Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63013

⸱

27 september 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Samenvatting

Rollende adhesie, vergemakkelijkt door selectin-gemedieerde interacties, is een zeer dynamische, passieve beweeglijkheid bij het rekruteren van leukocyten naar de plaats van ontsteking. Dit fenomeen treedt op in postcapillaire venules, waar de bloedstroom leukocyten in een rollende beweging op de endotheelcellen duwt. Stabiel rollen vereist een delicaat evenwicht tussen de vorming van hechtingsbindingen en hun mechanisch aangedreven dissociatie, waardoor de cel aan het oppervlak vast kan blijven zitten tijdens het rollen in de stroomrichting. In tegenstelling tot andere hechtingsprocessen die plaatsvinden in relatief statische omgevingen, is de rolhechting zeer dynamisch omdat de rollende cellen over duizenden micron reizen met tientallen micron per seconde. Bijgevolg zijn conventionele mechanobiologische methoden zoals tractiekrachtmicroscopie ongeschikt voor het meten van de individuele adhesiegebeurtenissen en de bijbehorende moleculaire krachten vanwege de korte tijdschaal en hoge gevoeligheid die vereist is. Hier beschrijven we onze nieuwste implementatie van de adhesievoetafdruktest om de P-selectine in beeld te brengen: PSGL-1-interacties bij rollende adhesie op moleculair niveau. Deze methode maakt gebruik van onomkeerbare DNA-gebaseerde spanningsmeter-tethers om een permanente geschiedenis van moleculaire adhesiegebeurtenissen te produceren in de vorm van fluorescentiesporen. Deze sporen kunnen op twee manieren worden afgebeeld: (1) het samenvoegen van duizenden diffractie-beperkte beelden om een groot gezichtsveld te produceren, waardoor de adhesievoetafdruk van elke rollende cel over duizenden micron lang kan worden geëxtraheerd, (2) DNA-PAINT uitvoeren om superresolutiebeelden van de fluorescentiesporen binnen een klein gezichtsveld te reconstrueren. In deze studie werd de adhesievoetafdruktest gebruikt om HL-60-cellen te bestuderen die rollen bij verschillende schuifspanningen. Daarbij konden we de ruimtelijke verdeling van de P-selectine: PSGL-1 interactie in beeld brengen en inzicht krijgen in hun moleculaire krachten door fluorescentie-intensiteit. Deze methode vormt dus de basis voor het kwantitatieve onderzoek van de verschillende cel-oppervlakte-interacties die betrokken zijn bij de roladhesie op moleculair niveau.

Inleiding

De rollende adhesiecascade beschrijft hoe circulerende cellen aan de bloedvatwand vastklampen en langs de bloedvatwand rollen1. Passief rollen wordt voornamelijk gemedieerd door selectins, een belangrijke klasse van cellulaire adhesiemoleculen (CAMs)1. Onder de schuifstroom van bloed vormen leukocyten die P-selectine glycoproteïneligand-1 (PSGL-1) tot expressie brengen, zeer voorbijgaande bindingen met P-selectine, die tot expressie kunnen komen op het oppervlak van ontstoken endotheelcellen. Dit proces is van cruciaal belang voor leukocyten om te migreren naar een plaats van ontsteking2. Bovendien is PSGL-1 ook een mechanosensitieve receptor die in staat is om de daaropvolgende stevige adhesiefase van de rollende adhesiecascade te activeren bij zijn betrokkenheid bij P-selectin3.

Genetische mutaties die de CAM-functie beïnvloeden, kunnen het immuunsysteem ernstig beïnvloeden, zoals bij de zeldzame ziekte van leukocytenadhesiedeficiëntie (LAD), waar storing van adhesiemoleculen die het rollen bemiddelen, leidt tot ernstig immuungecompromitteerde individuen4,5,6. Bovendien is aangetoond dat circulerende tumorcellen migreren volgens een vergelijkbaar rollend proces, wat leidt tot metastase7,8. Omdat celrollen echter snel en dynamisch is, zijn conventionele experimentele mechanobiologische methoden niet geschikt voor het bestuderen van moleculaire interacties tijdens het rollen van cellen. Hoewel manipulatiemethoden met één cel en één molecuul, zoals atoomkrachtmicroscopie en optisch pincet, moleculaire interacties zoals de krachtafhankelijke interactie van P-selectine met PSGL-1 op het niveau van één molecuul9 konden bestuderen, zijn ze niet geschikt voor het onderzoeken van live adhesiegebeurtenissen tijdens het rollen van cellen. Bovendien kan de in vitro gekarakteriseerde interactie de vraag over moleculaire adhesie in vivo niet direct beantwoorden. Welk moleculair spanningsbereik is bijvoorbeeld biologisch relevant wanneer cellen in hun oorspronkelijke omgeving functioneren? Computationele methoden zoals lijmdynamicasimulatie10 of eenvoudig steady-state model11 hebben bepaalde moleculaire details vastgelegd en hoe ze het rolgedrag beïnvloeden, maar zijn sterk afhankelijk van de nauwkeurigheid van de modelleringsparameters en aannames. Andere technieken zoals tractiekrachtmicroscopie kunnen krachten detecteren tijdens celmigratie, maar bieden onvoldoende ruimtelijke resolutie of kwantitatieve informatie over moleculaire spanning. Geen van deze technieken kan directe experimentele observaties bieden van de temporele dynamica, ruimtelijke verdeling en magnitude heterogeniteit van moleculaire krachten, die rechtstreeks verband houden met celfunctie en gedrag in hun oorspronkelijke omgeving.

Daarom is het implementeren van een moleculaire krachtsensor die in staat is om selectin-gemedieerde interacties nauwkeurig te meten cruciaal voor het verbeteren van ons begrip van rollende adhesie. Hier beschrijven we het protocol voor de adhesievoetafdruktest12 waarbij PSGL-1 gecoate kralen worden gerold op een oppervlak dat p-selectin gefunctionaliseerde spanningsmeter tethers (TGT's) presenteert13. Deze TGT's zijn onomkeerbare DNA-gebaseerde krachtsensoren die resulteren in een permanente geschiedenis van breukgebeurtenissen in de vorm van fluorescentie-uitlezing. Dit wordt bereikt door het scheuren van de TGT (dsDNA) en vervolgens het labelen van de gescheurde TGT (ssDNA) met een fluorescerend gelabelde complementaire streng. Een groot voordeel van dit systeem is de compatibiliteit met zowel diffractie-beperkte als superresolutie beeldvorming. De fluorescerend gelabelde complementaire streng kan permanent gebonden zijn (>12 bp) voor diffractie-beperkte beeldvorming of tijdelijk gebonden (7-9 bp) voor superresolutie beeldvorming via DNA PAINT. Dit is een ideaal systeem om de rolhechting te bestuderen, omdat de TGT's tijdens actief rollen worden gescheurd, maar de fluorescentie-uitlezing na het rollen wordt geanalyseerd. De twee beeldvormingsmethoden bieden de gebruiker ook meer vrijheid om rolhechting te onderzoeken. Doorgaans is diffractie-beperkte beeldvorming nuttig voor het extraheren van moleculaire breukkracht door fluorescentie-intensiteit13, terwijl superresolutiebeeldvorming kwantitatieve analyse van receptordichtheid mogelijk maakt. Met de mogelijkheid om deze eigenschappen van rolhechting te onderzoeken, biedt deze aanpak een veelbelovend platform voor het begrijpen van het krachtregulatiemechanisme op de moleculaire adhesie van rollende cellen onder schuifstroom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Oligonucleotide labeling en hybridisatie

  1. Vermindering van eiwit G-disulfidebindingen
    1. Los 10 mg eiwit G (ProtG) op in 1 ml ultrapuur water.
      OPMERKING: Het eiwit G wordt hier gemodificeerd met een enkel cysteïneresidu aan de C-terminus en een N-terminus poly-histidine-tag.
    2. Bufferuitwisseling ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) in 1x PBS (pH 7,2) met een P6-kolom.
    3. Meet de eiwitconcentratie na bufferuitwisseling.
      OPMERKING: Typische concentratie van 7-8 mg / ml.
    4. Bereid 120 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) door 3 mg TCEP op te lossen in 90 μL van 1x PBS (pH 7,2) gevolgd door 10 μL van 0,5 M EDTA.
      OPMERKING: TCEP moet vers worden bereid.
    5. Voeg 4 μL van 120 mM TCEP (480 nmol) toe aan 20 μL ProtG (4-5 nmol).
      OPMERKING: Streef naar een molaire verhouding van ~ 100: 1 TCEP tot eiwit.
    6. Laat de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) doorgaan.
    7. Verwijder overtollige TCEP uit de gereduceerde ProtG met een P6-kolom (buffer uitgewisseld in 1x PBS, pH 7,2).
    8. Meet de concentratie van de gereduceerde ProtG met een UV/Vis spectrofotometer en sla de spectra op.
      OPMERKING: Typische concentratie van 3,5-4,5 mg / ml.
  2. Amine-gelabelde ssDNA-reactie met Sulfo-SMCC
    1. Los amine-gelabeld ssDNA (amine-ssDNA) op in nucleasevrij water tot een concentratie van 1 mM. Controleer de strengconcentratie met een UV/Vis-spectrofotometer.
    2. Bereid 11,5 mM sulfo-SMCC (een hetero-bifunctionele crosslinker met sulfo-NHS ester en maleimide) oplossing vers door 2 mg sulfo-SMCC op te lossen in 400 μL ultrapuur water en vortex om te mengen.
    3. Voeg 6 μL van het 1 mM amine-ssDNA (6 nmol) toe aan 5,2 μL van 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) en 88,8 μL van 1x PBS (pH 7,2). Vortex gedurende 5 s gevolgd door centrifugatie bij 8600 x g gedurende 3 min.
    4. Laat de reactie 30 minuten doorgaan bij RT.
    5. Verwijder overtollig sulfo-SMCC uit het SMCC geconjugeerde amine-ssDNA (mal-ssDNA) met een P6-kolom (buffer uitgewisseld in 1x PBS, pH 7,2).
    6. Meet de concentratie van het mal-ssDNA met een UV/Vis-spectrofotometer en sla de spectra op.
      OPMERKING: Typische concentratie van 35-45 μM.
  3. ProtG-ssDNA-vervoeging
    1. Voeg 21 μL van 4,5 mg /ml gereduceerde ProtG (3 nmol) toe aan het mal-ssDNA (~ 4-5 nmol).
      OPMERKING: Volumes en concentraties zijn hier typische waarden. Pas aan volgens individuele experimentele meting. Zorg altijd voor een teveel aan mal-ssDNA ten opzichte van ProtG in een verhouding van ~1,5:1.
    2. Vortex gedurende 5 s en laat de reactie 3 uur doorgaan bij RT.
  4. ProtG-ssDNA zuivering en karakterisering
    1. Zuiver de geconjugeerde ProtG-ssDNA door zijn-tag isolatie met magnetische nikkel-nitrilotriacetinezuur (Ni-NTA) kralen.
    2. Verwijder overtollig imidazool (Ni-NTA-elutiebuffer) uit het product met een P6-kolom (buffer uitgewisseld in 1x PBS, pH 7,2).
      OPMERKING: Deze stap is essentieel voor het kwantificeren van de conjugatie, omdat imidazool een significante absorptie heeft bij 280 nm.
    3. Gebruik een UV/Vis-spectrofotometer om de spectra van het product ProtG-ssDNA en de Ni-NTA-elutiebuffer (1x) vast te leggen.
      OPMERKING: De typische ProtG-ssDNA-absorptie bij 260 nm en 280 nm is respectievelijk 0,8 en 0,6.
    4. Om de conjugatie-efficiëntie en -verhouding van ProtG tot ssDNA te bepalen, gebruikt u het op maat geschreven MATLAB-script (Supplemental Coding File 1) om het uiteindelijke productspectrum te ontbinden op basis van de drie eerder verzamelde spectra (ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA bead elution buffer).
      OPMERKING: In het kort werkt de code zoals beschreven in stappen 1.4.5-1.4.8. De typische concentratie is 4 μM ProtG-ssDNA met ProtG en ssDNA bij een molaire verhouding van ~1:1 (figuur 2A).
    5. Voer ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA-oplossingsbuffer en de ProtG-ssDNA UV/Vis-spectra in het MATLAB-script in
    6. Voer een multidimensionale ongelimiteerde niet-lineaire minimalisatie uit om de ProtG-ssDNA-spectra uit de bronspectra (ProtG, SMCC-streng en Ni-NTA-oplossingsbufferspectra) te reconstrueren
      OPMERKING: De minimalisatiefunctie voert drie transformatiefactoren uit, één voor elke bronspectra.
    7. Reconstrueer de ProtG-ssDNA spectra door de spectra te vermenigvuldigen met hun overeenkomstige factor en de getransformeerde bronspectra te combineren.
    8. Vermenigvuldig de beginconcentratie van de ProtG- en SMCC-streng met de overeenkomstige transformatiefactoren om de concentraties smcc-streng en protg in het ProtG-ssDNA-product te bepalen.
    9. (OPTIONEEL) Voer native PAGE uit volgens Figuur 2B om ervoor te zorgen dat elk onderdeel en elke stap werkt zoals verwacht.
  5. TGT hybridisatie
    1. Hybridiseer ProtG-ssDNA (bovenste streng) met gebiotinyleerde onderstreng in een molaire verhouding van 1,2:1 met concentraties van respectievelijk 240 nM en 200 nM in T50M5-buffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) om de volledige TGT-constructie te hybridiseren. Laat hybridiseren bij RT ≥1 uur.

2. Oppervlakte PEGylation

  1. Oppervlaktereiniging
    1. Reinig één Erlenmeyer en twee vlekkenpotten voor elke 8 dekplaten. Vul elke container met 1 M KOH-oplossing en soniceer gedurende 1 uur bij RT. Was elke container grondig met ultrapuur water en droog met N2 of in een oven.
      OPMERKING: Vul de KOH tot de bovenkant om het deksel aan te raken, zodat ze ook worden schoongemaakt.
    2. Spoel elke dekplaat grondig af met ultrapuur water en plaats ze in een van de gereinigde vlekkenpotten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat ze niet aan elkaar of aan de muur van de vlekkenpotten worden geplakt.
    3. Bereid in een zuurkast een piranha-oplossing door 30 ml waterstofperoxide (30%) toe te voegen aan 90 ml geconcentreerd (95% -98%) zwavelzuur in een bekerglas van 250 ml.
      LET OP: Geconcentreerd zwavelzuur is zeer corrosief. Voeg de waterstofperoxide heel langzaam toe aan het zwavelzuur en draai voorzichtig om te mengen.
    4. Dompel de dekzeilen volledig onder in de kleurpot met de piranha-oplossing. Laat coverslips in piranha 30 min in de zuurkast zitten.
      LET OP: Koel de piranha-oplossing af tot niet meer dan 80 °C voordat u gaat gieten om te voorkomen dat de vlekkenpot barst.
    5. Gooi de piranha-oplossing weg in een bekerglas van 1000 ml en neutraliseer met de 1 M KOH van glasreiniging.
    6. (OPTIONEEL) Herhaal piranhareiniging (stappen 2.1.3-2.1.5) met een verse piranha-oplossing.
    7. Spoel de coverslips af met overvloedige hoeveelheden ultrapuur water om alle resterende piranha-oplossing te verwijderen. Schud de vlekkenpot voorzichtig tijdens elke verhoging om het verwijderen te vergemakkelijken (10 spoelingen worden aanbevolen).
    8. Spoel de coverslips 3 keer af met methanol om water van het coverslipoppervlak te verwijderen en de coverslips ondergedompeld te houden in methanol.
  2. Oppervlakte silanisatie
    1. Bereid een 1% aminosilaanoplossing door 94 ml methanol, 1 ml aminosilaan en 5 ml ijsazijn grondig te mengen in de gereinigde en gedroogde Erlenmeyer. Giet in de tweede schoongemaakte en gedroogde vlekkenpot14.
    2. Breng de afgedekte de dekplaten ondergedompeld onder de methanoloplossing over in de kleurpot met 1% aminosilaanoplossing en houd de pot bedekt.
      OPMERKING: Laat de coverslips niet drogen tijdens het overbrengen naar aminosilaan om de blootstelling van het glasoppervlak aan lucht te beperken.
    3. Incubeer de kleurpot met coverslips in aminosilaan gedurende 1 uur bij 70 °C in een oven15.
    4. Gooi de aminosilaanoplossing voorzichtig weg in een aparte afvalcontainer en spoel de dekplaten in de kleurpot 5 keer met methanol om de aminosilaanoplossing te verwijderen.
    5. Spoel coverslips in de kleurpot 5 keer af met ultrapuur water en droog ze met N2.
    6. Bak de gedroogde dekplaatjes in de kleurpot in een oven op 110 °C gedurende 20 min. Laat de coverslips afkoelen tot RT en plaats ze vervolgens op het PEGylation-rek.
      OPMERKING: Bedek de vlekkenpot tijdens het bakken met een deksel om bepaalde en chemische afzetting op het oppervlak te minimaliseren15.
  3. Peg-oplossing voorbereiding
    1. Ontdooi PEG (polyethyleenglycol) en PEG-biotine tot RT gedurende ongeveer 30 min.
      OPMERKING: Deze stap minimaliseert vochtcondensatie die de NHS-ester op PEG kan afbreken.
    2. Maak PEG-buffer door 84 mg natriumbicarbonaat toe te voegen aan 10 ml ultrapuur water. Deze formulering moet een buffer bieden bij pH 8,4.
    3. Voor 8 coverslips, elk met één PEGylated kant met 20:1 PEG:PEG-biotine: meet 100 mg PEG en 5 mg PEG-biotine om toe te voegen aan 400 μL PEG-buffer. Vortex de oplossing voor 30 s en centrifugeer gedurende 1 min met de maximale snelheid (≥18000 x g).
      OPMERKING: Deze stap is tijdgevoelig, omdat de SVA NHS-esterhydrolyse onmiddellijk begint en een halfwaardetijd heeft van 34 minuten bij pH 8,0, met een kortere halfwaardetijd bij pH 8,4.
  4. PEG-incubatie en coverslip opslag
    1. Plaats de vochtigheidskamer en plaats de dekplaten erin.
    2. Voeg 90 μL PEG-oplossing toe aan een afdekplaat in de vochtkamer en plaats een tweede afdekplaat bovenop de PEG-oplossing met behulp van een afdekplaatpincet om de PEG-oplossing gelijkmatig te verdelen.
    3. Zorg ervoor dat er geen bubbels in de oplossing op de deklip vallen. Laat het ene uiteinde van de tweede coverslip op de eerste coverslip zakken en laat het andere uiteinde langzaam vallen, zodat er geen bubbels tussen de coverslips zitten.
      OPMERKING: Bubbels zullen ervoor zorgen dat bepaalde gebieden slecht PEGylated zijn.
    4. Herhaal dit totdat alle coverslips PEG hebben (d.w.z. 8 coverslips = 4 PEG sandwiches). Incubeer de PEG-oplossingen 's nachts (~ 12 uur) bij RT in een vochtigheidskamer in het donker16.
    5. Scheid de deklipparen en plaats ze in een vlekkenpot. Let op de PEGylated zijkanten.
    6. Spoel de coverslips grondig af met ultrapuur water en droog met N2.
      OPMERKING: Houd de afdekplaten vast met een pincet en blaas N2 over het oppervlak naar het pincet om te voorkomen dat verontreinigingen op het oppervlak drogen.
    7. Markeer de niet-PEGylated kant met een stip op een hoek met behulp van een permanente marker of een diamanten pen.
    8. Plaats 2 PEGylated coverslips in mailer tubes met de PEGylated zijden naar elkaar toe om de PEGylated kant te helpen identificeren voor gebruik.
    9. Stofzuig de buis gedurende 5 minuten en vul op met N2. Sluit de buis af met parafilm.
    10. Bewaar de PEGylated coverslips bij -20 °C in de verzegelde mailerbuizen gedurende maximaal 6 maanden.
      OPMERKING: Verwarm de opslagbuizen tot RT voordat de chip wordt gemonteerd. Condensatie op de coverslips tijdens het afdichten zal lekkage veroorzaken.

3. Voorbereiding van de stroomkamer

  1. Chip assemblage
    1. Verdeel een kleine hoeveelheid epoxy aan beide zijden van dubbelzijdige tape dun met een scheermesje.
      OPMERKING: Te veel epoxy kan zich tijdens de montage in het kanaal verspreiden.
    2. Lasergesneden de epoxy gecoate tape om 4 kanalen te creëren. Maak de flowchip door de epoxytape tussen een 4-gaats slide en PEG coverslip te sandwichen (Figuur 1A).
    3. Gebruik een pipetpunt en oefen zachte druk uit over de lengte van de kanalen om een goede afdichting te creëren. Laat de epoxy ≥1 uur uitharden.
      OPMERKING: Breek het glas niet om te voorkomen dat het tegen epoxy glijdt.
  2. Kamervergadering
    1. Lijn de chip zo uit dat de opening van elk kanaal zich in het midden van de adapter bevindt (figuur 1A). Plaats twee transparante acrylafstandhouders bovenop de chip, oefen stevige druk uit in het midden van het blok en schroef twee 4-40 schroeven in aan de uiteinden van elke afstandhouder.
      OPMERKING: Forceer de schroef niet en druk niet te hard op de afstandhouders, anders kan de chip barsten.
    2. Schroef aan de andere kant van de beugel de inlaten in de gaten met schroefdraad. Bewaak de afdichtingsconditie door het transparante acrylblok.
    3. Terwijl de slang contact maakt met de opening van de chip, sluit u de verbinding af door de slang voorzichtig met de klok mee te draaien.
      OPMERKING: Te strak aangeklede inlaten kunnen stroomverstopping veroorzaken, terwijl losse contacten lekkage veroorzaken.

4. Oppervlaktevoorbereiding

OPMERKING: Raadpleeg figuur 1B voor de algemene workflow.

  1. Blokkeringsagenten om niet-specifieke binding te voorkomen
    1. Gebruik een pipet om 200 μL wasbuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 en 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) in de kamer te laten stromen om te controleren op lekkage. Als er bubbels in het kanaal ontstaan, duw dan agressief nog eens 200 μL om de bubbels te verwijderen.
      OPMERKING: Grote luchtbellen die bij deze stap niet worden verwijderd, kunnen later losraken en de functionaliteit van het oppervlak vernietigen.
    2. Voeg 40 μL BSA (1% w/v) toe aan de stroomkamer om niet-specifieke binding te voorkomen en incubeer gedurende 10 minuten.
    3. Zorg ervoor dat u tijdens elke incubatieperiode voldoende volume toevoegt om de stroomkamers te vullen en druppels te vormen bij de in- en uitlaten. Pas de incubatievolumes dienovereenkomstig aan en voer alle incubaties uit in een vochtigheidskamer.
    4. Voeg 40 μL Tween 20 (5% v/v) toe aan de stroomkamer. Incubeer gedurende 10 minuten om de niet-specifieke binding verder te verminderen.
    5. (OPTIONEEL) Controleer het oppervlak op voldoende passivering door polystyreenparels door het kanaal te laten stromen. Voeg 40 μL ProtG gecoate polystyreen kralen (0,01% w /v) toe en beeld met een darkfield microscoop met 10x objectief. Als kralen zich niet aan het oppervlak hechten, gaat u verder met de volgende stap.
    6. Was het kanaal met 200 μL wasbuffer om alle passiveringsmiddelen te verwijderen.
  2. Functionalisering van het kameroppervlak
    1. Voeg 40 μL streptavidin (100 μg/ml) toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten. Was vervolgens met 200 μL wasbuffer.
    2. Voeg 40 μL gehybridiseerde ProtG-TGT (100 nM) toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten. Was vervolgens met een wasbuffer van 200 μL.
    3. Voeg gedurende 20 minuten 40 μL ProtG-TGT-bovenstreng (100 nM) toe om een ongehybridiseerde TGT-onderstreng op het oppervlak te voltooien. Wassen met 200 μL wasbuffer.
    4. Voeg 40 μL P-selectin-Fc (10 μg/ml) toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 60 minuten. Was vervolgens met 200 μL wasbuffer.
      OPMERKING: Incubatieduur is van cruciaal belang.

5. Experiment en beeldvorming

  1. Flow systeem instellen
    1. Vul een glazen spuit van 5 ml met de rolbuffer (HBSS met 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten door op de zijkanten van de spuit te tikken om de bubbels los te maken en ze naar buiten te duwen terwijl ze naar de punt drijven.
    2. Steek een steriele naald (26 G, 5/8 inch lengte) in een polyethyleenbuis van ~ 200 mm (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) en sluit de naald aan op de glazen spuit.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er nergens lucht in de naaldconnector wordt opgesloten.
    3. Bevestig de spuit op de spuitpomp en kantel de spuitpomp zodanig dat de zuigerzijde verhoogd is om te voorkomen dat luchtbellen het kanaal binnendringen. Steek het uiteinde van de buis in de inlaat van de stroomkamer.
      OPMERKING: Zorg voor contact tussen vloeistof en vloeistof bij het maken van de verbinding door druppels op de inlaten te deponeren en druppels aan het einde van de spuitbuis te hebben. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het kanaal komen door een kleine druppel op het uiteinde van de spuitbuis te laten vormen voordat u deze in de inlaat inbrengt.
    4. Steek het ene uiteinde van nog eens 200 mm van de polyethyleenbuis in de uitlaat en het andere uiteinde ondergedompeld in een afvalbeker.
  2. Instellen voor het rollen van cellen
    1. Kweek HL-60 cellen in 25 cm2 geventileerde kweekkolven in IMDM media aangevuld met 20% foetaal runderserum en 1% antibiotica bij 37 °C met 5% CO2. Houd celdichtheden tussen 1 x 105-2 × 106 cellen / ml.
    2. (OPTIONEEL) Differentieer de HL-60-cellen in een compleet IMDM-medium met 1,25% DMSO bij een initiële dichtheid van 2 x 105 cellen/ml. Incubate cellen om het meest actief te zijn gedurende 5-6 dagen.
    3. Neem een monster (1-2 ml) uit de celsuspensie en centrifuge (200 x g, 3 min) om de cellen te pelleteren.
    4. Verwijder het medium en resuspend de cellen voorzichtig in 500 μL van de rolbuffer. Herhaal de wasstap twee keer om cellulair vuil te verwijderen.
    5. Meet de celdichtheid met een hemocytometer. Resuspend de celkorrels met rolbuffer tot een dichtheid van 2 x 105 cellen/ml.
    6. Koppel de slang voorzichtig los van de inlaten/uitlaat en pipetteer 40 μL van de celsuspensie in de stroomkamer. Sluit de slang opnieuw aan zoals eerder beschreven, zorg ervoor dat er geen bellen in het stroomkanaal worden gebracht.
    7. Begin het celrolexperiment door de spuitpomp met de gewenste stroomsnelheden te starten.
      OPMERKING: De intensiteit van fluorescerende sporen is afhankelijk van de schuifspanning en een lagere celsnelheidsschuifspanning / celsnelheid zal over het algemeen dimmersporen produceren (figuur 4A). Vermijd een hoge celdichtheid op het oppervlak of een te lange rolduur om scheidbare eencellige sporen te garanderen (figuur 4B,C).
    8. Gebruik een darkfield microscoop met een 10x objectief om ervoor te zorgen dat het rollen van cellen wordt waargenomen.
    9. Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cellen uit het kanaal door de rolbuffer met 100 ml /h toe te voegen totdat het oppervlak celvrij is.
  3. Imaging local tracks by "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
    1. Voeg 40 μL DNA-PAINT imager streng (500 pM) in DNA-PAINT buffer (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) toe aan het kanaal.
    2. Voer total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie uit met behulp van een 100x olie-onderdompeling TIRF objectieflens. Verkrijg meer dan 40000 frames met een belichtingstijd van 25 ms per frame bij een elektronenvermenigvuldigende (EM) winst van 300 met behulp van een ELECTRON-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera.
    3. Gebruik Picasso-softwarepakket17 om de afbeeldingen met superresolutie (figuur 4D) te lokaliseren en weer te geven volgens stappen 5.3.4-5.3.5.
    4. Laad de DNA-PAINT-film in het localize-programma om de lokalisatie van elke fluorofoor in elk frame te bepalen.
      OPMERKING: Optimaliseer de lengte van de boxzijde en de parameters van min. nettogradiënt totdat alleen fluoroforen nauwkeurig worden bijgehouden. Min. Net Gradient parameter kan vaak boven de 100000 gaan om optimale tracking te bereiken. Fit setting: MLE, geïntegreerde Gaussische methode produceert het beste resultaat. Als de film te lang is, splits u deze ten slotte in stapels van 10000 frames zodat de voorvertoning in Localize correct werkt voordat u ze opnieuw combineert in een definitief hdf5-bestand.
    5. Laad vervolgens het resulterende hdf5-bestand in het renderprogramma om driftcorrectie en rendering uit te voeren.
      OPMERKING: Voer meerdere driftcorrecties uit via Undrift by RCC om het eindresultaat te verbeteren.
  4. Lange sporen in beeld brengen door permanente labeling
    1. Voeg de permanente imager-streng toe en incubeer gedurende 120 s in T50M5-buffer. Was het kanaal door 200 μL wasbuffer toe te voegen.
    2. Neem een afbeelding op met de excitatielaser uit om achtergrondcameraruis te verkrijgen. Stel een groot gebied in een rasterpatroon voor met TIRF-microscopie.
      OPMERKING: Frame-over-frame overlap van ≥10% wordt aanbevolen voor latere stiksels.
    3. Programmeer de microscoop om te scannen over het gebied van 400 x 50 afbeeldingen (20000 afbeeldingen in totaal). Met behulp van FIJI-programma, splits onbewerkte gegevens in individuele tiff-bestanden, elk met een maximum van 10000 afbeeldingen.
    4. Vlak alle afbeeldingen af met behulp van het verlichtingsprofiel (figuur 3A-C) volgens de stappen 5.4.5-5.4.7.
    5. Trek de achtergrondcameraruis van elk frame af. Verkrijg de gemiddelde stapelprojectie (verlichtingsprofiel) van elk frame met aftrek van de achtergrond.
    6. Normaliseer het verlichtingsprofiel met de maximale waarde. Deel elk frame dat op de achtergrond is afgetrokken door het genormaliseerde verlichtingsprofiel.
    7. Schaal de gecorrigeerde frames opnieuw naar het juiste bereik voor de bijbehorende bitdiepte.
    8. Gebruik MIST18 om de afbeeldingen te naaien (Figuur 3D,E).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedure van de adhesievoetafdruktest. De algemene experimentworkflow wordt geïllustreerd in figuur 1, van de assemblage van de stroomkamer (figuur 1A) tot de oppervlaktefunctionalisatie (figuur 1B) en experiment- en beeldvormingsstappen (figuur 1C).

Figuur 2 is een representatief resultaat v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De adhesievoetafdruktest maakt visualisatie mogelijk van de moleculaire adhesiegebeurtenissen tussen PSGL-1 en P-selectine tijdens celrollende adhesie. Dit proces wordt geïnitieerd door P-selectin-gemedieerde opname gevolgd door rollen onder vloeistofschuifspanning. Mogelijke problemen tijdens het experiment hebben meestal betrekking op slecht rollen van cellen of het missen van fluorescerende sporen, zelfs als cellen goed rollen. Deze problemen zijn vaak het gevolg van kwaliteitscontroles bij de kritieke stappen in het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) en het Eminence Fund van de University of British Columbia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-kanaals boorgidsOp maat gemaakt3D geprint met ABS-filament
4-gaten glijdingOp maat gemaaktBoor schone microscoopglazen met een Dremel met diamantgecoate boorkoppen op een 4-kanaals boorgids die een lay-out heeft die overeenkomt met de centra van de 8-32 draadgaten op de aluminium klem.
AcetonVWRBDH1101-4LP
Acrylen ruimtemakerOp maat gemaaktSnijd twee blokken van acrylplaten met de afmeting van 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Boor op elk blok twee 3 mm gaten die precies zijn uitgelijnd met de 4-40 gaten op de aluminium houder.
Aluminium chiphouderOp maat gemaaktMaal geanodiseerd aluminiumblok tot een C-vormige houder met de buitenafmetingen van 640 mm x 500 mm x 65 mm en de openingsafmetingen van 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlaten en uitlaten zijn getapt met 8-32 draad.
AminosilaneAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
Antibioticum/antimycotische oplossingCytiva HyCloneSV3007901Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG gecoat polystyreenSpherotechPGP-60-5
Bovien serum albumineVWR332
Buffer, DNA PAINT0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M510mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, RollingHBSS met 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1% BSA
Buffer, Wash10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 en 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20
CalciumchlorideVWRBDH9224
CelcultuurkolvenVWR10062-868
Geconcentreerd zwavelzuurVWRBDH3072-2.5LG95-98%
Dekglashoudende pincettenTechni-Tool758TW150
Diamantgecoate boorkoppenAbrasive TechnologyC52505100,75 mm diamantboor
DNA, amine-ssDNA (top streng)IDT DNAAangepaste oligoCCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (onderste streng)IDT DNAAangepaste oligo/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager streng voor DNA-PAINTIDT DNAAangepaste oligoGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager streng voor permanente labelIDT DNAAangepaste oligoCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Dubbelzijdige tapeScotch2373/4 inch breedte, permanente dubbelzijdige tape
EDTAThermofisher155750200,5 M EDTA, pH 8,0
EpoxyGorilla420015 minuten uithardingstijd
Foetaal bovien serum (FBS)Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
Glazuur azijnzuurVWRBDH3094-2.5LG
Glas, DekglazenFisher Scientific12-548-5P
Glas, MicroscoopglazenVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
Glas, KleurglamVWR74830-150Wheaton Kleurglam (900620)
Hanks' Balanced Salt-oplossing (HBSS)Lonza04-315Q
HemocytometerSigma-AldrichZ359629-1EA
HL-60 cellenATCCCCL-240
Luchtvochtigheidskamer glijondersteuningOp maat gemaakt3D geprint met ABS-filament
WaterstofperoxideVWRBDH7690-130%
ImidazoolSigma-AldrichI2399
Inlaten/uitlatenOp maat gemaaktBoor door acht 8-32 stelschroeven met kobaltboorkoppen. Plaats 1,5 cm  polyethyleen buis (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) in elke holle stelschroef
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)Lonza12-722F
MagnesiumchlorideVWRBDH9244
Magneet Ni-NTA kralenInvitrogen10103D
Mailer buizenEMSEMS71406-10
MethanolVWRBDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel KolommenBiorad7326200In SSC Buffer
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-biotineLaysan BioBiotin-PEG-SVA-5000
KaliumhydroxideVWR470302-132
Eiwit, Eiwit GAbcamab155724N-terminaal His-Tag en C-terminaal cysteïne
Eiwit, P-selectine-FcR&D System137-PSRecombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Eiwit, StreptavidinCedarlaneCL1005-01-5MG
Pomp SpuitHarvard Apparatus704801
NatriumbicarbonaatWard’s Science470302-444
NatriumchlorideVWR

Referenties

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Rollende adhesieP selectine PSGL 1DNA PAINT imagingspanningsmeter tetherflowkamer assemblagetotale interne reflectiefluorescentiemicroscopierollend celgedragmoleculaire adhesiekracht
Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.