Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63014

⸱

15 september 2021

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Samenvatting

Tijdens genexpressie omvat de vitale stap van pre-mRNA-splicing nauwkeurige herkenning van spliceplaatsen en efficiënte assemblage van spliceosomale complexen om exonen te verenigen en introns te verwijderen voorafgaand aan cytoplasmatische export van het volwassen mRNA. De splicingefficiëntie kan worden gewijzigd door de aanwezigheid van mutaties op spliceplaatsen, de invloed van trans-acterende splicingfactoren of de activiteit van therapeutica. Hier beschrijven we het protocol voor een cellulaire assay die kan worden toegepast voor het bewaken van de splicing-efficiëntie van een bepaald exon. De test maakt gebruik van een aanpasbare plasmide gecodeerde 3-exon / 2-intron minigene reporter, die kan worden uitgedrukt in zoogdiercellen door voorbijgaande transfectie. Posttransfectie wordt totaal cellulair RNA geïsoleerd en de efficiëntie van exon splicing in het reporter mRNA wordt bepaald door primer extension of semi-kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We beschrijven hoe de impact van ziekte geassocieerde 5′ splice-site mutaties kan worden bepaald door ze in de reporter te introduceren; en hoe de onderdrukking van deze mutaties kan worden bereikt door co-transfectie met U1 klein nucleair RNA (snRNA) construct met compenserende mutaties in zijn 5 ′-regio die basepairs met de 5′-splice sites op exon-intron juncties in pre-mRNA's. Zo kan de reporter worden gebruikt voor het ontwerpen van therapeutische U1-deeltjes om de herkenning van mutante 5′splice-sites te verbeteren. Het invoegen van cis-acterende regulerende sites, zoals splicing enhancer of silencer sequences, in de reporter kan ook worden gebruikt om de rol van U1 snRNP in regulatie te onderzoeken, gemedieerd door een specifieke alternatieve splicingfactor. Ten slotte kunnen reporter-expressiecellen worden geïncubeerd met kleine moleculen om het effect van potentiële therapieën op constitutieve pre-mRNA-splicing of op exonen met mutante 5′-spliceplaatsen te bepalen. Over het algemeen kan de reporter-test worden toegepast om de splicing-efficiëntie in verschillende omstandigheden te controleren om fundamentele splicing-mechanismen en splicing-geassocieerde ziekten te bestuderen.

Inleiding

Pre-mRNA splicing is een essentiële verwerkingsstap die niet-coderende introns verwijdert en nauwkeurig coderende exonen bindt om volwassen mRNA te vormen. Herkenning van consensussequenties op exon-intron juncties, aangeduid als 5′-splice site en 3′-splice site, door componenten van de splicing machinerie initieert het splicing proces. Het U1 kleine nucleaire ribonucleoproteïne (snRNP) herkent de 5′-splice site door base paring van het U1 snRNA aan het pre-mRNA1. Genetisch overgeërfde mutaties die 5′-splice site sequences veranderen, zijn geassocieerd met vele ziekten2,3. Er wordt voorspeld dat het verlies van basepairing van U1-snRNA met de mutante 5′-splice-sites afwijkende splicing veroorzaakt, wat de vertaling van het aangetaste transcript in gevaar kan brengen. Een mogelijke therapeutische benadering om de splicingdefecten te corrigeren, omvat onderdrukking van mutaties door gemodificeerd U1-snRNA met compenserende nucleotideveranderingen in het 5′-gebied dat basepairs met de 5′-spliceplaats. Dergelijke gemodificeerde U1-snRNA's, ook wel exonspecifieke U1-snRNA's genoemd, zijn effectief gebleken bij het omkeren van splicingdefecten, wat resulteert in verhoogde eiwitexpressie van het geredde mRNA4,5,6,7,8.

Hier beschrijven we de U1 snRNP-complementatietest, een op reporter gebaseerde cellulaire splicing-assay die een beoordeling mogelijk maakt van het effect van 5′-ss-mutaties op splicing van een exon en ook kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van gemodificeerde U1-snRNA's om de redding van exon-inclusie mogelijk te maken. We bieden ook protocollen voor het monitoren van de gesplitste reporter transcripties door primer extensie en RT-PCR, en voor het bepalen van de expressie van gemodificeerde U1 snRNA's door primer extensie en RT-qPCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Reagentia en buffers

OPMERKING: Alle sterilisatie met behulp van vacuümfilters moet worden uitgevoerd met 0,2 μm polyethersulfon (PES) membraan in een bioveiligheidskast.

  1. Bereid RNase-vrij water door 1,0 ml diethylpyrocarbonaat (DEPC) toe te voegen aan 1,0 l gedeïoniseerd water, meng gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (RT), autoclaaf tweemaal en koel vervolgens af tot RT voor gebruik.
  2. Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) voor door één pak DMEM-poeder (13,4 g), 3,7 g natriumbicarbonaat, 100 ml foetaal runderserum (FBS), penicilline en streptomycine te mengen tot ~ 800 ml steriel gedeïoniseerd water. De uiteindelijke concentratie penicilline en streptomycine in DMEM moet respectievelijk 50 E/ml en 50 μg/ml zijn. Stel de pH in op 7,4 en vul het volume vervolgens aan tot 1,0 L met steriel gedeïoniseerd water. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
  3. Bereid 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x PBS) door toevoeging van 25,6 g dinatriumwaterstofheptahydraat (Na2HPO4· 7H2O), 2 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4), 2 g kaliumchloride (KCl) en 80 g natriumchloride (NaCl) tot 800 ml gedeïoniseerd water. Meng om op te lossen en vul het volume aan tot 1,0 L. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
  4. Bereid 0,5 M ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) door 186,1 g Na2•EDTA•2H2O op te lossen in ~800 ml gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 8,0 en vul het volume vervolgens aan tot 1,0 l met steriel gedeïoniseerd water. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
  5. Bereid 1x trypsine-EDTA-oplossing door 100 ml 10x trypsine (2,5%), 2 ml 0,5 M EDTA te mengen en voeg 1x PBS toe tot 1,0 L. Steriliseer door filtratie en aliquot in conische buisjes van 50 ml. Bewaren bij 4 °C gedurende 1-2 weken of invriezen bij -20 °C voor langdurig gebruik.
  6. Bereid 2x formamide DNA/RNA-ladende kleurstof voor door 14,4 ml formamide en 0,6 ml 0,5 m EDTA te mengen voor een eindvolume van 15 ml. Voeg broomfenolblauw en xyleencylencylenpoeder toe tot een eindconcentratie van 0,02% en bewaar bij 4 °C.
    OPMERKING: Formamide is giftig en corrosief. Lees de veiligheidsinformatiebladen voor aanvullende veiligheidsaanbevelingen.
  7. Bereid 5x Tris / Boraat / EDTA (5x TBE) buffer door 54,0 g tris base, 27,5 g boorzuur en 20 ml 0,5 M EDTA te mengen in ~ 800 ml gedeïoniseerd water. Meng om op te lossen en vul het volume aan tot 1,0 L met gedeïoniseerd water.
  8. Bereid ureum-polyacrylamide gel elektroforese (ureum-PAGE) oplossing door 200 ml 5x TBE, 250 ml 40% 19:1 bis/acrylamide en 450,5 g ureum te mengen. Voeg vervolgens gedeïoniseerd water toe tot 1,0 L. Meng totdat de ingrediënten volledig zijn opgelost, steriliseer vervolgens door filtratie en bewaar bij 4 °C in een amberkleurige glazen fles.
    OPMERKING: Bis/acrylamide is giftig. Lees de veiligheidsinformatiebladen voor aanvullende veiligheidsprocedures.
  9. Bereid 10% ammoniumperssulfaat (APS) door 1 g APS op te lossen in 10 ml gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 °C.

2. Cotransfectie van HeLa-cellen met de reporter en U1 snRNA-plasmiden

OPMERKING: De transfectie van Hela-cellen moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. Het buitenoppervlak van alle materialen moet worden besproeid met 70% ethanol voordat het in de biologische veiligheidskast wordt ingebracht.

  1. Houd Hela-cellen in DMEM in een incubator van 37 °C met 5% CO2 door elke 2-3 dagen te passeren wanneer de cellen ongeveer 80-90% confluent zijn.
  2. Voor passerende HeLa-cellen, aspirateer het gebruikte medium en incubeer vervolgens cellen met 3 ml 0,25% trypsine met 1 mM EDTA bij 37 °C gedurende 3 minuten.
  3. Voeg na incubatie 7 ml verse DMEM toe. Breng de celsuspensie over in een buis van 10 ml, centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten.
  4. Resuspend de celkorrel in 10 ml verse DMEM en plaats de cellen vervolgens op een nieuwe weefselkweekschaal met 20% confluentie.
  5. Voor voorbijgaande transfecties, tel Hela-cellen met een schone hemocytometerschuif en bereid een suspensie voor met een dichtheid van 2,5 x 105 cellen / ml.
  6. Zaad 1,0 ml van 2,5 x 105 cellen/ml Hela-celsuspensie in elke put van een plaat met 12 putten en incubeer gedurende een nacht bij 37 °C.
  7. Zuig de volgende dag het gebruikte medium op en voeg 0,8 ml verse DMEM toe met serum.
  8. Bereid oplossing I door 0,2 μg Dup51 of Dup51p reporter plasmide, 1,8 μg pcDNA, pNS6U1 of pNS6U1-5a plasmide en 100 μL transfectiemedium toe te voegen aan een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  9. Bereid een hoofdmix van oplossing II voor alle te transfecteren monsters door toevoeging van 100 μl transfectiemedium en 4,0 μl transfectiereagentia per monster.
  10. Bereid het transfectiemengsel door 100 μL oplossing II toe te voegen aan elke microcentrifugebuis die oplossing I bevat.
  11. Vortex de transfectiemengsels gedurende 15 s, centrifugeer in een tafelmodelmicrocentrifuge bij 3.000 x g gedurende 10 s bij RT en incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij RT.
  12. Voeg alle 200 μL van het transfectiemengsel toe in één put van de 12-well HeLa-celplaat om een eindvolume van 1,0 ml per put te bereiken en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 48 uur.
  13. Na incubatie, extract RNA uit de getransfecteerde HeLa cellen met commercieel verkrijgbare guanidine thiocyanaat en fenol oplossing.
    OPMERKING: Dit reagens bevat fenol en deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast. Het gebruik van met DEPC behandeld water wordt aanbevolen voor resuspensie van geëxtraheerd RNA.
    1. Zuig het gebruikte medium op en voeg 500 μL van het reagens toe aan elke put. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
    2. Homogeniseren door op en neer te pipetteren. Breng vervolgens de oplossing over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    3. Voeg 100 μL chloroform en vortex toe gedurende 15 s.
    4. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij RT.
    5. Breng 200 μL van het RNA bevattende bovenste waterige laag over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    6. Voeg 2 μg glycogeen en 200 μL isopropanol toe aan elk RNA-monster. Meng door de buizen om te keren.
    7. Verzamel het RNA-neerslag door centrifugatie bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    8. Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de RNA-pellet te verstoren.
    9. Was de pellet tweemaal door 1,0 ml 70% ethanol toe te voegen, de buizen om te keren en te centrifugeren zoals beschreven in stap 2.13.7.
    10. Droog de pellet aan de lucht gedurende ~ 10-20 minuten bij RT en resuspend het RNA in 10-20 μL RNase-vrij water.
    11. Bepaal de RNA-concentratie door de absorptie bij 260 nm te meten zoals beschreven door Desjardins en Conklin9.
  14. Ga verder met primerverlenging of bewaar RNA-monsters in -20 °C. Geïsoleerd RNA kan gedurende 6-12 maanden worden opgeslagen bij -20 °C.

3. 32P-etikettering van oligonucleotiden

OPMERKING: Stappen met betrekking tot het gebruik van 32P-ATP en 32P-gelabelde oligonucleotiden moeten achter een acrylschild worden uitgevoerd door getrainde personen met goedkeuring van geautoriseerde institutionele entiteiten. Het hieronder beschreven protocol kan worden gebruikt voor het labelen van oligonucleotiden, Dup3r en U17-26-R, en markers voor ureum-PAGE. Het gebruik van met DEPC behandeld water wordt aanbevolen voor resuspensie van oligonucleotiden en grootte-uitsluitingsparels.

  1. Voeg aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml oligonucleotide, T4 polynucleotidekinase (T4 PNK), T4 PNK-buffer en 32P-ATP toe zoals beschreven in tabel 1. Voeg 32P-ATP als laatste toe aan het mengsel; dat is belangrijk.
    OPMERKING: Voor de toevoeging van radioactieve oplossingen wordt het gebruik van filtertips aanbevolen.
  2. Incubeer in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 min.
  3. Terwijl de etiketteringsreacties broeden, resuspendeert u de grootte-uitsluitingsparels met een molecuulgewicht van 25 kDa afgesneden door zachtjes vortexing gedurende ~ 10 s.
    OPMERKING: De maatuitsluitingsparels moeten worden bereid volgens de instructies van de fabrikant en worden bewaard als een 50% suspensie in 25% ethanol bij 4 °C.
  4. Bereid kolommen voor door 600 μL van de geresuspendeerde kralen over te brengen naar een wegwerpminikolom die in een opvangbuis van 1,5 ml wordt geplaatst en de kralenbouillon terugbrengt naar 4 °C.
  5. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 1 minuut bij RT en gooi de doorstroming weg.
  6. Was de kralen door 300 μL RNase-vrij water aan de kolom toe te voegen.
  7. Herhaal stap 3.5. en 3.6. tweemaal en breng de minikolom over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
  8. Voeg het kinasereactiemengsel toe aan de maat-uitsluitingskraalkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 5000 x g bij RT.
  9. Verzamel en bewaar de doorstroming, die het 32P-gelabelde oligonucleotide heeft, en gooi alle tips en buizen weg in een acrylafvaldoos.
  10. Voeg 20 μL RNase-vrij water toe om oligonucleotide met 32P-label te verdunnen tot een eindconcentratie van 2,5 μM.
    OPMERKING: Verdun de gelabelde markers indien nodig voor het laden op ureum-PAGE gels.
  11. Bewaar het gelabelde oligonucleotide in een acryl microbuisdoos bij -20 °C of ga verder met de primerverlengingsanalyse.

4. Analyse van de gesplitste reporter transcripties door primer extensie

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om oppervlakken en apparatuur voor gebruik te reinigen met een RNase-inactiverend reagens.

  1. Voeg 2,0 μg RNA geëxtraheerd uit de Hela-cellen toe aan afzonderlijke microcentrifugebuizen van 200 μL en voeg RNase-vrij water toe om het volume op 6,55 μL te brengen.
  2. Bereid Master Mix I met de verdunde 32P-Dup3r en dNTP's zoals weergegeven in tabel 2 en voeg 0,9 μL van het mengsel toe aan elke PCR-buis die RNA-monsters bevat.
  3. Incubeer de buizen, eerst bij 65 °C gedurende 5 min en vervolgens 1 min op ijs.
  4. Bereid Master Mix II voor met 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), RNase-remmer en reverse transcriptase zoals weergegeven in tabel 2.
  5. Voeg 2,55 μL van het mengsel toe aan elke buis die RNA en Master Mix 1 bevat; het totale volume van de reactie moet 10 μL zijn. Houd de buizen gedurende 10 minuten op RT.
  6. Breng de buizen over in een droog bad of een thermische cycler en incubeer, eerst bij 50 °C gedurende 60 minuten en vervolgens bij 70 °C gedurende 15 minuten.
  7. Voeg na incubatie 10 μL 2x formamide RNA-ladende kleurstof toe aan elk monster en bewaar in een acryldoos bij -20 °C of ga verder met de scheiding van fragmenten door ureum-PAGE met behulp van een 14 cm lange gel en visualisatie van gelafbeelding zoals hieronder beschreven in stap 8.
  8. Voer densitometrische scan van het gelbeeld uit met een beeldanalysesoftware en gebruik de bandintensiteiten van opgenomen en overgeslagen producten om het percentage exon 2-inclusie te berekenen, zoals hieronder weergegeven.
    figure-protocol-1

5. Analyse van de gesplitste reporter transcripties door fluorescerende RT-PCR

OPMERKING: De hieronder beschreven RT-PCR-analyse maakt gebruik van willekeurige hexameren voor cDNA-synthese en een combinatie van ongelabelde Dup8f en Cy5-gelabelde Dup3r oligonucleotiden voor PCR-versterking van de gesplitste producten.

  1. Voeg voor cDNA-synthese 2,0 μg RNA geëxtraheerd uit de getransfecteerde Hela-cellen toe aan afzonderlijke microcentrifugebuizen van 200 μL en voeg RNase-vrij water toe om het volume op te maken tot 11,0 μL.
  2. Bereid Master Mix I, met willekeurige hexameren en dNTP zoals weergegeven in tabel 3 , en voeg 2,0 μL van het mengsel toe aan elk monster. Incubeer, eerst bij 65 °C gedurende 5 min en dan 1 min op ijs.
  3. Bereid Master Mix II, met First Strand Buffer, RNase-remmer, DTT en reverse transcriptase zoals weergegeven in tabel 3 en voeg 7,0 μL van het mengsel toe aan elke buis die RNA en Master Mix I bevat.
  4. Houd de buizen gedurende 10 minuten bij RT en incubeer vervolgens bij 50 °C gedurende 60 minuten en 70 °C gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Voltooide cDNA-reacties kunnen worden bewaard bij -20 °C.
  5. Breng voor PCR 1,0 μL (100 ng/μL) van elk cDNA-monster over naar nieuwe PCR-buizen.
  6. Bereid een hoofdmengsel bestaande uit Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPs, Taq-buffer, Taq-polymerase en water zoals beschreven in tabel 4 en voeg 11,5 μL van het mengsel toe aan elke buis die cDNA bevat.
  7. Voer PCR uit met behulp van een thermische cycler met een initiële denaturatiestap bij 94 °C gedurende 3 minuten; gevolgd door 20 cycli denaturatie (94 °C gedurende 30 s), gloeien (65 °C gedurende 30 s) en verlenging (72 °C gedurende 15 s), en een eindstap bij 72 °C gedurende 5 minuten.
  8. Voeg 12,5 μL 2x formamide DNA-ladende kleurstof toe aan elke buis en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 °C.
  9. Bewaar de PCR-reactie bij -20 °C of ga verder met ureum-PAGE zoals hieronder beschreven in stap 8.1-8.4.
  10. Verwijder na de elektroforese de glasplaten uit het elektroforeseapparaat en scan met behulp van een fluorescentiebeeldcamera om de gel te visualiseren.
  11. Voer densitometrische scan van het gelbeeld uit en gebruik de bandintensiteit van de opgenomen en de overgeslagen producten om het percentage exon 2-inclusie te berekenen zoals beschreven in stap 4.8.

6. Analyse van variant U1 snRNA expressie door primer extensie

  1. Voeg 2,0 μg RNA geëxtraheerd uit de Hela-cellen toe aan afzonderlijke microcentrifugebuizen van 200 μL en voeg RNase-vrij water toe om het volume op te maken tot 4,325 μL en voeg vervolgens dATP toe, zoals weergegeven in tabel 5.
  2. Voeg 10.000 CPM van het 32P-U17-26-R oligonucleotide toe aan elke buis.
    OPMERKING: Om een 10.000 cpm/μL oplossing van 32P-U17-26-R (uit stap 3) te bereiden, verdunt u het gelabelde oligonucleotide (1:20 verdunning), bepaalt u cpm in 1,0 μL met behulp van een scintillatieteller en verdunt u verder met gedeïoniseerd water om een oplossing van 10.000 cpm/μL te bereiden in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  3. Incubeer bij 65 °C gedurende 5 min en vervolgens 1 min op ijs.
  4. Bereid een mastermix met 5x First Strand Buffer, RNase-remmer, DTT en reverse transcriptase zoals weergegeven in tabel 5 en voeg 1,8 μL van de mix toe aan elk monster.
  5. Incubeer, eerst bij RT gedurende 10 min en vervolgens bij 42 °C gedurende 10 min.
  6. Voeg na incubatie 10 μL 2x formamide RNA-ladende kleurstof toe aan elk monster en bewaar in een acryldoos bij -20 °C of ga verder met het scheiden van fragmenten door ureum-PAGE met behulp van een 38 cm lange gel (zie stap 8).

7. Analyse van variant U1 snRNA expressie door RT-qPCR

  1. Verdun de cDNA-voorraad bereid zoals hierboven beschreven in stappen 5.1 - 5.4 tot een concentratie van 0,2 ng/μL.
  2. Pipetteer 5,0 μL verdund cDNA in afzonderlijke putten van een 96-well qPCR-plaat in drievoud. Voeg gedeïoniseerd water toe in plaats van cDNA voor no-template control (NTC).
  3. Bereid twee afzonderlijke primermengsels bestaande uit de voorwaartse en omgekeerde primers voor U1 en U2 snRNA's en water zoals weergegeven in tabel 6.
    OPMERKING: Sequenties voor U1- en U2-snRNA-specifieke primers zijn opgenomen in tabel 7.
  4. Voeg 5,0 μL van de U1 en U2 snRNA primer mix toe aan het monster en de NTC-putjes.
  5. Voeg 10,0 μL real-time PCR-mix toe aan elke put.
  6. Sluit de platen af met een optische film en centrifugeer vervolgens gedurende 2 minuten bij RT bij 1.000 x g om de reacties op de bodem van de putten te verzamelen.
  7. Voer qPCR uit met een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van een 2-stapsprotocol bestaande uit denaturatie (95 °C voor 15 s) en gloeien/verlengen (62 °C voor 60 s) terwijl de drempelwaardekwantificeringscyclus (Cq) waarden van doelampliconen worden verzameld.
  8. Voltooi de qPCR-reactie door te controleren op een enkele piek in de dissociatiecurve voor U1- en U2-snRNA-reacties.
  9. Bereken uit de Cq-waarden delta Cq (ΔCq) voor U1- en U2-snRNA's in vergelijking met de pcDNA-controle.
  10. Bepaal variant U1 snRNA-expressie als relatieve hoeveelheid (RQ) van U1 in vergelijking met U2 met behulp van de ΔΔCq-waarde zoals hieronder weergegeven voor alle monsters.
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4

8. Instellen en uitvoeren van Urea-PAGE gels

OPMERKING: De montage van glasplaten en het gelloopapparaat moet worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Het gieten van de 10% ureum-PAGE gel kan worden uitgevoerd volgens een eerder beschreven protocol van Summer et al.10. Stappen met betrekking tot de voorbereiding van markers en monsters, en van het uitvoeren en visualiseren van gels worden hieronder beschreven. Optioneel, om te voorkomen dat de gel aan glasplaten blijft plakken, kan het binnenoppervlak worden bedekt met siliconenoplossing door 1 ml van de oplossing op het oppervlak toe te voegen en gelijkmatig over het hele oppervlak met weefsel te verspreiden. Eenmaal droog, moeten de platen worden gewassen met gedeïoniseerd water en opnieuw worden gedroogd.

LET OP: Ongepolymeriseerd acrylamide is neurotoxisch en moet worden behandeld met de bescherming die wordt aanbevolen in het veiligheidsinformatieblad.

  1. Bereid de primerverlengingsmonsters en -markers voor door ze gedurende 5 minuten bij 95 °C te verhitten en vervolgens gedurende 5 s in een tafelmodelmicrocentrifuge bij 3.000 x g bij RT te centrifugeren.
  2. Voordat u de markers en monsters laadt, spoelt u de putten weg met 1x TBE-buffer om het bezonken ureum te verwijderen.
  3. Laad 10 μL / monster / put en laat de gel 2-3 uur op 300-500V lopen of totdat het xyleen cyanol de bodem bereikt.
    OPMERKING: Ongeveer 1.000 cpm van de 32P-gelabelde marker kan worden geladen.
  4. Verwijder na de elektroforese de glasplaten uit het elektroforeseapparaat.
  5. Scheid de twee platen zorgvuldig zodat de gel plat op een glasoppervlak ligt en breng de gel over op een filterpapier en bedek het met plasticfolie.
  6. Droog de gel vacuüm op het filtreerpapier bij 80 °C gedurende 30 minuten met behulp van een geldroger.
  7. Plaats de gedroogde gel in een fosforbeeldcassette en bewaar deze een nacht bij RT.
    OPMERKING: Het fosforscherm moet vóór gebruik worden gewist met behulp van een lichtbak.
  8. Om het gelbeeld te visualiseren, verwijdert u het scherm en scant u met een fosforbeeldcamera.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De splicing reporter Dup51, een drie exon-twee intron minigen, is afgeleid van het menselijke β-globine gen en is eerder beschreven (Figuur 1A)11,12 . We creëerden een mutante reporter, Dup51p, door ushersyndroom geassocieerde 5'-splice site mutaties te introduceren die voorkomen in exon 3 van het protocadherine 15 (PCDH15) gen13. De 5'-splice site sequence op de exon 2-intron 2 junctie werd veranderd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De test kan worden aangepast voor splicinganalyse in andere cellijnen dan HeLa, maar factoren die van invloed zijn op de transfectie-efficiëntie, zoals celconfluentie en hoeveelheid DNA, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd. De reporter-U1-constructverhouding is een andere kritische parameter die mogelijk moet worden bepaald, afhankelijk van de expressieniveaus die in andere celtypen worden waargenomen. De kwaliteit van geëxtraheerd RNA is van cruciaal belang voor splicinganalyse; daarom wordt het gebruik van RNase-vri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door fondsen aan S.S. van de National Institutes of Health (R21CA170786 en R01GM127464) en de American Cancer Society (de Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) en aan S.S. en W.M. van het Valley Research Partnership Program (P1-4009 en VRP77). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagent Grade Deionized WaterThermoFisher Scientific23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packetGibco12100-046
Sodium BicarbonateThermoFisher ScientificS233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat InactivatedOmega ScientificFB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S)Sigma-AldrichP4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0NSigma-AldrichS2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%ThermoFisher ScientificA144-500
Disposable PES Bottle Top FiltersThermoFisher ScientificFB12566510
EDTA Disodium Salt DihydrateAmresco0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol redThermoFisher Scientific15090046
Sodium ChlorideFisher BioreagentBP358-212
Potassium ChlorideFisher BioreagentBP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate HeptahydrateFisher BioreagentBP332-1
Potassium Dihydrogen PhosphateFisher BioreagentBP362-1
Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol redThermoFisher Scientific11058021
Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000ThermoFisher Scientific13778150
TRIzol™ ReagentThermoFisher Scientific15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)ThermoFisher ScientificBP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2618-212
Glycogen (5 mg/ml)ThermoFisher ScientificAM9510
Direct-zol RNA Miniprep KitZymo ResearchR2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCiPerkinElmerNEG035C001MC
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201L
Size exclusion beands - Sephadex® G-25Sigma-AldrichG2580-10G
Size exclusion mini columnsUSA Scientific1415-0600
pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsN3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 ntAffymetrix76410 100 UL
Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™Sigma-AldrichR2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea)ThermoFisher Scientific18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease InhibitorThermoFisher Scientific10777019
Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific28025013used for primer extension
Taq DNA PolymeraseThermoFisher Scientific10342020
Random Hexamers (50 µM)ThermoFisher ScientificN8080127
Real time PCR mix - SYBR™ Select Master MixThermoFisher Scientific4472903
SuperScript™ III Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific18080093used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher Scientific18080093
5X First-Strand BufferThermoFisher Scientific18080093
Formamide (≥99.5%)ThermoFisher ScientificBP228-100Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium saltSigma-Aldrich114405-5G
Xylene Cyanol FFSigma-Aldrich2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)ThermoFisher ScientificBP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)ThermoFisher ScientificBP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)ThermoFisher ScientificBP1406-1Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)ThermoFisher ScientificBP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics GradeVWRM133-25G
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, UltrapureVWR0761-25MLReview Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, ExpedeonVWRASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cmVWRNGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cmVWRNGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cmVWRNGP-400NR
GE Storage Phosphor ScreensSigma-AldrichGE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular ImagerGE Healthcare28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation CounterGMI8043-30-1194
C1000 Touch Thermal CyclerThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemsThermoFisher Scientific

Referenties

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937(2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Minigene-reporterpre-mRNA-splicingsplice-site-mutatieU1 snRNAtransiënte transfectieprimer-extensieRT-PCRHeLa-cellen
Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.