Methodenartikel

Bepaling van de totale eiwit- en bioactieve eiwitconcentraties in rundercolostrum

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63001

⸱

10 december 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, Lincoln, 5Evolve BioSystems Inc.

In dit artikel

Samenvatting

Rundercolostrum is zowel een primaire bron van voedingsstoffen als immunologische ondersteuning voor het pasgeboren kalf. Het begrip van het niveau van therapeutische eiwitten (lactoferrine en IgG) is belangrijk voor de dosering en standaardisatie van rundercolostrum voor menselijke consumptie.

Samenvatting

Colostrum is een complexe biologische vloeistof die door zoogdieren direct na de bevalling wordt geproduceerd. Het voldoet aan alle voedingsbehoeften van pasgeborenen als een goede bron van macro- en micronutriënten, bioactieve peptiden en groeifactoren. Rundercolostrum is ook een potentiële bron van voeding en bioactief vanwege het rijke eiwitgehalte, waaronder immunoglobuline G (IgG) en lactoferrine. Het gehalte aan lactoferrine en IgG in rundercolostrum verandert echter aanzienlijk tijdens de lactatieperiode. Daarom is het monitoren van de concentratie van IgG en lactoferrine voor het gebruik van rundercolostrum als eiwitbron een belangrijke vraag om te bestuderen. Methoden in dit artikel beschrijven hoe het eiwitgehalte kan worden bepaald, evenals specifieke concentraties lactoferrine en IgG. Deze methoden omvatten de volgende stappen: Isolatie van rundercolostrumeiwitten, Bepaling van de eiwitconcentratie via Bicinchoninezuurtest (BCA), Visualisatie van eiwitten via SDS-PAGE, Bepaling van lactoferrine en IgG-concentratie met behulp van een ELISA-test.

Inleiding

Colostrum is de eerste afscheiding van de borstklier die kort na de bevalling door zoogdieren wordt geproduceerd. Colostrum is rijk aan macro- en micronutriënten, antimicrobiële peptiden en groeifactoren 1,2,3,4. De samenstelling varieert geleidelijk in de loop van de tijd door de overgang naar rijpe melk 5,6,7, maar het meest significant binnen 24 uur na de bevalling8. De samenstelling van biest wordt ook beïnvloed door maternale factoren, waaronder leeftijd, pariteit, ras, gezondheid en voedingsstatus, evenals extrinsieke factoren, waaronder seizoen, voortijdige bevalling, voortijdige lactatie, colostrale hanteringsfactoren (pooling van biest en bewaartemperatuur) en inductie van de bevalling 9,10,11. In vergelijking met rijpe melk bevat biest minder lactose en meer vet, eiwitten, peptiden, niet-eiwitstikstof, as, hormonen, groeifactoren, cytokines, nucleotiden, vitamines en mineralen12. Rundercolostrum bevat een breed scala aan eiwitten, waaronder immunoglobulinen, lactoferrine, α-lactalbumine (α-LA), β-lactoglobuline (β-Lg), lactoperoxidase en verschillende groeifactoren13. De totale eiwitconcentratie van rundercolostrum varieert tussen 11,26 mg/ml en 169,55 mg/ml14. Het eiwitgehalte bestaat uit wei en caseïne met een gemiddelde concentratie van respectievelijk 124,00 mg/ml en 26,00 mg/ml15. Het weigedeelte bevat drie belangrijke soorten immunoglobulinen (Igs) als IgG (85%-90%), IgM (7%) en IgA (5%)16. De belangrijkste Ig in rundercolostrum is IgG, dat zorgt voor passieve immuniteit en het adaptieve en aangeboren immuunsysteem in het kalfmoduleert 17. De initiële Ig-concentratie van de eerste melkende runderbiest kan variëren van 20 tot 200 mg/ml en afnemen tot ongeveer 0,4-1,0 mg/ml18. De gemiddelde IgG-concentratie is ongeveer 60 mg/ml en daalt gestaag tot het niveau van minder dan 1 mg/ml tijdens de overgang naar rijpe melk19.

Een ander belangrijk bioactief eiwit in colostrum is lactoferrine, een ijzerbindend glycoproteïne met een concentratie van 1,5-5 mg/ml. Eigenschappen van lactoferrine zijn onder meer het verbeteren van de ijzerabsorptie en het bezitten van antimicrobiële activiteit20,21, bindende lipopolysaccharide, immuunmodulatie en het stimuleren van de groei van darmepitheelcellen en fibroblasten22. Rundercolostrum bevat ook α-lactalbumine en β-lactoglobuline. Deze eiwitten zijn bronnen van essentiële aminozuren en hebben ook een bacteriedodende werking 23,24,25. De gemiddelde concentraties α-LA en β-Lg in colostrum zijn gemiddeld respectievelijk 2,77 mg/ml2 en 11,5 mg/ml26. Daarna nemen deze concentraties af tot 1-1,5 mg/ml27 en 4,8 mg/ml26 in rijpe melk. Colostrum bevat ook een aanzienlijke hoeveelheid lactoperoxidase (gemiddeld 22,8 μg/ml) en lysozym (gemiddeld 0,40 μg/ml)26. Lactoperoxidase is een glycoproteïne dat antimicrobiële activiteit bezit tegen Gram-positieve en negatieve bacteriën28 door reactieve zuurstofsoorten te produceren. Lysozym functioneert als een antimicrobieel middel door de peptidoglycaancomponent van bacteriële celwanden te splitsen, wat leidt tot celdood 29,30.

Vanwege hun eigenschappen worden IgG en lactoferrine verwerkt in verschillende voedingsproducten om zuigelingenvoeding, voedingssupplementen, eiwitrijke preparaten voor herstellenden en sporters te verrijken, evenals in farmacologie en cosmetologie 31,32,33. Rundercolostrum is een belangrijke bron van IgG en lactoferrine. De samenstelling van deze bioactieve eiwitten in rundercolostrum verandert echter aanzienlijk tijdens de lactatieperiode. Daarom is het van cruciaal belang om veranderingen in de concentratie van deze bioactieve eiwitten in biestmonsters die worden gebruikt voor onderzoek en voedselverwerking te monitoren. Deze studie heeft tot doel de methoden te beschrijven voor het monitoren van de concentratie en samenstelling van het totale eiwit, lactoferrine en IgG in rundercolostrum gedurende de 6 dagen na het afkalven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

In de periode juli-augustus werden gedurende 6 dagen na het afkalven in de middag biestmonsters verzameld van 28 Holstein-melkkoeien van Uluova Milk Trading Company in Çanakkale, Turkije, en diepgevroren. De monsters die op dezelfde dag werden verzameld, werden samengevoegd op basis van de dag van elk monster en geanalyseerd op hun totale eiwit-, lactoferrine- en IgG-concentraties. Alle monsters werden in tweevoud getest.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Meng 200 μl rundercolostrum met 400 μl dH2O om een verdund monster voor de analyse te verkrijgen. Verdun alle monsters dienovereenkomstig.
  2. Centrifugeer verdunde en onverdunde monsters gedurende 30 minuten bij 4 °C, 1000 x g .
  3. Scheid de middelste fase in een toepasselijk gelabelde nieuwe buis. Herhaal stap 1.2. om een duidelijke middenfase te verkrijgen. Bewaar de hele middelste fase en verdunde monsters bij -20 °C, indien niet onmiddellijk gebruikt.
  4. Gebruik de middelste fase verkregen uit verdunde monsters voor BCA-, SDS-PAGE- en Lactoferrine-assays. Verzamel de middelste fase van onverdunde monsters voor de IgG-test.
  5. Bereid monsterverdunningen voor elk monster voor om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het standaardcurvebereik liggen. Verdun elke middelste fase verkregen uit de verdunde monsters tot 1:300 voor BCA-test en 1:30.000 voor Lactoferrine-assay, en verdun elke middelste fase verkregen uit onverdunde monsters tot 1:400.000 voor IgG-assay.
    OPMERKING: Verdunningsfactoren worden bepaald op basis van de extinctiewaarde en de standaardcurve.

2. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwittestkit

  1. Voorbereiding van standaarden en reagentia
    1. Gebruik de reagentia die worden meegeleverd in de in de handel verkrijgbare kit (zie materiaaltabel) die voor de test moeten worden gebruikt: BCA-reagens A, dat natriumcarbonaat, natriumbicarbonaat, bicinchoninezuur en natriumtartraat in 0,1 M natriumhydroxide bevat. BCA-reagens B bevat 4% koper(II)sulfaat. Albumine (BSA) standaarden, bevat runderserumalbumine in een dosis van 2,0 mg/ml in 0,9% zoutoplossing en 0,05% natriumazide.
    2. Breng alle monsters en eiwitstandaarden in evenwicht met kamertemperatuur (RT).
    3. Bereid voldoende hoeveelheden werkend reagens (WR) voor door de verhouding van 50:1 van reagens A:B te mengen. Voor elk monster en elke norm is 200 μL WR vereist.
    4. Bereid verdund albumine (BSA) volgens het volgende verdunningsschema (tabel 1), dat een werkbereik geeft tussen 20-2.000 μg/ml uiteindelijke BSA-concentratie. Gebruik dH2O als verdunningsmiddel.

Tabel 1: Verwateringsschema van BSA-normen.

FioolVolume verdunningsmiddel (μL)Volume en bron van BSA (μL)Uiteindelijke BSA-concentratie (μg/ml)
Een0300 μl voorraad2000
B125375 μL voorraad1500
C325325 μL voorraad1000
D175175 van injectieflacon B verdunning750
E325325 injectieflacon C verdunning500
F325325 injectieflacon E verdunning250
G325325 van injectieflacon F verdunning125
H400100 van injectieflacon G-verdunning25
Ik40000 = leeg
  1. BCA-testprocedure
    1. Breng 25 μL van elke BCA-standaard of monster over in een plaat met 96 putjes. Voeg 200 μl WR toe aan elke goed bevattende standaard of monster. Meng de plaat goed op een plate shaker gedurende 30 s.
    2. Dek de plaat af met een platensealer en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Laat de reacties na de incubatie ongeveer 10 minuten in evenwicht komen met RT. Lees elke plaat af bij 562 nm met behulp van een microplaatlezer met de bijbehorende software.
  2. Standaardcurve genereren en resultaten bepalen
    1. Noteer de extinctiewaarden voor de standaarden en monsters. Zie tabel 1 voor de verdunningsreeksen. Trek de extinctiewaarden van de standaard blanco af van elke extinctiewaarde van de standaarden en het monster. Gemiddelde van de dubbele metingen voor elke standaard en elk monster om de totale eiwitconcentratie te schatten.
    2. Construeer een standaardcurve door de gecorrigeerde gemiddelde extinctie voor elke standaard op de x-as en de concentratie op de y-as uit te zetten. Teken een lineaire curve met de juiste software die in staat is om de curve met vier parameters te passen.
    3. Gebruik de standaardcurve om de concentratie van elk monster te bepalen door de respons op de concentratie te interpoleren. Vermenigvuldig met de verdunningsfactor (stap 1.5) om de werkelijke concentratie van het monster te verkrijgen.

3. Visualisatie van eiwit met behulp van SDS-PAGE-assay

  1. Voorbereiding van monster en oplossingen
    1. Voorraadoplossingen voorbereiden
      1. Bereid 10% (w/v) SDS, 1,5 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) ammoniumpersulfaat (APS) oplossing (vers bereiden).
      2. (met v/v) SDS: Weeg 1 g SDS af en voeg 10 ml dH2O toe.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Weeg 18,15 g Tris af en los op met ~60 ml dH2O. Stel in op pH 8,8 met HCl. Voeg dH2O toe om het volume op 100 ml te brengen.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Weeg 6,00 g Tris af en los op met ~60 ml dH2O. Stel in op pH 6,8 met HCl. Voeg dH2O toe om het volume op 100 ml te brengen.
      5. APS: Weeg 15 mg APS af en voeg 150 μL dH2O toe.
        LET OP: Acrylamide en SDS zijn giftig en schadelijk. Draag beschermende handschoenen en werk onder een capuchon.
    2. Bereid de monsterbuffer voor door 50 μL β-Mercaptoethanol toe te voegen aan 950 μL 2x SDS-PAGE monsterbuffer.
      LET OP: β-mercaptoethanol is giftig bij inademing. Draag beschermende handschoenen en werk onder een capuchon.
    3. Bereid de loopbuffer voor door 100 ml 10x Tris-glycine SDS Running Buffer te mengen met 900 ml dH2O.
    4. Bereid de kleuroplossing voor (45% dH2O, 45% methanol, 10% ijsazijn, 2 g Coomassie Brilliant Blue R).
    5. Bereid de kleuroplossing voor (50% dH2O, 40% methanol, 10% ijsazijn).
  2. Bereiding van de gel
    1. Bereid de apparatuur van de elektroforese-eenheid, inclusief gelcassette, voedingen, elektroden en kabels voor op de test. Reinig de glasplaten met ethanol en zet de sandwich in elkaar. Zorg ervoor dat de onderranden van glasplaten en afstandhouders goed zijn uitgelijnd.
    2. Bereid het scheidingsgelmengsel voor dat 3,5 ml dH2O, 2,4 ml 40% acrylamide/methyleen bis acrylamide, 2 ml 1,5 ml Tris-HCl, 100 μl 10% (w/v) SDS, 80 μl 10% APS, 8 μl N,N,N',N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED) bevat.
      LET OP: TEMED is giftig en/of irriterend. Draag beschermende handschoenen en werk onder een capuchon.
    3. Giet het scheidingsgelmengsel in de gelplaten tot een niveau ongeveer 1-1,5 cm onder de bovenkant van de kortere plaat.
    4. Laag de bovenkant van de scheidingsgel met isopropanol om luchtbellen aan de bovenkant van de gel te verwijderen en te voorkomen dat de gepolymeriseerde gel uitdroogt.
    5. Giet isopropanol op de scheidingsgel nadat de scheidingsgel minimaal 15 minuten is gepolymeriseerd.
    6. Bereid het stapelgelmengsel voor dat 1,92 ml dH2O, 300 μl 40% acrylamide/methyleenbis acrylamide, 750 μl 0,5 M Tris-HCl, 100 μl 10% (w/v) SDS, 30 μl 10% APS en 3 μl TEMED bevat.
    7. Giet de stapelgeloplossing over de scheidingsgel zodat de gelplaten gevuld zijn. Steek de kam in de bovenkant van de afstandhouders.
    8. Laat de stapelgel ongeveer 15 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur.
  3. De gel laten lopen
    1. Bevestig de gel aan de elektrodeconstructie. Voeg vers bereide 1x Tris-glycine SDS Running Buffer toe aan beide kamers van het apparaat.
    2. Verwijder de kam.
    3. Laad 5 μL van de ladder (10-250 kDa) en 8 μL van de middelste fase van verdunde monsters in de putjes van de gel. Laat de gel op 80 V draaien totdat de kleurstof in de scheidingsgel migreert en verhoog tot 120 V totdat de kleurstof de bodem van de gel bereikt. Schakel de toegepaste stroom uit nadat de kleurstof de bodem van de gel heeft bereikt.
  4. Kleuring en vlekken van de gel
    1. Verwijder de gel van het apparaat zodra de run is voltooid en verwijder de afstandhouders en glasplaten. Plaats de gel in een klein bakje.
    2. Kleur de gel door kleuroplossing toe te voegen (stap 3.1.4) gedurende 30 minuten en schud zachtjes op 55 tpm.
    3. Giet de kleuroplossing van de gel af. Spoel de gel af met een kleine hoeveelheid kleuroplossing en gooi de kleurstof weg.
    4. Voeg een voldoende hoeveelheid kleuroplossing toe om de gel te bedekken en verwijder de vlek met zacht schudden gedurende ~1 uur totdat de banden zichtbaar zijn.

4. Lactoferrineconcentratie met behulp van een runderlactoferrine-ELISA

  1. Voorbereiding van standaarden en reagentia
    1. Gebruik voor deze test de in de handel verkrijgbare Bovine LF/LTF/Lactoferrin ELISA-kit.
    2. Breng alle samples en standaarden in evenwicht met RT.
    3. Bereid voldoende hoeveelheden detectiereagens A en B werkoplossing voor die verantwoordelijk zijn voor de binding aan het opgevangen antigeen.
    4. Verdun de detectiereagentia A en B tot een verhouding van 1:100 met behulp van respectievelijk analyseverdunningsmiddelen A en B.
    5. Bereid een 1x werkende wasbuffer voor door het 30x wasbufferconcentraat te verdunnen met dH2O.
    6. Doe een voldoende hoeveelheid 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) substraatoplossing in een steriel microbuisje.
    7. Resuspendeer een tube gevriesdroogde standaard (100 ng/ml) met 0,5 ml van het verdunningsmiddel van het monster en incubeer gedurende 10 minuten bij RT onder zacht roeren. Draai de injectieflacon om ervoor te zorgen dat al het gevriesdroogde mineraal op de bodem wordt opgevangen.
    8. Bereid een standaardverdunningsreeks voor volgens het volgende verdunningsschema (tabel 2).

Tabel 2: Verdunningsschema van runderlactoferrinestandaarden.

FioolVolume verdunningsmiddel (μL)Volume en bron van Lf (μL)Uiteindelijke Lf-concentratie (ng/ml)
D10500 μL voorraad100
D2250250 van injectieflacon D1 verdunning50
D3250250 van injectieflacon D2 verdunning25
D4250250 van injectieflacon D3 verdunning12.5
D5250250 van injectieflacon D4 verdunning6.25
D6250250 van injectieflacon D5 verdunning3,125
D7250250 van injectieflacon D6 verdunning1,563
D825000 = leeg
  1. Meten van de concentratie van runderlactoferrine
    1. Pipetteer 100 μL van elke lactoferrinestandaard of monster in de gecoate stripplaat met 96 putjes. Dek de plaat af met een platensealer om verdamping te voorkomen. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Zuig de vloeistof van elk putje op. Voeg 100 μL van de detectiereagens A werkende oplossing toe aan elk putje. Dek af met een plaatsealer en schud voorzichtig om een grondige menging te garanderen. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Was drie keer door ongeveer 350 μL 1x wasbuffer toe te voegen na het opzuigen van de vloeistof uit elk putje. Laat elke wasbeurt 1-2 minuten intrekken voordat u volledig opzuigt. Zuig na de laatste wasbeurt op om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen, keer vervolgens de plaat om en tik tegen een schoon absorberend papier.
    4. Voeg 100 μL van de detectiereagens B-werkoplossing toe aan elk putje. Dek af met een nieuwe plaatafdichter. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Zuig de vloeistof uit elk putje op en was het vijfmaal zoals beschreven in stap 4.2.3. Doe 90 μL TMB-substraatoplossing in elk putje en dek af met een nieuwe plaatafdichter.
    5. Incubeer bij 37 °C gedurende 10-20 minuten uit de buurt van licht. Controleer de optimale kleur door regelmatig te controleren. Merk op dat de intens blauwe kleur in de put lactoferrine met een hoog concentraat bevat.
    6. Voeg 50 μL stopoplossing toe aan elk putje. De kleur verandert van blauw naar geel. Meet de absorptie van elk putje onmiddellijk bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer met de bijbehorende software.
      NOTITIE: Tik zachtjes op de plaat om grondig te mengen totdat de kleurverandering uniform is.
  2. Standaardcurve genereren en resultaten bepalen
    1. Volg stap 2.3.1 voor het genereren van gegevens om de lactoferrineconcentratie te schatten.
    2. Construeer een standaardcurve door de gecorrigeerde gemiddelde extinctie voor elke standaard uit te zetten, zoals beschreven in stap 2.3.2, maar een polynomiale curve te tekenen met de juiste software die in staat is om de curve met vier parameters te passen.
    3. Bereken het lactoferrinegehalte van elk monster door de absorptiewaarde te interpoleren met de gegenereerde vergelijking zoals beschreven in stap 2.3.3.

5. Bepaling van de IgG-concentratie van de monsters met behulp van Boviene IgG-ELISA

  1. Voorbereiding van standaarden en reagentia
    1. Gebruik de benodigde items van de items die worden meegeleverd in de Bovine IgG ELISA Kit.
    2. Breng alle samples en standaarden in evenwicht met RT.
    3. Bereid voldoende hoeveelheden werkende enzym-antilichaamconjugaatoplossing voor door 10 μl mierikswortelperoxidase (HRP)-avidinconcentraat (100x) te verdunnen met 990 μl enzym-antilichaamconjugaatverdunningsmiddel.
    4. Bereid voldoende hoeveelheden 1x wasbuffer voor door 20x wasbufferconcentraat te verdunnen met dH2O.
    5. Bereid voldoende hoeveelheden van de 1x verdunningsmiddeloplossing voor door 20x verdunningsmiddelconcentraat te verdunnen met dH2O.
    6. Voeg 1,0 ml dH2O toe aan de IgG-kalibrator voor runderen en meng voorzichtig tot het is opgelost. De uiteindelijke concentratie van de kalibrator is 123.000 ng/ml.
    7. Bereid de standaardverdunningsreeksen volgens het in tabel 3 beschreven verdunningsschema.

Tabel 3: Regeling voor de verdunning van de IgG-normen voor runderen.

FioolVolume verdunningsmiddel (μL)Volume en bron van IgG (μL)Uiteindelijke IgG-concentratie (ng/ml)
D1900100 μL voorraad12300
D2900100 van injectieflacon D1 verdunning1230
D3178122 van injectieflacon D2 verdunning500
D415050 van injectieflacon D3 verdunning250
D5150150 van injectieflacon D4 verdunning125
D6100100 van injectieflacon D5 verdunning62.5
D7100100 van injectieflacon D6 verdunning31.25
D8100100 van injectieflacon D7 verdunning15,625
D9100100 van injectieflacon D8 verdunning7,813
D1010000 = leeg
  1. Bepaling van de IgG ELISA-test bij runderen
    1. Pipetteer 100 μL van elke IgG-standaard of -monster in de gecoate stripplaat met 96 putjes. Dek de plaat af met een platensealer en incubeer 30 minuten bij RT. Zuig de vloeistof uit elk putje op.
    2. Was vier keer door putjes te vullen met 1x wasbuffer en aspireren. Zuig na de laatste wasbeurt op om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen, keer vervolgens de plaat om en tik tegen schoon absorberend papier. Voeg 100 μL van het juiste verdunde enzym-antilichaamconjugaat toe aan elk putje. Dek af met een plaatsealer en schud voorzichtig om een grondige menging te garanderen.
    3. Incubeer 10 minuten bij RT. Was en verwijder de resterende wasbuffer uit de putjes zoals beschreven in stap 5.2.2. Voeg 100 μL TMB-substraat toe aan elk putje; Dek af met een nieuwe plaatafdichter.
    4. Incubeer bij RT gedurende precies 10 minuten weg van het licht. Stop de reactie door 100 μL stopoplossing aan elk putje toe te voegen. Lees elke plaat af bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer met de bijbehorende software.
  2. Standaardcurve genereren en resultaten bepalen
    1. Volg stap 2.3.1 voor de gegevenseditie om de IgG-concentratie te schatten.
    2. Construeer een standaardcurve door de concentratie op de x-as en de gecorrigeerde gemiddelde absorptie voor elke standaard op de y-as uit te zetten. Teken een veeltermcurve met de juiste software die in staat is om de curve met vier parameters te laten passen.
    3. Bereken het IgG-gehalte van elk monster door de absorptiewaarde te interpoleren met de gegenereerde vergelijking zoals beschreven in stap 2.3.3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens het protocol werden de rundercolostrummonsters geanalyseerd om de eiwit-, lactoferrine- en IgG-concentratie te bepalen. De resultaten van eiwit-, lactoferrine- en IgG-analyses van rundercolostrum zijn weergegeven in tabel 4.

Tabel 4: Concentratie van eiwit, lactoferrine en IgG van rundercolostrum.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie geeft informatie over aanzienlijke veranderingen in de eiwit-, lactoferrine- en IgG-concentraties in biest tijdens de overgang naar rijpe melk. Detectie van veranderingen in de lactoferrine- en IgG-concentratie werd uitgevoerd door sandwich ELISA en de totale eiwitconcentratie werd geanalyseerd door de BCA-test. De resultaten geven aan dat vroeg colostrum de hoogste eiwit-, lactoferrine- en IgG-concentratie heeft, die vervolgens in de komende 3 dagen afnam. Nauwkeurige meting...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt ondersteund door Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD en BMH zijn medewerkers van Evolve BioSystems, een bedrijf dat zich richt op het herstellen van het microbioom van baby's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10X Running Buffer (Tris-Glycine-SDS)ClearBandTGS10SDS-Page analyse
2-mercaptoethanolgibco31350-010SDS-Page analyse
Acetic Acid GLACIALIsolab901,013,2500SDS-Page analyse
Bovine IgG ELISA KitAviva Systems BiologyOKIA00005Bepaling van IgG-concentratie
Bovine LF / LTF / Lactoferrin ELISA KitLSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884Bepaling van lactoferrineconcentratie
Coomassie Brillant Blue R 250amresco0472-25GSDS-Page analyse
Hydrochloric Acid Fuming 37%Isolab932,103,2501SDS-Page analyse
IsopropanolIsolab961,023,2500SDS-Page analyse
Laemmli Sample Buffer (2X)ClearBandLSB-2xSDS-Page analyse
MethanolIsolab947,046,2500SDS-Page analyse
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 to 250Thermo Scientific26619SDS-Page analyse
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Bepaling van eiwitconcentratie
Sodium dodecyl sulfate (SDS)BioShopSDS001.500SDS-Page analyse
SureCast Acrylamide Solution 40% (w/v)InvitrogenHC2040SDS-Page analyse
SureCast Ammonium persulfate (APS)Thermo Scientific17874SDS-Page analyse
SureCast Tetramethylethylenediamine (TEMED)InvitrogenHC2006SDS-Page analyse
TECAN Infinite M200 Plate ReaderTecan30035094Absorptiemeting
Tris baseBioShopTRS001.1SDS-Page analyse

Referenties

  1. Kehoe, S. I., Jayarao, B. M., Heinrichs, A. J. A survey of bovine colostrum composition and colostrum management practices on Pennsylvania dairy farms. Journal of Dairy Science. 90 (9), 4108-4116 (2007).
  2. Levieux, D., Ollier, A. Bovine immunoglobulin G, β-lactoglobulin, α-lactalbumin and serum albumin in colostrum and milk during the early post partum period. Journal of Dairy Research. 66 (3), 421-430 (1999).
  3. Elfstrand, L., Lindmark-Månsson, H., Paulsson, M., Nyberg, L., Åkesson, B. Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal. 12 (11), 879-887 (2002).
  4. Strekozov, N. I., Motova, E. N., Fedorov, Y. N. Evaluation of the chemical composition and immunological properties of colostrum of cows' first milk yield. Russian Agricultural Sciences. 34 (4), 259-260 (2008).
  5. Playford, R. J., Weiser, M. J. Bovine colostrum: Its constituents and uses. Nutrients. 13 (1), 265(2021).
  6. Godhia, M., Patel, N. Colostrum - Its composition, benefits as a nutraceutical: A review. Current Research in Nutrition and Food Science Journal. 1 (1), 37-47 (2013).
  7. Nakamura, T., et al. Concentrations of sialyloligosaccharides in bovine colostrum and milk during the prepartum and early lactation. Journal of Dairy Science. 86 (4), 1315-1320 (2003).
  8. Arain, H. H., Khaskheli, M., Arain, M. A., Soomro, A. H., Nizamani, A. H. Heat stability and quality characteristics of postpartum buffalo milk. Pakistan Journal of Nutrition. 7 (2), 303-307 (2008).
  9. Maunsell, F. P., et al. Effects of mastitis on the volume and composition of colostrum produced by Holstein cows. Journal of Dairy Science. 81 (5), 1291-1299 (1998).
  10. Tittle, D. J. Factors affecting colostrum quality. Cattle Practice. 10 (2), 131-136 (2002).
  11. Zarcula, S., et al. Influence of breed, parity and food intake on chemical composition of first colostrum in cow. Animal Science and Biotechnology. 43 (1), 43(2010).
  12. McGrath, B. A., Fox, P. F., McSweeney, P. L. H., Kelly, A. L. Composition and properties of bovine colostrum: a review. Dairy Science and Technology. 96 (2), 133-158 (2016).
  13. Bastian, S. E. P., Dunbar, A. J., Priebe, I. K., Owens, P. C., Goddard, C. Measurement of betacellulin levels in bovine serum, colostrum and milk. Journal of Endocrinology. 168 (1), 203-212 (2001).
  14. Zhang, L., et al. Bovine milk proteome in the first 9 days: Protein interactions in maturation of the immune and digestive system of the newborn. PloS One. 10 (2), 0116710(2015).
  15. Godden, S. Colostrum management for dairy calves. The Veterinary clinics of North America. Food Animal Practice. 24 (1), 19-39 (2008).
  16. Larson, B. L., Heary, H. L., Devery, J. E. Immunoglobulin production and transport by the mammary gland. Journal of Dairy Science. 63 (4), 665-671 (1980).
  17. Ulfman, L. H., Leusen, J. H. W., Savelkoul, H. F. J., Warner, J. O., van Neerven, R. J. J. Effects of bovine immunoglobulins on immune function, allergy, and infection. Frontiers in Nutrition. 5, 52(2018).
  18. El-Loly, M. M. Bovine milk immunoglobulins in relation to human health. International Journal of Dairy Science. 2 (3), 183-195 (2007).
  19. Korhonen, H., Marnila, P., Gill, H. S. Milk immunoglobulins and complement factors. British Journal of Nutrition. 84 (1), 75-80 (2000).
  20. Arnold, R. R., Brewer, M., Gauthier, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: Sensitivity of a variety of microorganisms. Infection and Immunity. 28 (3), 893-898 (1980).
  21. Aisen, P., Listowsky, I. Iron transport and storage proteins. Annual Review of Biochemistry. 49 (1), 357-393 (1980).
  22. Zhao, X., et al. The in vitro protective role of bovine lactoferrin on intestinal epithelial barrier. Molecules. 24 (1), 148(2019).
  23. Chatterton, D. E. W., Smithers, G., Roupas, P., Brodkorb, A. Bioactivity of β-lactoglobulin and α-lactalbumin-Technological implications for processing. International Dairy Journal. 16 (11), 1229-1240 (2006).
  24. Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., Hunziker, P. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1526 (2), 131-140 (2001).
  25. Brück, W. M., et al. rRNA probes used to quantify the effects of glycomacropeptide and α-lactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 37 (3), 273-280 (2003).
  26. Indyk, H. E., Hart, S., Meerkerk, T., Gill, B. D., Woollard, D. C. The β-lactoglobulin content of bovine milk: Development and application of a biosensor immunoassay. International Dairy Journal. 73, 68-73 (2017).
  27. Swaisgood, H. E. Protein and amino acid composition of bovine milk. Handbook of Milk Composition. , 464-468 (1995).
  28. Seifu, E., Buys, E. M., Donkin, E. F. Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: A review. Trends in Food Science and Technology. 16 (4), 137-154 (2005).
  29. Wheeler, T. T., Hodgkinson, A. J., Prosser, C. G., Davis, S. R. Immune components of colostrum and milk-A historical perspective. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 12 (4), 237-247 (2007).
  30. Clare, D., Catignani, G., Swaisgood, H. Biodefense properties of milk: The role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9 (16), 1239-1255 (2003).
  31. Mehra, R., Marnila, P., Korhonen, H. Milk immunoglobulins for health promotion. International Dairy Journal. 16 (11), 1262-1271 (2006).
  32. Gapper, L. W., Copestake, D. E. J., Otter, D. E., Indyk, H. E. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (1), 93-109 (2007).
  33. Mettler, A. E. Utilization of whey by-products for infant feeding. International Journal of Dairy Technology. 33 (2), 67-72 (1980).
  34. Zenker, H. E., Raupbach, J., Boeren, S., Wichers, H. J., Hettinga, K. A. The effect of low vs. high temperature dry heating on solubility and digestibility of cow's milk protein. Food Hydrocolloids. 109, 106098(2020).
  35. Costa, F. F., et al. Microfluidic chip electrophoresis investigation of major milk proteins: Study of buffer effects and quantitative approaching. Analytical Methods. 6 (6), 1666-1673 (2014).
  36. Lönnerdal, B., Du, X., Jiang, R. Biological activities of commercial bovine lactoferrin sources. Biochemistry and Cell Biology. 99 (1), 35-46 (2021).
  37. Belanger, L., Sylvestre, C., Dufour, D. Enzyme-linked immunoassay for alpha-fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta. 48 (1), 15-18 (1973).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Engvall, E. The ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical Chemistry. 56 (2), 319-320 (2010).
  40. Kohl, T. O., Ascoli, C. A. Immunometric double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (6), (2017).
  41. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77 (7), 98-101 (2016).
  42. Abd El-Fattah, A. M., Abd Rabo, F. H. R., EL-Dieb, S. M., El-Kashef, H. A. Changes in composition of colostrum of Egyptian buffaloes and Holstein cows. BMC Veterinary Research. 8 (1), 19(2012).
  43. Newby, T. J., Stokes, C. R., Bourne, F. J. Immunological activities of milk. Veterinary Immunology and Immunopathology. 3 (1-2), 67-94 (1982).
  44. Chigerwe, M., et al. Comparison of four methods to assess colostral IgG concentration in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association. 233 (5), 761-766 (2008).
  45. Foley, J. A., Otterby, D. E. Availability, storage, treatment, composition, and feeding value of surplus colostrum: A review. Journal of Dairy Science. 61 (8), 1033-1060 (1978).
  46. Mechor, G. D., Gröhn, Y. T., McDowell, L. R., Van Saun, R. J. Specific gravity of bovine colostrum immunoglobulins as affected by temperature and colostrum components. Journal of Dairy Science. 75 (11), 3131-3135 (1992).
  47. Pritchett, L. C., Gay, C. C., Besser, T. E., Hancock, D. D. Management and production factors influencing immunoglobulin G1 concentration in colostrum from Holstein cows. Journal of Dairy Science. 74 (7), 2336-2341 (1991).
  48. Quigley, J. D., Martin, K. R., Dowlen, H. H. Concentrations of trypsin inhibitor and immunoglobulins in colostrum of Jersey cows. Journal of Dairy Science. 78 (7), 1573-1577 (1995).
  49. Bielmann, V., et al. An evaluation of Brix refractometry instruments for measurement of colostrum quality in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 93 (8), 3713-3721 (2010).
  50. A Ayar, A., Sıçramaz, H., Çetin, I. The effect of bovine colostrum on the lactic flora of yogurt and kefir. JSM Biotechnology and Biomedical Engineering. 3, 3-8 (2016).
  51. Sobaih, A., Zaki, D. A. Production of novel functional yoghurt fortified with bovine colostrum and date syrup for children. Alexandria Science Exchange Journal. 39, 651-662 (2018).
  52. Saalfeld, M. H., et al. Colostro: a redescoberta de um alimento saudável, nutritivo e com potencial probiótico. Agroecologia e Desenvolvimento Rural Sustentável. 5 (2), 18-24 (2012).
  53. Mouton, E., Aryana, K. J. Influence of colostrum on the characteristics of ice cream. Food and Nutrition Sciences. 06 (05), 480-484 (2015).
  54. Nazir, T., Pal, M. A., Manzoor, A. Effect of admixing varying levels of whole milk to the colostrum on the sensory quality of fermented colostrum product. International Journal of Advanced Research in Science, Engineering and Technology. 7 (4), 156-161 (2018).
  55. Korhonen, H. J. Bioactive milk proteins, peptides and lipids and other functional components derived from milk and bovine colostrum. Functional Foods. , 471-511 (2011).
  56. Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Analytical Biochemistry. 608, 113904(2020).
  57. Johnson, M. Protein quantitation. Materials and Methods. 2, 115(2012).
  58. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  59. Wang, R., et al. Sensitive immunoassays based on specific monoclonal IgG for determination of bovine lactoferrin in cow milk samples. Food Chemistry. 338, 127820(2021).
  60. Kazemi, M. G., Feizy, J. Overview of the important of ELISA technique and application in food industry. Analyzing Microbes. 4 (4), 19-25 (2020).
  61. Verma, J., Saxena, S., Babu, S. G. ELISA-based identification and detection of microbes. Analyzing Microbes. , 169-186 (2013).
  62. Minic, R., Zivkovic, I. Optimization, validation and standardization of ELISA. Norovirus. , (2020).
  63. Drijvers, J. M., Awan, I. M., Perugino, C. A., Rosenberg, I. M., Pillai, S. The enzyme-linked immunosorbent assay. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 119-133 (2017).
  64. Walker, A. Breast milk as the gold standard for protective nutrients. The Journal of Pediatrics. 156 (2), 3-7 (2010).
  65. Patel, K., Rana, R. Pedimune in recurrent respiratory infection and diarrhoea-The Indian experience-The PRIDE study. The Indian Journal of Pediatrics. 73 (7), 585-591 (2006).
  66. Saad, K., et al. Effects of bovine colostrum on recurrent respiratory tract infections and diarrhea in children. Medicine. 95 (37), 4560(2016).
  67. Buckley, J. D., Brinkworth, G. D., Abbott, M. J. Effect of bovine colostrum on anaerobic exercise performance and plasma insulin-like growth factor I. Journal of Sports Sciences. 21 (7), 577-588 (2003).
  68. Kotsis, Y., et al. A low-dose, 6-week bovine colostrum supplementation maintains performance and attenuates inflammatory indices following a Loughborough Intermittent Shuttle Test in soccer players. European Journal of Nutrition. 57 (3), 1181-1195 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eiwitconcentratiebioactieve eiwittenimmunoglobuline GlactoferrineconcentratieBCA assaySDS PAGEELISA assayeiwitisolatiegroeifactoren
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen