunning te zaaien voor replicaties.
    2. Zaai de cellen volgens groeisnelheden van individuele cellijnen of groei-eigenschappen onder behandeling.
      OPMERKING: Optimaliseer op een standaard 96-well microplaat en extrapoleer de celdichtheid naar een 96-well assay-specifieke microplaat. In deze opstelling werden 7 x 104 HEK293 WT-cellen gezaaid per put van een 96-put. De eerste en laatste kolommen van de 96-well plaat worden gebruikt voor eiwitbepaling (figuur 2C). De vier hoekputten mogen geen cellen bevatten en worden gebruikt voor experimentele achtergrondcorrectie. Idealiter zijn putten dicht bij de randen leeg om het randeffect te minimaliseren (cellen vertonen bijvoorbeeld veranderde groeisnelheden veroorzaakt door temperatuureffecten) (figuur 2C, D).
  3. Bereiding van sensorplaten, laden van remmers
    1. Op de dag van de test, supplement 38,8 ml medium met 0,4 ml 1 M glucose, 0,4 ml glutamine en 0,4 ml na-pyruvaat.
      OPMERKING: mHRR-ademhaling vereist een gespecialiseerd niet-gebufferd DMEM-medium bij pH 7,4. Over het algemeen zou 40 ml voldoende moeten zijn voor één experiment met één 96-well microplaat.
    2. Verwarm het ademhalingstestmedium tot 37 °C en wissel het celkweekmedium in voor het ademhalingstestmedium door tweemaal te wassen met 80 μL per putje.
    3. Zet de plaat met de cellen in een incubator van 37 °C zonder CO2 gedurende 60 minuten voorafgaand aan de test.
      OPMERKING: Deze stap is essentieel om de plaat te ontgassen, omdat CO2 de ademhalingsresultaten kan beïnvloeden en serum in het medium bubbels kan produceren tijdens de test.
    4. Prewarmremmer aliquots voor OM, FCCP, ROT en AM tot 37 °C en haal de sensorplaat uit de incubator.
    5. Verdun OM, FCCP, ROT en AM in 3 ml testmedium tot een uiteindelijke putconcentratie van respectievelijk 1,5 μM, 1,125 μM en 1 μM. Vul afzonderlijke poorten in zoals aangegeven in figuur 2E.
      OPMERKING: Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen om de sensorcartridge te vullen. Aangezien lucht onder druk wordt gebruikt om verbindingen te injecteren, moeten alle poorten worden gevuld met een gelijke hoeveelheid vloeistofvolume wanneer een poort wordt gevuld met een verbinding. ROT en AM kunnen in één poort worden gecombineerd. Remmers kunnen worden opgelost in EtOH of DMSO.
    6. Inspecteer de injectiepoorten en controleer een gelijkmatig laadvolume voor elke poort.
      OPMERKING: Alle poorten bevatten een gat aan de onderkant voor injectie. Voorzichtigheid is geboden bij het verplaatsen van de sensorplaat. Luchtbellen kunnen worden verwijderd met behulp van een naald.
  4. Protocol voor zuurstofbeoordeling in intacte cellen
    1. Voer op de dag voor de test stappen 2.4.2-2.4.7 uit.
    2. Aliquot 20 ml van de kalibrantoplossing in een conische buis van 50 ml.
    3. Open de Extracellular Flux Assay Kit en verwijder de inhoud.
    4. Plaats de omgekeerde sensorcartridge naast de gebruiksplaat. Pipetteer 200 μL kalibrantoplossing in elk putje van de nutsplaat.
    5. Bevestig de sensorcartridge op de nutsplaat en let erop dat alle sensoren onder water staan.
    6. Zet de plaat in een incubator van 37 °C zonder CO2 gedurende een nacht of minimaal 12 uur. Controleer of de vochtigheid in de incubator voldoende is om verdamping van het kalibrant te voorkomen.
    7. Schakel het op microplaten gebaseerde systeem en de computer in om de volgende dag klaar te zijn voor gebruik (de machine heeft minimaal 3 uur nodig om tot 37 °C te balanceren voordat een test wordt uitgevoerd).
      OPMERKING: Verhoog voor signaalstabiliteit de meetpunten tot 6 in plaats van 3 meetcycli per ademhalingstoestand. Elke cyclus bestaat uit 3 minuten mengen en 3 minuten meten.
    8. Voer op de dag van de XF-test stappen 2.4.9-2.4.20 uit.
    9. Controleer de samenvloeiing van de celkweekplaat, de morfologie van de cellen en of de achtergrondputten leeg zijn.
    10. Was de cellen met het voorbereide ademhalingsmedium zoals vermeld in stap 2.4.11-2.4.12.
    11. Verwijder op 20 μL na alle kweekmedium uit elke put. Verwijder 55 μL als het kweekmedium 80 μL was als gevolg van verdamping 's nachts (ongeveer 5 μL).
    12. Wascellen tweemaal met 90 μL testmedium. Voeg ten slotte 100 μL assaymedium toe. Het eindvolume moet 120 μL zijn.
      OPMERKING: Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen voor deze stap om ervoor te zorgen dat dezelfde wasprocedure is toegepast op elke experimentele toestand (afhankelijk van de plaatopstelling). Kantel bij het zuigen de plaat in een hoek van 45° en plaats de pipetpunten in de hoek van de putten voor aspiratie en injectie van vloeistoffen. Het is noodzakelijk om voorzichtig te zijn tijdens het wassen, omdat bepaalde cellen gemakkelijk los kunnen komen van de onderkant van de celkweekplaat.
    13. Zet de plaat in een incubator van 37 °C zonder CO2 gedurende 60 minuten voorafgaand aan de test.
    14. Haal de gehydrateerde sensorpatroonplaat uit de CO2-vrije incubator.
    15. Gooi de oude kalibrantoplossing weg en vervang deze door verse kalibrantoplossing, voorbewarmd tot 37 °C.
    16. Bereid remmers en testmedium voor (3 ml per remmer voor een totaal van 12 ml testmedium) en gebruik een pipetreservoir voor het laden van de remmer in havens.
    17. Open de software en voer een vooraf ontworpen of nieuwe sjabloon uit. Vul de plaatkaart, pas de titraties en meetcycli aan en druk op Start om de kalibratie van de optische sensoren te starten.
    18. Verwijder het deksel van de geladen cartridge en plaats deze in de sleuf die automatisch uit het apparaat schuift, waarbij u controleert of de markeringen in de rechterbenedenhoek van de plaat overeenkomen met de driehoek in de rechterbenedenhoek van de sleuf.
    19. Klik op Doorgaan om automatische kalibratie uit te voeren, die ongeveer 20 minuten duurt.
    20. Verwijder na kalibratie de gebruiksplaat met het kalibrant.
    21. Verwijder het deksel van de microplaat met de cellen en plaats de plaat in de sleuf wanneer de machine daarom vraagt. Klik op Doorgaan om de run te starten.
  5. Post-run monsterverzameling
    1. Haal de plaat uit de machine, verwijder voorzichtig de resterende testmedia zonder de cellen te storen en vries de hele plaat in bij -80 °C voor verdere verwerking (rubriek 3).

3. Bepaling van het eiwit met behulp van de bicinchonininezuurtest (BCA-assay)

  1. Bereid verdund runderserumalbumine (BSA) in buffer die wordt gebruikt voor eiwitextractie en compatibel is met BCA: 2 mg / ml, 1, 1 mg / ml, 1 mg / ml, 0, 5 mg / ml, 0, 25 mg / ml en 0 mg / ml voor standaardcurve in duplicaten.
  2. Extraheer eiwitten door resuspendatie in een geschikte lysisbuffer (bijv. RIPA) met 20 μL per put voor mHRR of 100 μL per pellet in een buis van 1,5 ml voor cHRR.
  3. Incubeer de mHRR-plaat of 1,5 ml buis met eiwitlysaten gedurende 30 minuten op ijs.
  4. Centrifugeer de buis van 1,5 ml met het eiwitlysaat bij 4 °C bij 20.000 x g gedurende 20 minuten en breng het resulterende supernatant over in een nieuwe schone buis van 1,5 ml.
  5. Gebruik 10 μL per monster in duplicaten en standaarden in een microtiterplaat. Voeg 200 μL BCA-werkreagens toe en incubeer gedurende >15 min.
  6. Lees de plaat in een standaard spectrofotometer op een golflengte van 562 nm en bereken de eiwitconcentraties met behulp van een BSA-standaardcurve.
  7. Normaliseer de ademhalingsresultaten naar de eiwitconcentratie.
    OPMERKING: Normalisatie naar eiwithoeveelheid maakt het mogelijk om celzaaidichtheden of invoer van nat gewicht te bevestigen. De geëxtraheerde eiwitten zijn geschikt voor latere immunoblotting tegen subeenheden van het ETS bijvoorbeeld, maar vertegenwoordigen niet volledig het oorspronkelijke monster (bijv. verlies van fosforyleringsplaatsen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier bieden we protocollen om de mitochondriale bio-energetica in eukaryote cellen, niet-vezelig weefsel (bijv. Cerebellum) en vezelig weefsel (bijv. skeletspieren) te bepalen. Voor eukaryote cellen werden HEK293 met CRISPR-engineered knock-out van twee verschillende eiwitten geassocieerd met mitochondriale translatie resulterend in meervoudige (CRISPRKO1) en ernstige / volledige OXPHOS-deficiëntie (CRISPRKO2) gemeten met cHRR (figuur 3A-C

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Traditioneel is mitochondriale bio-energetica bestudeerd met Clark-type zuurstofelektroden. Een gebrek aan resolutie en doorvoer rechtvaardigde echter technologische vooruitgang. Tot op heden zijn de O2k (aangeduid als cHRR) en Seahorse XF96 Flux Analyzer (aangeduid als mHRR) op grote schaal toegepast op het gebied van cellulaire bio-energetica. Hier presenteren we een begrijpelijke verzameling protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme via beoordeling van mitochondriale ademhaling met behulp van cHRR o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflict bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Academy of Finland (C.B.J),de Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J.) en een doctoraatsbeurs van de Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/HomogenizerOmni International07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixturePotter voor weefselvermaling
ADPSigmaA 4386
Antimycin ASigmaA 8674Chemisch
AscorbaatMerckPHR1279-1GChemisch, opgelost in ethanol
BSA (fatty acid vrij)SigmaA 6003Chemisch
CaCO3SigmaC 4830Chemisch
Cytochroom cSigmaC 7752Chemisch
DigitonineSigmaD 5628Chemisch
DithiothreitolSigmaD 0632Chemisch, opgelost in DMSO
D-SucroseRoth4621.1Chemisch
Dulbecco’s aangepast Eagle’s medium (Hoge glucose)Fisher Scientific41965-039Chemisch
Dulbecco’s aangepast Eagle’s medium (Geen glucose)Fisher ScientificA14430-01
EGTASigmaE 4378
EtomoxirSigmaE1905Chemisch
Falcon 15 ml Conische CentrifugebuizenFisher ScientificAM12500Chemisch
Falcon 50 ml Conische CentrifugebuizenFisher ScientificAM12501
FCCPSigmaC 2920
GlucoseSigmaG7021Chemisch, opgelost in ethanol
GlutamaatSigmaG 1626Chemisch
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)Fisher Scientific35050061Chemisch
HEK293 cellenATTCCRL-1573
HemocytometerFisher Scientific0267151BInstrument voor celtelling
HepesSigmaH 7523Chemisch
ImidazoolFluka56750Chemisch
KClMerck1.04936Chemisch
L-carnitineSigmaC0283Chemisch
MalaatSigmaM 1000Chemisch
MES hydrateSigmaM8250Chemisch
MgCl2SigmaM 9272Chemisch
Na2ATPSigmaA 2383Chemisch
Na2FosfocreatineSigmaP 7936Chemisch
Na-pyruvaat (100 mM) (100x)Fisher Scientific11360070
NEAA (Niet-essentiële aminozuren) 100xFisher Scientific11140035
Normaal FBS (10x)Fisher Scientific10500064
O2k-Core: Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02Hoge resolutie respirometrie-instrument
O2k-Titratie SetOroboros Instruments20820-03Hamilton spuiten voor chemische injecties
OligomycineSigmaO 4876Chemisch, opgelost in ethanol
PalmitoylcarnitineSigmaP 4509Chemisch
Penicilline-StreptomycineFisher Scientific15140122
Pierce BCA Protein Assay KitFisher Scientific23227
PyrouvaatSigmaP 2256Chemisch
RIPA-BufferFisher Scientific89900Chemisch
RotenoneSigmaR 8875Chemisch, opgelost in ethanol
SaponineSigmaS7900Chemisch

Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		103680-100
Seahorse XFe96 Extracellulaire Flux Analyzer
Agilent, Santa Clara, CA		Hoge doorvoer respirometrie-instrument
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
Bevat assayplaten, cartridges, laadgidsen voor het overbrengen van verbindingen naar de assaycartridge en calibratieoplossing.
Kleine schaarFisher Scientific08-951-20
NatriumazidSigmaS2002Chemisch
SuccinaatSigmaS 2378Chemisch
TaurineSigmaT 8691Chemisch
TMPDSigmaT 3134Chemisch
Trypan Blauw oplossingMerck72-57-1Chemisch
Trypsine 0,25% EDTAFisher Scientific25200056
Twee dunne tangjesFisher Scientific12-000-122
Uridine stock (500x)SigmaU3750Chemisch

Referenties

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234(2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746(2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317(2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544(2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mitochondri le bioenergeticazuurstofverbruikoxidatieve fosforyleringkamergebaseerde respirometrieplaatgebaseerde respirometriesubstraat ontkoppelaar remmerCRISPR HEK293 cellenOXPHOS defici ntieextracellulaire verzuring
Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.