Method Article

Een niet-degradatieve extractiemethode voor de karakterisering van de moleculaire structuur van bacteriële glycogeendeeltjes

DOI:

10.3791/63016

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 2Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 3Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, 5School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 6Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 7Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 8State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bacteriële glycogeenstructuur wordt sterk beïnvloed door extractiemethoden, wat kan leiden tot moleculaire degradatie en/of vertekende bemonstering. Het is essentieel om methoden te ontwikkelen om deze problemen te minimaliseren. Hier zijn vier extractiemethoden vergeleken met behulp van grootteverdeling en ketenlengteverdeling als belangrijkste criteria voor het minimaliseren van extractieartefacten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Momenteel bestaan er verschillende glycogeenextractiemethoden, die de ruimtelijke structuur van glycogeen beschadigen of slechts gedeeltelijk glycogeen extraheren, wat leidt tot een vertekende karakterisering van de fijne moleculaire structuur van glycogeen. Om de dynamische veranderingen van glycogeenstructuren en de veelzijdige functies van glycogeendeeltjes in bacteriën te begrijpen, is het essentieel om glycogeen te isoleren met minimale degradatie. In deze studie wordt een milde glycogeenisolatiemethode gedemonstreerd door gebruik te maken van koudwaterprecipitatie (CW) via ultracentrifugatie met suikerdichtheidsgradiënt (SDGU-CW). Ter vergelijking werden ook de traditionele trichloorazijnzuur (TCA)-methode en de kaliumhydroxide (KOH)-methode uitgevoerd. Een veelgebruikte laboratoriumstam, Escherichia coli BL21 (DE3), werd in deze studie gebruikt als modelorganisme voor demonstratiedoeleinden. Na extractie van glycogeendeeltjes met behulp van verschillende methoden, werden hun structuren geanalyseerd en vergeleken door middel van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) voor deeltjesgrootteverdeling en fluorofoor-geassisteerde capillaire elektroforese (FACE) voor lineaire ketenlengteverdelingen. De analyse bevestigde dat glycogeen geëxtraheerd via SDGU-CW een minimale afbraak had.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycogeen is een sterk vertakt polysacharide dat bestaat uit glucosylresiduen en ook een kleine maar significante hoeveelheid eiwitten, waarin alle glucosylresiduen aan elkaar zijn gekoppeld via α-1,4-glycosidische bindingen in lineaire ketens en α-1,6-glycosidische bindingen op vertakkingspunten1. De structuur van glycogeendeeltjes is over het algemeen verdeeld in drie hiërarchieën: 1) oligomeren met een korte keten, 2) bolvormige β deeltjes (~ 20 nm in diameter) en 3) grote rozetvormige α deeltjes die zijn samengevoegd door β deeltjes, waarvan de diameter ruwweg tot 300 nm reikt. Onlangs is gebleken dat glycogeen-α deeltjes twee structurele toestanden hebben in eukaryoten, namelijk een fragiele toestand en een stabiele toestand. Kwetsbaarheid betekent hier de dissociatie van grotere α deeltjes in kleinere β deeltjes in aanwezigheid van een chaotrope stof zoals DMSO2. Verdere analyses toonden aan dat glycogeen-α deeltjes in de diabetische lever constant kwetsbaar zijn3 en dat de fragiele α deeltjes veel sneller worden afgebroken dan stabiele α deeltjes4. Glycogeen structurele kwetsbaarheid kan dus hyperglykemische aandoeningen bij diabetes 2,4 verergeren, waardoor fragiel α-deeltje een potentiële pathologische biomarker van diabetes op moleculair niveau wordt. Het bestaan van glycogeen-α-deeltjes in prokaryoten wordt echter slechts sporadisch gerapporteerd5, en er is geen melding gemaakt van de twee verschillende structurele toestanden van glycogeen α deeltjes in bacteriën.

Om de fysiologische functies van bacteriële glycogeendeeltjes te begrijpen, is het essentieel om de fijne structuur van glycogeenmoleculen te bepalen, die glycogeenisolatie vereist met maximale opbrengst en minimale degradatie1. Tot nu toe zijn er verschillende technieken ontwikkeld voor glycogeenextractie, waaronder maar niet beperkt tot warmwaterextractie, trichloorazijnzuur (TCA)-extractie en hete alkalische (kaliumhydroxide, KOH) extractie6. Daarnaast werd een andere methode die vaak wordt gebruikt voor eukaryote glycogeenisolatie, de suikerdichtheidsgradiënt ultra-centrifugatie (SDGU) -methode, ook gerapporteerd voor bacteriële glycogeenisolatie in Selenomonas ruminantium en Fibrobacter succinogenes 7,8. Hoewel de voor- en nadelen van deze methoden uitgebreid zijn besproken in eukaryote studies 9,10, zijn er zelden vergelijkende studies van glycogeenfijne structuren geïsoleerd via verschillende extractiemethoden in bacteriën vanuit het perspectief van glycogeendeeltjesstructuren.

In deze studie is dit probleem aangepakt door Escherichia coli BL21 (DE3) als modelorganisme te gebruiken. In totaal werden vier glycogeenextractiemethoden vergeleken, namelijk TCA-geprecipiteerde warmwaterextractie (TCA-HW), TCA-geprecipiteerde koudwaterextractie (TCA-CW), hete 30% KOH-oplossingsextractie (KOH-HW) en koudwaterextractie met behulp van sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (SDGU-CW). De verdeling van de deeltjesgrootte van glycogeen werd vervolgens gemeten via grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), terwijl de ketenlengteverdeling werd gedetecteerd via fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE), die beide werden gebruikt voor het beoordelen van de kwaliteit van extractiemethoden. Daarnaast werden de stabiliteit en kwetsbaarheid van bacteriële glycogeen α deeltjes ook vergeleken tussen de verschillende extractiemethoden door de deeltjesgrootteverdeling voor en na behandeling met het veelgebruikte chaotropische middel dimethylsulfoxide (DMSO) te vergelijken. De gedetailleerde procedures voor glycogeenextractie en structurele karakterisering worden hieronder weergegeven. Samenvattend heeft de SDGU-CW-methode het beste algemene effect in termen van structurele integriteit van glycogeen en wordt daarom aanbevolen voor bacteriële glycogeenextractie in toekomstige relevante studies.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bacterieteelt en -verzameling

  1. Reanimeer E. coli BL21(DE3) uit de bacteriële glycerolvoorraad (-80 °C) door steriele LB-agarplaat te inoculeren (10 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 10 g/L NaCl en 15 g/L agar). Zet de plaat in een standaard broedmachine en kweek een nacht bij 37 °C.
  2. Pak een enkele kolonie op en inoculeer deze in een steriel LB vloeibaar medium van 10 ml (10 g/l trypton, 5 g/l gistextract en 10 g/l NaCl). Goed mengen via vortexing en cultuur 's nachts bij 37 °C met schudden bij 220 tpm.
    OPMERKING: Tenzij anders aangegeven, waren alle vloeibare cultuuromstandigheden 37 °C met een schudsnelheid van 220 tpm.
  3. Breng 1 ml van de nachtelijke E. coli-cultuur over in 100 ml steriel LB vloeibaar medium en kweek gedurende 5 uur. Breng 50 ml over op 1 l 1x M9 minimaal medium (3 g/l KH2PO4, 0,5 g/l NaCl, 6,78 g/l Na2HPO4 en 1 g/l NH4Cl) met 0,8% D-(+)-glucose. Meng goed en laat 20 uur groeien.
    OPMERKING: 1x M9 minimaal medium en glucose werden afzonderlijk gesteriliseerd en vervolgens aseptisch gemengd bij het afkoelen tot kamertemperatuur.
  4. Na 20 uur kweken de bacteriële oplossing bij 6.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C centrifugeren. Gooi het bovenstaande weg. Bewaar de celpellet een nacht bij -80 °C en vriesdroog de pellet vervolgens.
  5. Sluit het gevriesdroogde bacteriepoeder af en bewaar het in de koelkast (-20 °C) voor later gebruik.

2. Glycogeen-extractie

  1. Extractie van met trichloorazijnzuur neergeslagen heet water (TCA-HW)
    1. Weeg nauwkeurig 500 mg gevriesdroogd E. coli BL21 (DE3) poeder af en resuspendeer het in 20 ml ijskoude 0,05 M triethanolamine (TEA) buffer. Gebruik een ultrasone celbreker (25% energie, 4 °C) om bacteriële cellen gedurende 3 minuten te verstoren (werkcycli van 30 s en intervallen van 2 s). Zorg ervoor dat er geen duidelijke pellets in de oplossing zitten.
      OPMERKING: De celverstoring werd op het ijs uitgevoerd. Stel de pH van de TEA-buffer in op pH 7 door HCl-toevoeging en bewaar bij kamertemperatuur.
    2. Breng al het bacteriële homogenaat over in twee ultracentrifugebuisjes van 10,4 ml (10 ml/buisje). Vul de buisjes tot aan de rand met gedeïoniseerd water en centrifugeer op 104.000 x g in een ultracentrifuge op 4 °C gedurende 90 min. Gooi het bovenstaande weg.
    3. Voeg 2 ml gedeïoniseerd water toe om de pellet in elke buis te suspenderen. Breng de suspensie over in een centrifugebuis van 50 ml en voeg gedeïoniseerd water toe tot een eindvolume van 20 ml. Verwarm en kook gedurende 5 minuten om alle eiwitten te denatureren.
    4. Centrifugeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 18.000 x g en behoud het bovenstaande (S1). Behandel het neerslag op dezelfde manier als in stap 2.1.3. Combineer de nieuwe supernatans (S2) met S1.
    5. Voeg 50% TCA (0,1 volume) toe aan het bovenstaande (S1+S2) en plaats het mengsel 10 minuten op ijs om macromoleculen zoals DNA, RNA, eiwitten, enz. neer te slaan. Centrifugeer het mengsel gedurende 10 minuten op 18.000 x g en meng het bovenstaande met 1,5 volume absolute ethanol.
      OPMERKING: De concentratie TCA is 50% v/v. Houd het voor opslag uit de buurt van licht.
    6. Sla glycogeen 20 minuten neer op ijs en centrifugeer gedurende 10 minuten op 18.000 x g . Giet supernatant uit.
    7. Los de pellet op in 5 ml ddH2O en voeg vervolgens 5 ml ijskoude absolute ethanol toe. Incubeer de oplossing een nacht bij 4 °C en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 18.000 x g . Gooi het bovenstaande weg en bewaar de korrel.
    8. Herhaal de stappen "wassen en neerslaan" zoals in stap 2.1.7 nog twee keer.
    9. Los ten slotte het neergeslagen glycogeen op in 400 μL ddH2O in een tube van 2 ml, vries voor bij -80 °C en vriesdroog om droog glycogeenpoeder te verkrijgen.
  2. Trichloorazijnzuur neergeslagen koudwaterextractie (TCA-CW)
    OPMERKING: De TCA-CW-methode is dezelfde als de TCA-HW-methode, behalve dat de pellet, na het weggooien van het supernatant, de pellet moet worden behandeld zonder te koken (zie stap 2.1.3) en opnieuw moet worden gesuspendeerd in 20 ml ddH2O met een cocktail van 1 mg/ml proteaseremmers.
    1. Om een cocktailoplossing met proteaseremmers van 1 mg/ml te bereiden, lost u 50 mg proteaseremmercocktail op in 1 ml gedeïoniseerd water en verdunt u in een verhouding van 50:1 (gedeïoniseerd water: cocktailoplossing met proteaseremmers).
  3. Extractie van koud water met behulp van ultracentrifugatie met sucrosedichtheidsgradiënt (SDGU-CW)
    1. Los 1 g gevriesdroogd E. coli-poeder op en homogeniseer deze in 4 ml glycogeenextractiebuffer (GEB) met een cocktail van 1 mg/ml proteaseremmers.
      OPMERKING: GEB bestaat uit 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF en 5 mM natriumpyrofosfaat. GEB moet worden aangepast aan pH 8 met HCl.
    2. Gebruik een ultrasone celbreker (25% energie, 4 °C) om bacteriële cellen gedurende 3 minuten (8 s werkcycli en intervallen van 9 s) te verstoren. Zorg ervoor dat het hele proces op het ijs wordt uitgevoerd. Breng na sonificatie het bacteriële homogenaat over naar een centrifugebuis, vul deze met GEB tot een eindvolume van 10 ml en vortex de buis om te mengen.
      OPMERKING: Homogeniseer niet te lang, omdat de gegenereerde warmte glycogeen kan aantasten.
    3. Centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het bovenstaande over in een ultracentrifugebuis van 10,4 ml, vul de buis tot de bovenkant met GEB en centrifugeer vervolgens gedurende 2 uur bij 4 °C bij 360.000 x g .
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de buis gevuld is en er geen luchtbellen zijn.
    4. Gooi het bovenstaande na het centrifugeren weg en suspendeer het neerslag opnieuw met 2 ml gedeïoniseerd water.
    5. Breng in een nieuwe ultracentrifugebuis langzaam 4 ml 75% sucroseoplossing aan met 4 ml 37,5% sucroseoplossing. Leg vervolgens de in stap 2.3.4 verkregen suspensie op de sucroseoplossing en vul bij met gedeïoniseerd water (zie figuur 1).
      OPMERKING: De sucroseconcentratie is 75% [v/v] en 37,5% [v/v]. Wees voorzichtig bij het maken van de sucrosedichtheidsgradiënt en zorg ervoor dat er een waarneembare gelaagdheid is tussen de twee sucroseoplossingen. Zorg er ook voor dat er geen luchtbellen in de ultracentrifugebuis zitten.
    6. Centrifugeer bij 360.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg. Los de pellet op in 200 μL gedeïoniseerd water. Voeg 800 μL absolute ethanol toe voor glycogeenprecipitatie.
    7. Sla glycogeen een nacht neer bij -20 °C. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
    8. Los de resulterende pellet op in 400 μL ddH2O in een buis van 2 ml, vries voor bij -80 °C en vriesdroog om droog glycogeenpoeder te verkrijgen. Bewaar droog glycogeenpoeder bij 4 °C voor structurele analyse.
      OPMERKING: De gedetailleerde procedure wordt geïllustreerd in figuur 1.
  4. Hete extractie van 30% kaliumhydroxideoplossing (KOH-HW)
    1. Kook gevriesdroogd E. coli poeder (50 mg) in 1 ml 30% [w/v] KOH gedurende 1 uur.
    2. Voeg 67% [v/v] ethanol met 15 mM LiCl toe voor neerslag bij -20 °C gedurende ten minste 1 uur. Centrifugeer de monsters gedurende 20 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C.
      OPMERKING: 67% [v/v] ethanol met 15 mM LiCl bevat 0,6358 g LiCl, 67 ml absolute ethanol en 33 ml gedeïoniseerd water.
    3. Los de pellets opnieuw op in 1 ml ddH2O en verwarm gedurende 10 minuten bij 95 °C met intermitterend roeren.
    4. Herhaal de stap van de ethanolprecipitatie nog drie keer, zoals beschreven in stap 2.4.2. Los de laatste pellet opnieuw op in 400 μL ddH2O in een buis van 2 ml, vries voor bij -80 °C en vriesdroog om droog glycogeenpoeder te verkrijgen.

3. Bepaling van de glycogeenstructuur

  1. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
    1. Resuspendeer glycogeenpoeder in 50 mM Tris-gebufferde zoutoplossing (pH 7) met een eindconcentratie van 1 mg/ml.
    2. Maak een 10-voudige verdunning van de suspensie en breng de verdunde suspensie aan op het gloeiontladingskoperrooster met 400 mazen.
    3. Neem na 2 minuten het overtollige monster van het rooster met een filtreerpapier en bevlek het rooster met 2-3 druppels 1% uranylacetaat.
    4. Gebruik een transmissie-elektronenmicroscoop met een snelheid van 75 kV om de preparaten te onderzoeken.
  2. Chromatografie met uitsluiting van grootte (SEC)
    1. Bereiding van de mobiele fase: bereid 0,02% (m/m) natriumazide en 50 mM natriumnitraatoplossingen in gedeïoniseerd water en filtreer door een filtermembraan van 0,45 μm. Gebruik het ultrasone oscillerende waterbad om de oplossing gedurende meer dan 15 minuten te sonificeren om luchtbellen te verwijderen.
    2. Monstervoorbereiding: Gebruik de mobiele fase om glycogeenpoeder op te lossen, zodat de uiteindelijke concentratie 1 mg/ml is. Incubeer de oplossing een nacht bij 80 °C in een thermomixer. Centrifugeer het opgeloste monster bij 6.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en breng het bovenstaande over in een standaard SEC-injectieflacon.
    3. Bereiding van met DMSO behandelde glycogeenmonsters
      1. Los 1 mg glycogeenpoeder op in 300 μL DMSO en incubeer het een nacht bij 80 °C in een thermomixer. Voeg 4x volume ethanol toe om glycogeen neer te slaan en centrifugeer de oplossing op 6.000 x g.
      2. Was de pellet twee keer met ethanol, los de pellet op in ddH2O en vriesdroog.
      3. Analyseer het gevriesdroogde glycogeenpoeder via SEC door monsters voor te bereiden zoals hierboven beschreven.
    4. Gebruik het SEC-systeem met pre-kolommen en 1000 en 10000 kolommen voor de analyse van de verdeling van de glycogeendeeltjesgrootte. Houd de kolommen op 80 °C en het debiet op 0,3 ml/min.
  3. Fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE)
    1. Glycogeen vertakking
      OPMERKING: Bij het gebruik van FACE om kettinglengteverdeling (CLD) te detecteren, moeten alle te testen monsters de voorbehandeling van debranching ondergaan.
      1. Voeg 0,5 mg glycogeenpoeder, 90 μl heet water (90 °C), 1,5 μl NaN3-oplossing , 3,5 μl isoamylase (200 E/ml) en 8 μl azijnzuur-natriumacetaatbuffer (pH 3,5) toe aan een reageerbuisje.
        OPMERKING: Isoamylase wordt toegevoegd om specifiek de vertakte keten van het te testen monster door te snijden. Isoamylase is een vertakkend enzym dat specifiek de α-(1-6) binding kan vernietigen zonder de α-(1-4) binding te vernietigen, dus het kan specifiek de glycogeenzijketen splitsen zonder de structuur van de hoofdketen te vernietigen.
      2. Incubeer het mengsel gedurende 3 uur bij 37 °C in een thermomixer. Nadat u de pH neutraal hebt gemaakt met 8 μL 0,1 M NaOH-oplossing, incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 80 °C in een thermomixer.
      3. Voeg 4x volume absolute ethanol toe aan het mengsel om glycogeen neer te slaan. Centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 6.000 x g bij kamertemperatuur. Was de pellet twee keer met ethanol, los de pellet op in ddH2O en vriesdroog.
    2. Bereiding van fluorescerende oplossing
      1. Centrifugeer de APTS (8-Aminopyreen-1,3,6-trisulfonzuur trinatriumzout) reagensfles (elke fles bevat 5 mg APTS) op 4.000 x g gedurende 2 min. Voeg 50 μL 15% azijnzuuroplossing toe om het poeder op te lossen, meng goed en centrifugeer op 4.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om 0,2 M APTS-azijnzuuroplossing te verkrijgen.
        OPMERKING: Bewaar de APTS-oplossing in de koelkast bij -20 °C.It moet na opening binnen twee weken volledig worden gebruikt. Anders wordt het gedeactiveerd. APTS is een veelgebruikte negatief geladen kleurstof die zich bindt aan het reducerende uiteinde van de glycogeenketen. Omdat de ketens met verschillende gradaties van polymerisatie (DP) allemaal slechts één negatieve lading dragen, kan FACE ze scheiden op basis van hun verschillende massa-tot-ladingsverhoudingen. Op deze manier worden signalen van verschillende DP-waarden gedetecteerd door de fluorescentiedetector.
    3. Breng het vertakte glycogeen over in een reageerbuis en voeg 1,5 μl APTS-oplossing en 1,5 μl natriumcyaanorohydrideoplossing toe. Incubeer bij 60 °C gedurende 1,5 uur in het donker. Voeg 80 μL gedeïoniseerd water toe, centrifugeer op 4.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en bewaar het supernatant.
    4. Breng het monster in het capillaire elektroforesesysteem door gedurende 3 s te injecteren bij 0,5 psi (3,4 kPa boven atmosferische druk).
      OPMERKING: Fluorescerend gelabelde lineaire glucanen werden gescheiden door middel van een toegepaste spanning van 30 kV en een stroom van ongeveer 14 mA bij 25 °C. Piekgebieden gaven relatieve hoeveelheden glucanen met verschillende massa's (mate van polymerisatie (DP) van glucanen in aangrenzende pieken verschilde met 1 DP). De temperatuur van het monster werd op 18 °C gehouden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grootteverdeling van glycogeendeeltjes
Een reeks onderzoeken heeft aangetoond dat glycogeen-α deeltjes in de diabetische lever kwetsbaar zijn en gemakkelijk uit elkaar vallen in de waterstofbrugverstoorder DMSO 11,12,13,14. De huidige studie testte hoe de deeltjesgrootte en structurele stabiliteit veranderden voor bacterieel glycogeen dat vi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycogeen is een belangrijke energiereserve die in veel bacteriën is geïdentificeerd16. Om de fysiologische functies van glycogeendeeltjes te ontleden, is het essentieel om een beter begrip te hebben van de fijne structuur van glycogeenmoleculen. Tot nu toe zijn er verschillende methoden ontwikkeld om glycogeen uit bacteriecultuur te extraheren. Er zijn echter verschillende grootteverdelingen van glycogeendeeltjes waargenomen bij verschillende extractiemethoden, w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn professor Robert G. Gilbert van de Universiteit van Queensland en de Universiteit van Yangzhou enorm dankbaar, die inzichten en expertise heeft verschaft die enorm hebben bijgedragen aan de voltooiing van deze studie. We erkennen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (nr. 31900022, nr. 32171281), Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (nr. BK20180997), Young Science and Technology Innovation Team van Xuzhou Medical University (nr. TD202001) en het Jiangsu Qinglan-project (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC systemAgilent1260 infinity IIDeeltjesgrootteverdeling
Analytical columnPSS10-1000-
CentrifugeEppendorf5420-
Filter membraneCambioKm-0220-
Fluorescence-assisted capillary electrophoresis systemBeckman Coulter-Ketlengteverdeling
Freeze dryerXinzhiSCIENTZ-10NLyofilisatie van bacteriën en glycogeen
FreezerThermo FisherForma 900Sample storage
Guard columnPSSSUPPERMA-
IncubatorThermo FisherPR505750R-CN-
Low-speed large-capacity centrifugeHexiHR/T20MMSample centrifugation
Multiskan FC microplate readerThermo Fisher1410101-
Optima XPN ultracentrifugeBeckmanXPN-100/90/80Voor glycogeen
OscillatorXinbaoSHZ-82-
PA-800 Plus SystemBeckman CoulterA66528-
pH meterMettler ToledoFE28 -TRIS-
Refractive index detectorWyattOptilab T-rEX-
RefrigeratorHaierBCD-406WDPD-
ThermomixerShanghai JingxinJXH-100Sample incubation
Transmission electron microscopeHitachi CorporationH-7000Glycogeendeeltjesmorfologie
Ultracentrifuge tubeBeckman355651-
Ultrasonic cell crusherNingbo XinzhiScientz-IID Bacteria disruptor
Ultrasonic oscillating water bathJietuoJT-1027HTD-
Vortex mixerTiangenOSE-VX-01-
Water systemMerck MilliporeH2O-MM-UV-TDe-ionized water
Material
8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid Trisodium SaltSigma-Aldrich196504-57-1-
Absolute ethanolGuoyao10009228-
Agar powderSolarbioA1890-
Alpha-amylaseMegazymeE-BLAAM-40ML-
AmyloglucosidaseMegazymeE-AMGDF-40ML-
cOmplete MiniRoche4693159001-
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG8270-1kg-
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)MegazymeK-GLUCGlycogen kwantificering
Dimethyl sulfoxideVicmedVic147Chaotropic agent
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-
Ethylene diamine tetra-acetic acidVicmedVic1488-
Glacial acetic acidGuoyao10000218-
GlycerolGuoyao10010618Bacteriaal opslag
Hydrochloric acidGuoyao10011008-
Hydroxymethyl aminomethaneSigma-AldrichV900483-500g-
IsoamylaseMegaZyme9067-73-6Glycogen debranch
Lithium chlorideSigma-Aldrich62476-100g-
M9, Minimal Salts, 5×Sigma-AldrichM6030-1kgBacteriaal kweekmedium
Potassium hydroxideGuoyao10017008-
Pullulan standardPSS--
Sodium acetate trihydrateGuoyao10018718-
Sodium azideSigma-Aldrich26628-22-8-
Sodium chlorideGuoyao10019318Bacteriaal kweekmedium
Sodium cyanoborohydrideHuaweiruikehws001297-
Sodium diphosphateSigma-Aldrich71515-250g-
Sodium FluorideMacklinS817988-250g-
Sodium hydroxideGuoyao10019762-
Sodium nitrateGuoyao10019928-
Sodium pyrophosphateSigma-AldrichV900195-500g-
SucroseGuoyao10021463-
Trichloroacetic acidGuoyao40091961-
TryptoneOxoidLP0042Bacteriaal kweekmedium
Yeast ExtractOxoidLP0021Bacteriaal kweekmedium

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  2. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  3. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  4. Nawaz, A., Zhang, P., Li, E., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The importance of glycogen molecular structure for blood glucose control. iScience. 24 (1), 101953(2021).
  5. Rashid, A. M., et al. Assembly of α-glucan by GlgE and GlgB in mycobacteria and streptomycetes. Biochemistry. 55 (23), 3270-3284 (2016).
  6. Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).
  7. Kamio, Y., Terawaki, Y., Nakajima, T., Matsuda, K. Structure of glycogen produced by Selenomonas ruminantium. Agricultural and Biological Chemistry. 45 (1), 209-216 (1981).
  8. Gong, J., Forsberg, C. W. Separation of outer and cytoplasmic membranes of Fibrobacter succinogenes and membrane and glycogen granule locations of glycanases and cellobiase. Journal of Bacteriology. 175 (21), 6810-6821 (1993).
  9. Mojibi, N. Comparison of methods to assay liver glycogen fractions: the effects of starvation. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (3), (2017).
  10. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. The Journal of Biological Chemistry. 239, 4021-4026 (1964).
  11. Tan, X., et al. Proteomic investigation of the binding agent between liver glycogen beta particles. ACS Omega. 3 (4), 3640-3645 (2018).
  12. Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
  13. Sullivan, M. A., Harcourt, B. E., Xu, P., Forbes, J. M., Gilbert, R. G. Impairment of liver glycogen storage in the db/db animal model of type 2 diabetes: a potential target for future therapeutics. Current Drug Targets. 16 (10), 1088-1093 (2015).
  14. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  15. Sullivan, M. A., et al. Molecular structural differences between type-2-diabetic and healthy glycogen. Biomacromolecules. 12 (6), 1983-1986 (2011).
  16. Wang, L., et al. Systematic analysis of metabolic pathway distributions of bacterial energy reserves. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (8), 2489-2496 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glycogen ExtractionBacterial GlycogenMolecular Structure CharacterizationCold Water PrecipitationSugar Density GradientUltracentrifugationEscherichia ColiSize Exclusion ChromatographyCapillary ElectrophoresisGlycogen Particle Isolation
Video Coming Soon

Related Articles