In Ovo Voeding van commerciële vleeskuikeneieren: een nauwkeurige en reproduceerbare methode om spierontwikkeling en -groei te beïnvloeden

Samenvatting

Een robuuste methodologie is ontwikkeld voor het uitvoeren van ovo-voedingsonderzoeksproeven met behulp van niet-geïncubeerde commerciële vleeskuikeneieren om het vermogen van natuurlijke en synthetische verbindingen, in dit geval nicotinamide riboside, te testen om spierontwikkeling en -groei te beïnvloeden.

Samenvatting

In de afgelopen drie decennia hebben wetenschappers van rood vlees en gevogelte zich gericht op het ontwikkelen van strategieën en technologieën om spierontwikkeling te manipuleren tijdens de embryonale en foetale ontwikkeling. Dit gebied blijft een aandachtsgebied omdat het aantal spiervezels in deze tijd wordt vastgesteld en de basis vormt voor alle toekomstige groei. Bij pluimvee toonden talrijke studies aan dat in ovo-voeding van groeifactoren, vitamines of andere voedingsstoffen de embryonale spier- en darmontwikkeling van het kuiken verbeterden. Verbetering van de spierontwikkeling van ovo kan de pluimvee-industrie ten goede komen door mogelijk de vleesopbrengst, groeisnelheid of myopathieomstandigheden te beïnvloeden. In de afgelopen vijf jaar ontwikkelde het Gonzalez-laboratorium aan de Universiteit van Georgia een nicotinamide riboside in ovo-voedingsmethodologie voor vleeskuiken-kipembryo's, die de spierontwikkeling veranderde. Wanneer geïnjecteerd in de dooierzak van een zich ontwikkelend embryo, verhoogde nicotinamide riboside het belangrijkste spiergewicht van pectoralis en de spiervezeldichtheid bij het uitkomen. Dit protocol zal een methodologie demonstreren om nauwkeurig en reproduceerbaar uit te voeren in ovo-voedingsstudies met behulp van commerciële standaard- en hoogproductieve vleeskuikenembryo's. Deze gegevens en methoden zullen andere onderzoeksgroepen in staat stellen om met veel succes en reproduceerbaarheid ovo-voedingsstudies uit te voeren.

Inleiding

Sinds 1960 is de consumptie van vlees van pluimvee door de Verenigde Staten per hoofd van de bevolking in een verbazingwekkend tempo gestegen, terwijl andere primaire eiwitbronnen stagneren, dalen of minimaal zijn toegenomen. De pluimvee-industrie investeerde veel tijd en onderzoeksinspanningen in het optimaliseren van voeding en genetica om een efficiënte vogel te produceren om de vraag bij te houden. Omdat het belangrijkste doel van de pluimvee-industrie is om spieren te produceren voor omzetting in vlees, hebben hun inspanningen de ultieme spiermassa van de vogel bij de oogst drastisch veranderd.

Zoals de meeste soorten ontwikkelt pluimvee spieren op een bifasische manier. Primaire myogenese maakt gebruik van mesenchymale stamcellen om primaire spiervezels te produceren, die dienen als de steiger voor de tweede golf van spiervezelontwikkeling¹. Bij pluimvee vindt primaire myogenese plaats tijdens embryonale dagen 3 tot 8 en secundaire myogenese vindt plaats van dag 8 tot 21². Eenmaal ontwikkeld, dienen primaire en secundaire spiervezels als basis voor alle toekomstige spiergroei door cellulaire hypertrofie. Daarom hebben wetenschappers en de industrie aanzienlijke inspanningen geleverd om primaire en secundaire myogenese in alle vleesproducerende soorten te manipuleren om de vleesopbrengst te maximaliseren.

Een technologie die wordt onderzocht bij pluimvee, genaamd ovo-voeding, omvat het voeren van verbindingen door middel van injectie. In ovo-voeding, een technologie die al bijna 40 jaar door de pluimvee-industrie wordt gebruikt, werd aanvankelijk ontwikkeld voor toediening van^{vaccins 3}. De literatuur documenteert dat in ovo voeding van verschillende verbindingen en voedingsstoffen op verschillende ontwikkelingsperioden en locaties in het ei positief beïnvloed in ovo spierontwikkeling en groei ^4,5,6. Tot op heden is het Gonzalez Laboratory aan de Universiteit van Georgia de pionier in het gebruik van nicotinamide riboside in ovo-voeding om de spierontwikkeling van pluimvee te manipuleren.

Nicotinamide riboside, een pyridine-nucleoside analoog van vitamine B3, produceert NAD+ via de bergingsroute⁷. Omdat deze route minder enzymatische stappen gebruikt om NAD + te produceren, is de productie de meest efficiënte⁸. Gonzalez en Jackson⁹ toonden aan dat suppletie van het ontwikkelen van vleeskuikenem embryo dooier zak met nicotinamide riboside verhoogde gearceerde kuiken pectoralis major spiergewicht en spiervezeldichtheid. Dit werd later bevestigd door Xu et ^al.10, die vonden dat het verhogen van de dosis nicotinamide riboside het spiergewicht verhoogde en de spiervezeldichtheid verhoogde. Deze eerste twee studies werden uitgevoerd in een commerciële opbrengstkuiken. Omdat vleeskuikens met een hoge opbrengst een significanter genetisch potentieel hebben voor de uiteindelijke spiermassagrootte, was het doel van de studie om de effecten van nicotinamide riboside dosis op hoogproductieve vleeskuiken uitgekomen kuiken pectoralis belangrijke spierontwikkeling en groei bij het uitkomen te bepalen.

Protocol

Alle methodologieën werden goedgekeurd door de University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Ei-incubatie en behandelingstoediening

1. Toewijzing van eieren en behandeling
   1. Verkrijg niet-geïncubeerde, bevruchte vleeseieren met een hoge opbrengst en transporteer ze naar het laboratorium.
   2. Inspecteer en gooi eieren weg die als van slechte kwaliteit worden beschouwd.
      OPMERKING: Elimineer misvormde eieren (rond, langwerpig, plakzijdig), gebarsten, vies / gekleurd, dun gepeld en gerimpeld. Dit is belangrijk om het risico op rotte eieren te minimaliseren.
   3. Wijs individuele einummers toe, weeg en noteer eiernummers en -gewichten in een spreadsheetsoftwareprogramma.
   4. Gebruik het spreadsheetsoftwareprogramma om eieren op gewicht te sorteren.
      1. Markeer de kolommen einummer en eigewicht .
      2. Selecteer het tabblad Gegevens en sorteer vervolgens gegevens op eiergewicht van klein naar grootst.
         OPMERKING: Gebruik voor de beste uitkomsten eieren met een gewicht tussen 40 en 70 g.
      3. Op basis van de opzet van het experiment, wijs eieren (numeriek of alfabetisch) een injectiebehandeling en dag van euthanasie toe. Voer het behandelingsnummer en de dag van euthanasie in afzonderlijke kolommen in en wijs deze factoren willekeurig toe binnen elke laag.
         OPMERKING: Voor deze publicatie werden behandelingen willekeurig toegewezen binnen elke 8-ei lagen.
   5. Genereer een draaitabel in het spreadsheetsoftwareprogramma om ervoor te zorgen dat elke behandeling vergelijkbare starteigewichten heeft.
      1. Markeer alle gegevens in de spreadsheet die moeten worden geanalyseerd.
      2. Selecteer de optie Draaitabel onder tabblad Invoegen .
      3. Selecteer de onafhankelijke variabele (kolom Euthanasiedag ) in het subvenster Draaitabelvelden en sleep naar het veld Rijen .
      4. Selecteer de onafhankelijke variabele (kolom Behandeling ) in het subvenster B en sleep naar het veld Rijen , onder Dag van euthanasie.
      5. Selecteer de afhankelijke variabele (Eigewicht) en sleep deze naar het veld Waarden .
      6. Wijzig de instellingen van het waardeveld door op de afhankelijke variabele te klikken en Instellingen waardeveld te selecteren.
         1. Wijzig de instelling in Gemiddeld.
2. Tray toewijzing
   1. Wijs in het spreadsheetsoftwareprogramma eieren toe aan een lade (numeriek of alfabetisch), zodat behandelingen gelijkelijk worden weergegeven in een lade.
      1. Wijs de eerste vier eieren met toegewezen behandelingen toe aan lade 1. Wijs de volgende vier eieren toe aan lade 2 en ga door totdat alle eieren aan een lade zijn toegewezen.
         OPMERKING: Deze stap is afhankelijk van het aantal incubators en trays dat in het experiment is gebruikt.
3. Zorg ervoor dat alle behandelingen gelijk zijn weergegeven in een lade met behulp van de draaitabelfunctie .
   1. Markeer alle gegevens in de spreadsheet die moeten worden geanalyseerd.
   2. Selecteer de optie Draaitabel op het tabblad Invoegen .
   3. Selecteer de onafhankelijke variabele (kolom Lade ) in het subvenster Draaitabelvelden en sleep naar het veld Rijen .
   4. Selecteer de afhankelijke variabele (Eigewicht) en sleep deze naar het veld Waarden .
   5. Wijzig de instellingen van het waardeveld door op de afhankelijke variabele te klikken en Instellingen waardeveld te selecteren.
      1. Wijzig de instelling in Tellen.
4. Incubatie
   1. Leg de eieren in de juiste incubatiebak en incubeer ze bij 26,6 °C met 40% ± 4% relatieve vochtigheid gedurende 6 uur.
      OPMERKING: Sommige incubators hebben zelfcontrolesystemen die mogelijk niet helemaal nauwkeurig zijn. Gebruik andere temperatuur- en vochtigheidsbewakingsapparatuur om de omstandigheden te regelen.
   2. Verhoog de temperatuur van de incubator tot 37 °C met 40% ± 4% relatieve vochtigheid en handhaaf deze omstandigheden tot incubatiedag 18.
      1. Om de juiste incubatortemperatuur te garanderen, meet u tweemaal daags de oppervlaktetemperaturen van verschillende eieren in de incubator met een thermische oppervlaktethermometer om ervoor te zorgen dat de oppervlaktetemperaturen 37 °C zijn.
   3. Draai eieren elk uur om te herpositioneren.
   4. Registreer dagelijks het gewicht van eieren om 10% -12,5% ei-gewichtsverlies te garanderen tijdens de eerste 18,5 dagen van incubatie.
      OPMERKING: Als gewichtsverlies niet binnen het gewenste bereik ligt, pas dan de luchtvochtigheid aan (verhoog of verlaag deze).
5. Incubatie dag-10 bij ovo-injecties
   1. Bereken de hoeveelheid nicotinamide riboside die nodig is voor elke behandeling met behulp van het formulegewicht van 290,07 g/mol, waarbij 100 μL oplossing in de dooierzak van elke eieren wordt geïnjecteerd.
      OPMERKING: Steriele zoutoplossing (0,9%) oplossing zal worden gebruikt als verdunningsmiddel voor alle oplossingen.
      Berekening: 50 eieren × 100 μL = 5.000 μL (5 ml) oplossing nodig. Rond af tot 6 ml om ervoor te zorgen dat er voldoende oplossing beschikbaar is voor injectie (figuur 1).
      1. Zodra de oplossingen zijn gemaakt, plaatst u ze in een waterbad van 37 °C om ze op de temperatuur van de eieren te houden.
   2. Verwijder de eieren één bakje per keer uit de broedmachine en dek af met een warme handdoek.
   3. Kaarsei om de dooierzak te lokaliseren en het injectiegebied schoon te maken met 70% ethanol.
   4. Plaats een steriele 20 G, 2,54 cm hypodermische naald ~ 1 cm in de eierschaal en injecteer de toegewezen dosis in de dooierzak. Injecteer de eieren van de 0 mM nicotinamide riboside behandeling met 100 μL steriele zoutoplossing (0,9%).
   5. Bedek de injectieplaats onmiddellijk met een klein stukje absoluut waterdichte tape om overmatig vochtverlies te voorkomen.
   6. Zodra alle eieren hun behandeling hebben gekregen, plaatst u de lade terug in de broedmachine.
   7. Verwijder op incubatiedag 18 eieren uit trays en plaats ze in broeddozen volgens hun behandelingen.
   8. Plaats broedkasten in de broedmachine en verhoog de luchtvochtigheid tot 60 ± 2% totdat alle eieren uitkomen of tot dag 23 van de incubatie.
      OPMERKING: Als eieren geen embryo bevatten bij het inblikken, gooi het ei dan weg. Dit voorkomt het optreden van rotte eieren.

2. Euthanasie en pectoralis grote spiermonsterverzameling

1. Kuikeneuthanasie
   1. Verwijder op incubatiedag 18 de embryonale eieren uit de broedmachine en plaats ze gedurende 1 uur op kamertemperatuur om het metabolisme te stoppen. Verwijder de embryo's uit de eieren, weeg zonder de dooierzak en onthoofd vervolgens. 12 uur na het uitkomen, euthanaseer de kuikens door blootstelling aan CO₂ gedurende 10 minuten, weeg, verzamel snel kroon-tot-romplengtemeting en onthoofd vervolgens.
      LET OP: Het feit dat de vogel zijn kop niet meer heeft zorgt voor euthanasie.
   2. Overweeg de volgende metingen (stappen 2.1.2.1-2.1.2.4) met behulp van digitale remklauwen voor embryo's en kuikens.
      1. Voor het bepalen van de kroon-tot-romplengte, leg het kuiken op zijn zij met zijn hoofd naar beneden en poten onder zijn lichaam. Meet van de bovenkant van de kop tot de staart.
      2. Om de hoofdbreedte te meten, meet u van het ene oorgat naar het andere oorgat.
      3. Meet voor het bepalen van de hoofdlengte vanaf de achterkant van de snavel tot de achterkant van de schedel.
      4. Neem een niet-elastisch touwtje en wikkel het rond de schedel van het ene oorgat naar het andere om de hoofdomtrek te meten. Plaats een tekenreeks op een metrische liniaal om een meting te verkrijgen.
   3. Verzamel de borstomtrek door een touw rond de borst te wikkelen, onder waar de vleugels contact maken met het lichaam en de snaar op een metrische liniaal te plaatsen om de meting te verkrijgen.
   4. Spuit borsten met 70% ethanol en trek met behulp van vingers aan de veren en de huid om de belangrijkste spieren van de borstkas te onthullen en neem de metingen (stappen 2.1.4.1-2.1.4.2) met digitale remklauwen.
      1. Om de borstbreedte te bepalen, meet u over de borst waar de vleugels contact maken met het lichaam.
      2. Meet voor het bepalen van de borstlengte vanaf de onderkant van het sleutelbeen tot de bovenkant van het vetkussen.
2. Extractie van pectoralis major spier, meting en verzameling
   1. Gebruik een chirurgische schaar of scalpel en een tang om de rechter borstspier te verwijderen door langs het kielbot te snijden en de spier los te maken van de lichaamswand.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de kleine musculus pectoralis niet verzamelt door visueel te identificeren dat de spier op de ribbenkast blijft.
   2. Nadat u de hoofdspier van de borst heeft verwijderd, legt u de spier plat op een ijslollystok en verzamelt u de volgende metingen (stappen 2.2.2.1-2.2.2.3) met behulp van digitale remklauwen.
      1. Voor het bepalen van de spierlengte, meet van de schedel tot het caudale deel van de spier.
      2. Voor het bepalen van de spierbreedte meet u op het breedste deel van het schedelgedeelte van de spier.
      3. Voor het bepalen van de spierdikte pak je de borst op met een tang en meet je op het dikste deel van het schedelgedeelte van de spier.
   3. Bewaar deze spier en de linker borstspier indien gewenst voor verdere analyses (zoals histologie, eiwit- en genexpressie, enz.) bij -80 °C gedurende maximaal een jaar.

3. Statistieken

1. Analyseer de gegevens als een volledig gerandomiseerd ontwerp met ei / kuiken als de experimentele eenheid.
   OPMERKING: Nicotinamide riboside dosis (DOS) diende als het vaste effect. Alle gegevens werden geanalyseerd met een softwareprogramma voor statistische analyse (zie Tabel met materialen) en paarsgewijze vergelijkingen tussen de kleinste kwadratische behandelingsmiddelen werden berekend. De verschillen werden significant geacht bij P < 0,05.

Resultaten

Er waren geen DOS-effecten voor het lichaamsgewicht van dag-18 embryo's en uitgekomen kuikens (P > 0,52; Figuur 2). Er waren geen DOS-effecten voor alle dag-18 embryo pectoralis major spiermetingen (P > 0,24; Figuur 3). Er waren geen DOS-effecten voor uitgekomen kuiken pectoralis major spierlengte- en breedtemetingen (P > 0,26); DOS had echter wel invloed op het spiergewicht en de diepte (P < 0,03;

Discussie

Tot op heden is het Gonzalez-laboratorium aan de Universiteit van Georgia de enige groep die positieve effecten van nicotinamide riboside in ovo aangeeft die zich voeden met de belangrijkste spierontwikkeling en -groei van pectoralis . De eerste studie wees uit dat bij ovo-voeding van 250 mM nicotinamide riboside het spiergewicht en de afmetingen verhoogde wanneer geïnjecteerd in de dooierzak⁹. In de vervolgstudie verhoogde het injecteren van de toenemende dosis nicotina...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch	Fisher Scientific	14-817-208	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword=
Analytical Balance	VWR	VWR-214B2	https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances
Complete Dissection Set	DOCAZON	DK1001	https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3
Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD02	https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020
Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword=
HIGH INTENSITY EGG CANDLER	Titan Incubators	N/A	https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity
Infrared Forehead Thermometer	HALIDODO	XZ-001
Microsoft Excel	Microsoft	N/A
Neiko Tools Digital Caliper	Neiko Tools	01408A	https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1
Nexcare Absolute Waterproof Tape	Nexcare Brand	732	https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud
Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display	Omega	OM-HL-SP-TH	https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series
SAS 9.4 for Windows	SAS Institute	N/A	https://www.sas.com/en_us/home.html
Sportsman 1502 Incubator	GQF Manufacturing	1502	https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/
Tru Niagen (Nicotinamide riboside)	ChromaDex, Inc.	N/A	https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product
Wood Craft Sticks	Creatology	M20001547	https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html