Methodenartikel

Isolatie van volwassen varkenseilandjes

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63017

⸱

21 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen Institute of Translational Medicine, The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Institute of Translational Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 3Imaging Department, Shenzhen Institute of Translational Medicine, The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 4Faculty of Science, University of Waterloo, 5School of Life Science, The Chinese University of Hong Kong, 6General Surgery, The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, 7Director Islet Programs, Imagine Pharma

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit gedetailleerde protocol behandelt de methodologische stappen van de isolatie van volwassen varkenseilandjes vanaf de verteringsfase via zuivering tot de uiteindelijke functionele beoordeling van de eilandjes. Dit overzicht kan worden gebruikt als richtlijn voor de isolatie van volwassen varkenseilandjes in onderzoeksinstellingen.

Samenvatting

Diabetes mellitus type 1 (T1DM) wordt veroorzaakt door auto-immuunvernietiging van pancreascellen β, wat resulteert in weinig of geen insulineproductie. Eilandjestransplantatie speelt een belangrijke rol bij de behandeling van T1DM, met de verbeterde glycometabole controle, de verminderde progressie van complicaties, de vermindering van hypoglykemische episodes in vergelijking met traditionele insulinetherapie. De resultaten van de klinische fase III-studie toonden ook de veiligheid en werkzaamheid van eilandjesallotransplantatie bij T1DM aan. Het tekort aan alvleesklierdonoren beperkt echter het wijdverbreide gebruik ervan. Dieren als bron van eilandjes zoals het varken bieden een alternatieve keuze. Omdat de architectuur van de alvleesklier van het varken anders is dan die van de eilandjes van muizen of mensen, is de isolatieprocedure van de varkenseilandjes nog steeds een uitdaging. Aangezien de vertaling van alternatieve bronnen van varkenseilandjes (xenogene) naar de klinische setting voor de behandeling van T1DM door middel van cellulaire transplantatie van groot belang is, is er dringend behoefte aan een kosteneffectief, gestandaardiseerd en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van varkenseilandjes. Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigde en kosteneffectieve methode om volwassen varkenseilandjes te isoleren en te zuiveren op basis van de eerdere protocollen die met succes varkenseilandjes hebben getransplanteerd naar niet-menselijke primaten. Dit zal een beginnershandleiding zijn zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur zoals een COBE 2991 Cell Processor.

Inleiding

Diabetes mellitus type 1 (T1DM) is een ernstige ziekte waarbij auto-immuunvernietiging van bètacellen resulteert in weinig of geen insulineproductie 1,2,3. Een substantiële groep patiënten met T1DM kan de glykemische labiliteit niet stabiliseren met insulinetherapie en ervaart levensbedreigende hypoglykemische episodes. Eilandjestransplantatie kan, als het succesvol is, dit bereiken. Wereldwijd hebben meer dan 1.500 diabetespatiënten een succesvolle eilandjestransplantatie ondergaan, met een lager risico en toch succes op de lange termijn dan pancreastransplantatie4.

In vergelijking met insulinetherapie heeft eilandjestransplantatie betere resultaten bij het verminderen van de progressie van complicaties5. De resultaten van de klinische fase III-studie toonden ook de veiligheid en werkzaamheid van eilandjesallotransplantatie aan in T1DM 6,7. Eilandjestransplantatie is misschien wel de beste therapeutische optie die momenteel beschikbaar is voor patiënten met T1DM die levensbedreigende hypoglykemische episodes ervaren.

Het tekort aan menselijke allogene donoreilandjes beperkt echter het wijdverbreide gebruik van eilandjestransplantatie 8,9. Daarom is het gebruik van dierlijke eilandjes als vervanging wenselijk10. Het varken is gekozen als donor voor eilandcellen in preklinische xenotransplantatie, en het is van potentiële vertaalbaarheid naar de kliniek vanwege 1) beschikbaarheid, 2) metabole overeenkomsten met mensen, 3) vrij grote bètacelmassa, en 4) mogelijkheid van genetische manipulatie om immunologische compatibiliteit met mensen te verbeteren11.

Hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van eilandjes zijn belangrijke stappen voor het succes van xenotransplantatie. De procedure om eilandjes te isoleren van volwassen varkensdonoren is echter een uitdaging vanwege de architectuur van de alvleesklier zelf, die verschilt van de eilandjes van muizen of mensen12. Over het algemeen is de vorm van de pancreaseilandjes van varkens niet compact12. Vergeleken met pancreaseilandjes bij mensen en knaagdieren, dissociëren varkenseilandjes gemakkelijker12. De spontane dissociatie van de buitenste laag eilandjescellen, vergezeld van een lange kweektijd, leidt echter tot een substantiële vermindering van de grootte van de pancreaseilandjes10.

Tijdens het isolatieproces van de eilandjes zijn veel factoren van invloed op de kwaliteit van de eilandjes, zoals de leeftijd van de donor, de warme ischemietijd, enzymatische activiteit, de uitzetting door enzymatische injectie13,14. Hoewel veel eerdere studies methoden aandroegen voor de isolatie van varkenseilandjes, is er geen gedetailleerd stapsgewijs videoprotocol voor onderzoekers als een effectieve instructie 10,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

Voor dit doel omvat dit gedetailleerde protocol alle isolatiestappen, van het ophalen van organen tot de functionele beoordeling van de eilandjes na isolatie, in de hoop een eenvoudig en begrijpelijk overzicht van het proces te bieden voor gemakkelijke toepasbaarheid. Dit protocol is gebaseerd op de eerder gepubliceerde methoden met wijzigingen10,11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik van het Shenzhen Second People's Hospital en volgen alle nationale voorschriften. In dit protocol werden Duroc-Landrace-Yorkshire varkens (~6 maanden oud) die op de markt werden gekocht, gebruikt als pancreasdonoren. Het gewicht van de verzamelde alvleesklier was 123,63 g ± 22,50 g. Tijdens de experimenten worden persoonlijke beschermingsmiddelen gedragen, waaronder beschermende kleding, maskers, handschoenen en petten.

1. Voorbereiding van de media

  1. Reinigingsmedium: Om 100 ml reinigingsmedium te bereiden, mengt u Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), 2% varkensserum, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 1% penicilline-streptomycine (P/S).
  2. Verzamelmedium: Meng RPMI 1640 met 5% varkensserum en 1% penicilline-streptomycine (P/S).
  3. Kweekmedium: Meng CMRL 1066 met 10% varkensserum, 10 mmol/L nicotinamide, 1% P/S en 2 mmol/L L-glutamine.
  4. Enzymoplossing: Bereid 1 mg/ml collagenase type V (activiteit: 918 eenheden/mg vaste) oplossing in HBSS.
  5. Oplossing met lage glucoseconcentratie: Om een oplossing met een lage glucoseconcentratie te bereiden, voegt u 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2,8 mM D-glucose toe aan 1 ml Kreb's Ringer-bicarbonaatbuffer (KRBB).
  6. Oplossing met hoge glucoseconcentratie: Om een oplossing met een hoge glucoseconcentratie te bereiden, voegt u 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 28 mM D-glucose toe aan 1 ml Kreb's Ringer-bicarbonaatbuffer (KRBB).

2. Ophalen van de alvleesklier

  1. Anesthesie en huidvoorbereiding bij varkens
    1. Verdoof het donorvarken met intramusculaire injectie van de anesthetica Lumianning (2,5-5 mg/kg) en Propofol (2-3 mg/kg) (zie materiaaltabel voor details).
    2. Handhaaf de anesthesie met 1%-3% isofluraan in een ventilatievolume van 1-1,5 l/min door gasanesthesiemaskers.
    3. Controleer de hartslag om de juiste verdoving te bevestigen. Gebruik dierenartszalf op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
    4. Scheer de buik, maak deze schoon met jodofoor en bedek het varken op de juiste manier met een steriel chirurgisch laken.
  2. Het openen van de buik
    1. Nadat u voor steriele omstandigheden hebt gezorgd, maakt u een laparotomie-incisie in de middellijn van de xiphoid naar de navel, iets bij de staart.
    2. Snijd het middenrif in.
    3. Isoleer de suprahepatische aorta en suprahepatische inferieure vena cava (IVC) met behulp van een vasculaire tang en isoleer vervolgens de infrarenale aorta en infrahepatische IVC met dezelfde methode.
    4. Dien intraveneuze heparine (100 E/kg) toe aan het varken om bloedstolling te voorkomen.
    5. Exteïriseer de dunne en dikke darm en duw de lever en maag naar het hoofd om de alvleesklier volledig bloot te leggen.
  3. Perfusie van de alvleesklier
    1. Klem de aorta boven het middenrif vast met een vaattang, intuber de aorta boven de tak van de nieraorta via de aortacanule (16 G) en bind vast met 2-0 hechtdraad.
    2. Laat het dier 2-3 liter koude HBSS-oplossing trekken (vooraf in zakken gedaan en bewaard op 4 °C) via de aortacanule (16 G). Infuseren van de HBSS-oplossing door de aortacanule door zwaartekracht, terwijl de suprahepatische IVC en de IVC worden doorgesneden om de perfusievloeistof vrij te maken.
      OPMERKING: Ga door met de infusie totdat de IVC-uitstroom vrij is.
  4. Alvleesklier excisie
    1. Pel het omentum eraf, zoek de alvleesklier en miltkwabben samen met de milt en scheid ze.
    2. Scheid de verbonden kwab van de alvleesklier met aangrenzend weefsel.
    3. Zoek de hoofdductus pancreaticus in het dalende deel van de twaalfvingerige darm. Bind het galkanaal af met een hechtdraad (2-0) en transecteer het met een schaar in de buurt van het pancreaskanaal.
    4. Klem een deel van de twaalfvingerige darm met de ampulla van Vater aan weerszijden van de kop van de alvleesklier vast met een vaattang en snijd vervolgens de twaalfvingerige darm weg met een schaar.
    5. Haal de hele alvleesklier eruit, dompel hem onder in koude HBSS en transporteer hem onmiddellijk naar de isolatiefaciliteit voor eilandjes.
      OPMERKING: De varkens werden geëuthanaseerd met pentobarbital-natrium (100-200 mg/kg). Intraductale infusie van HBSS of conserveringsoplossing kan worden gebruikt om de alvleesklier uit te zetten op de plaats van orgaanverkrijging als alvleesklieren worden verkregen in het plaatselijke slachthuis.

3. Bereid drie bioveiligheidskasten voor op de volgende experimenten

  1. Zet bioveiligheidskast #1 op met nierbassin, chirurgische instrumenten en bekers voor het reinigen van de alvleesklier (sectie 4, figuur 1A).
  2. Zet bioveiligheidskast #2 op met een waterbad, peristaltische pomp, buisstandaard met de recirculatiebuis en een vergistingskamer voor eilandjesspijsvertering (sectie 5, Figuur 1B).
  3. Zet bioveiligheidskast #3 op met wegwerpfilters en centrifugebuisjes voor enzymbereiding, eilandjeszuivering en de volgende stappen (secties 6-8, Figuur 1C).

4. Alvleesklier reinigen

  1. Reinig en weeg de alvleesklier.
    1. Spoel de alvleesklier gedurende 3 minuten af met 200 ml jodofoor in bioveiligheidskast #1. Spoel de alvleesklier twee keer af met 200 ml koude HBSS, elk 2 minuten.
    2. Doe de gereinigde alvleesklier in een nierbassin met 100 ml reinigingsmedium op ijs.
    3. Houd de ampulla vastgeklemd, snijd de twaalfvingerige darm terug. Reinig de alvleesklier van uitwendig vet en bindweefsel.
    4. Weeg de alvleesklier.

5. Spijsvertering van de alvleesklier

  1. Infusie van collagenase
    1. Snijd een dwarsdoorsnede van een van de ringvormige takken van de alvleesklier en steek een angiocath van 18 G (als de kanaaldiameters kleiner zijn, overweeg dan een angiocath van 20 G) in de hoofdductus van de alvleesklier en hecht deze op zijn plaats met een 2-0 gevlochten zijden hechtdraad.
    2. Snijd de weefselbrug af die door de verbindingskwab bij de kop van de alvleesklier loopt en klem de katheter aan de zijkant van de incisie bij de kop van de alvleesklier om enzymlekkage te verminderen.
    3. Plaats meerdere angiocaths voor een betere intraductale enzyminfusie. Breng hiervoor extra angiocaths (maat 20-22 G) in na het doorsnijden van het pancreasorgaan om het kanaal bloot te leggen.
    4. Installeer de vulleiding, inclusief een siliconenslang van 1 m (16#) met een Luer-lock-connector. Het middelste deel van de slang is ingebed in de peristaltische pompkop.
    5. Zet de slangenpomp aan om het slangsysteem te vullen (slangmaat 16#) 300 ml 1 mg/ml, Collagenase Type V (activiteit: 918 eenheden/mg) voorverwarmd tot 24 °C en verwijder luchtbellen in de leidingen.
    6. Sluit de perfusieslang aan op de angiocath en zet de slangenpomp aan met een snelheid van 20 ml/min.
    7. Stop de perfusie wanneer het grootste deel van het enzym is toegediend en de alvleesklier goed is opgezwollen (Figuur 2B).
    8. Snijd het heldere gelatineuze weefsel dat zich tijdens de perfusie rond de alvleesklier vormt.
      OPMERKING: Deze stap is erg belangrijk omdat de gel het filter in de kamer kan verstoppen en het moeilijk kan maken om het verteerde weefsel op te vangen (Figuur 2B).
    9. Verwijder de angiocaths na infusie.
  2. Weefselvertering
    1. Verwarm 1 L HBSS-oplossing voor op 36 °C. Bereid het vergistingssysteem, bestaande uit de ontgistingskamer en de slangen die op een gesloten systeem zijn aangesloten, van tevoren voor en breng de verwarmingsspiraal van het circuit over in een waterbad van 36 °C.
    2. Snijd de alvleesklier in 3-4 stukken en giet ze met Collagenase Type V in een bekerglas van 500 ml.
    3. Dek het bekerglas af met een steriel petrischaaltje, breng het over naar bioveiligheidskast #2 en doe de inhoud van het bekerglas in de digestiekamer met vier gesiliconiseerde glazen knikkers en een maaswijdte van 500 μm.
    4. Sluit de kamer en draai de schroeven vast. Doe het resterende enzym in de recirculatiebeker en zet de slangenpomp aan met een snelheid van 80 ml/min.
    5. Voeg warme HBSS-oplossing toe (meestal ongeveer 150 ml) die is voorverwarmd bij stap 5.2.1 om het circuit tot voltooiing te vullen. Schud de kamer voorzichtig en draai hem om zodat de gesiliconiseerde glazen knikkers het weefsel raken.
      OPMERKING: Aangezien varkenseilandjes delicater zijn dan menselijk weefsel, moet het schudden gelijkmatig en langzaam zijn om schade te voorkomen. Terwijl het weefsel verteert, zal het uit elkaar vallen en uit de kamer stromen.
    6. Neem elke 2 minuten een monster (ongeveer 1 ml) van het circuit om te controleren of er vrije eilandjes zijn na 1 minuut schudden.
    7. Plaats het monster in een plaat met 6 putjes met 80 μL dithizon (DTZ). Voeg 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en onderzoek het monster onder de microscoop met een vergroting van 40x. DTZ zal eilandjes rood kleuren.
  3. Verzameling van de digesten
    1. Ga door met de spijsvertering totdat vrije eilandjes worden waargenomen (zelfs als er nog veel gedeeltelijk vastzitten in de exocriene).
      OPMERKING: Het vrijgeven van eilandjes duurt ongeveer 10-15 minuten, maar de verteringstijd wordt vaak beïnvloed door de leeftijd van de donor, de enzympartijen, de concentratie van het enzym, enz.
    2. Open het circuit en verzamel het vrijgekomen weefsel in flessen van 1 L. Houd de flesjes op ijs tijdens het verzamelen om de Collagenase Type V te helpen inactiveren.
    3. Voeg de resterende warme HBSS-oplossing (~850 ml, stap 5.2.1) toe aan de recirculatiebeker en vang het resterende verteerde weefsel op uit de digestiekamer.
    4. Voeg koud verzamelmedium toe aan de kamer (via de recirculerende beker).
      OPMERKING: Stop met verzamelen wanneer weefselpellets kleiner worden. De inzamelfase (stappen 5.3.2-5.3.3) kan tot 40-75 minuten en 5-8 L aan verzamelmedia in beslag nemen.
    5. Breng het weefsel uit de opvangfles over in conische centrifugebuisjes van 250 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g bij 4 °C.
    6. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer het weefsel opnieuw in 500 ml vers verzamelmedium.
    7. Ga door met het combineren van de celpellets tot een koud verzamelmedium (500 ml) totdat al het digestaat is verzameld.
    8. Was de celpellet die in het koude medium is gesuspendeerd door centrifugeren (3 min bij 200 x g, 4 °C).
    9. Gooi het bovenstaande weg. Evalueer en kwantificeer de celpellet volgens de stappen vermeld in de paragrafen 6-8.
      OPMERKING: Het uiteindelijke volume is afhankelijk van de grootte van de alvleesklier, maar zal naar verwachting binnen 40-80 ml liggen.

6. Zuivering van eilandjes

  1. Zuiver de varkenseilandjes door scheiding van dichtheidsgradiënten.
    NOTITIE: Raadpleeg de materiaaltabel voor de details van de gebruikte dichtheidsgradiëntoplossingen.
    1. Voeg 2 ml pancreasweefsel toe aan 50 ml conische buisjes.
    2. Voeg 12 ml 1119 polysucrosegradiënt (1,119 g/cm3) toe om elke 2 ml pancreasweefsel opnieuw te suspenderen.
    3. Voeg achtereenvolgens 10 ml 1083 polysucroseoplossing (1,083 g/cm3), 10 ml 1077 polysucroseoplossing (1,077 g/cm3), 10 ml 1037 polysucroseoplossing (1,037 g/cm3) en 5 ml HBSS toe.
      OPMERKING: 1037 polysucroseoplossing (1,037 g/cm3) wordt bereid door 1077 polysucroseoplossing (1,077 g/cm3) en hypertone citraatpurineoplossing (38,5 ml: 11,5 ml) te mengen.
    4. Centrifugeer bij 900 x g zonder rem gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    5. Zuig de eilandjes op tussen de lagen 1077 polysucroseoplossing en 1037 polysucroseoplossing.
    6. Breng de eilandjes over naar een centrifugebuis van 50 ml, verdeel de vloeistof gelijkmatig over elke buis en balanceer voordat u centrifugeert.
  2. Varkenseilandjes wassen
    1. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, gooi het bovenstaande weg. Voeg het opvangmedium toe om het volume op 45 ml te brengen.
    2. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, waarbij ongeveer 2 ml supernatant overblijft; Schud voorzichtig om te mengen.
    3. Combineer alle pellets in dezelfde centrifugebuis van 50 ml. Voeg het opvangmedium toe om het volume op 45 ml te brengen.

7. Eilandjesequivalenten (IEQ) en eilandjescultuur tellen

  1. DTZ-kleuring van eilandjes
    1. Pool de eilandjes samen, voeg meer verzamelmedium toe om het volume op 250 ml te brengen en suspendeer de eilandjes opnieuw.
    2. Neem 500 μl van het representatieve monster en plaats dit in een schaaltje van 35 mm met 80 μl DTZ. Laat het 1-2 minuten bij kamertemperatuur incuberen en voeg dan 2 ml PBS toe.
    3. Onderzoek met een vergroting van 40x onder een omgekeerde microscoop. Eilandjesaggregaten worden rood gekleurd door de DTZ.
  2. Bevlekte eilandjes tellen
    1. Tel de bevlekte eilandjes door ze in te delen in de groottecategorieën die in tabel 1 worden vermeld. Gebruik de conversiefactor om het eilandjesequivalent (IEQ) te bepalen op basis van de grootte.
      OPMERKING: IEQ-conversie wordt uitgevoerd wanneer het grootste deel van de diameter van de DTZ-positieve aggregaten groter is dan 50 μm (in volwassen (>2 jaar) en sommige preparaten voor jongvolwassenen (6-12 maanden) gaan we verder met stap 7.2.4). In alle andere gevallen (bij jonge varkens jonger dan 6 maanden en bij de overige jongvolwassen varkens) werd het aantal eilandjes geschat op basis van het deeltjesvolume of het DNA-gehalte (volgens de stappen 7.2.2-7.2.3).
    2. (OPTIONEEL) Centrifugeer bij 200 x g bij 4 °C gedurende 2 minuten om de pallets te meten.
    3. (OPTIONEEL) Evalueer het DNA-gehalte van afzonderlijke eilandjes, evenals van de eilandcelpellets met behulp van de celproliferatietestkit. Extrapoleer het aantal bètacellen van varkens uit de DNA-inhoud en immunocytochemische analyse.
    4. Voeg alle categorieën toe en bepaal de totale IEQ voor de steekproef. Vermenigvuldig dat getal met het volume van de breuk. (bijv. 200 IEQ's in 500 μL van een fractie van 250 ml = 200 x 2 x 250 = 100.000 IEQ's).
  3. Eilandje cultuur
    1. Centrifugeer de eilandjes bij 200 x g bij 4 °C gedurende 1 min; Gooi het supernatant weg.
    2. Voeg 5 ml voorverwarmd kweekmedium toe om de eilandjes opnieuw te suspenderen en breng over naar een petrischaaltje van 150 mm.
      OPMERKING: Resuspendeer 10.000 eilandjes/schaal.
    3. Voeg meer kweekmedium toe om het volume in de petrischaal van 150 mm op 30 ml te brengen.

8. Beoordeling van de kwaliteit van de eilandjes

  1. Calceïne AM (CA) -Propidiumjodide (PI) kleuring van eilandjes
    1. Pluk 50 eilandjes met de hand in een plaat met 48 putjes. Eenmaal wassen met 1 ml HBSS.
    2. Voeg 200 μL van het mengsel met 1x CA en 1x PI toe volgens de instructies van de kleuringskit voor de levensvatbaarheid van de cellen.
    3. Dek het petrischaaltje af en plaats het 30 minuten in een broedmachine bij 37 °C.
    4. Visualiseer de eilandjes met een fluorescentiemicroscoop en leg de beelden vast.
    5. Kwantificeer de levensvatbaarheid door de levende cellen (groen) en dode cellen (rood) na CA-PI-kleuring te tellen.
  2. Glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS)
    1. Voeg 1 ml oplossing met een lage glucoseconcentratie toe aan drie putjes van een plant met 24 putjes.
    2. Pluk na ten minste een nachtcultuur met de hand 100 eilandjes van vergelijkbare grootte met een diameter van 100-200 μm en breng ze over in de drie putjes van de plaat met 24 putjes die vooraf zijn gevuld met een oplossing met een lage glucoseconcentratie (zoals in stap 8.2.1).
      OPMERKING: Was de eilandjes in een tussenputje met HBSS voordat u ze in het putje doet om het kweekmedium uit te spoelen.
    3. Incubeer de eilandjes in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    4. Verwijder het bovenstaande voorzichtig met een pipet zonder de eilandjes aan te raken.
    5. Voeg 1 ml nieuwe oplossing met een lage glucoseconcentratie toe.
    6. Incubeer de eilandjes in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 60 minuten.
    7. Verzamel het bovenstaande (geen eilandjes) en breng ten minste 500 μl ervan over in een centrifugebuis van 1,5 ml. Dit bevat insuline die wordt uitgescheiden onder stimulatie met een lage glucose.
    8. Voeg voorzichtig 1 ml oplossing met een hoge glucoseconcentratie toe aan dezelfde putjes.
    9. Incubeer de eilandjes in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 60 minuten.
    10. Breng nog eens 500 μL van het kweekmedium over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Dit bevat insuline die wordt uitgescheiden onder hoge glucosestimulatie.
    11. Gebruik enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)-kits voor insuline bij varkens om de concentratie insuline te meten die vrijkomt na stimulatie met lage en hoge glucose (stappen 8.2.7 en 8.2.10).
      OPMERKING: De stimulatie-index (SI) wordt berekend als de verhouding van de insulineconcentratie gemeten na hoge glucosestimulatie gedeeld door de insulineconcentratie na lage glucosestimulatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De voorbereiding van de bioveiligheidskast is weergegeven in figuur 1. Er worden drie zelfstandige werkruimtes ingericht. Bioveiligheidskast #1 is ingesteld met nierbekkens, chirurgische instrumenten en bekers voor het trimmen van de alvleesklier (Figuur 1A). Bioveiligheidskast #2 is ingesteld met een waterbad, een peristaltische pomp, een buisstandaard met de recirculatiebuis en een vergistingskamer voor de vertering van eiland...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Xenotransplantatie van eilandjes, waarbij varkens als bron van eilandjes worden gebruikt, is een veelbelovende benadering om het tekort aan menselijke eilandjes op te vangen. Hoewel de isolatie van volwassen varkenseilandjes een uitdaging is, hebben verschillende groepen protocollen opgesteld om eilandjes consequent met succes te isoleren 10,11. Ongeacht de methode moeten de levensvatbaarheid van de eilandjes en de functionele ei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We danken professor David K. C. Cooper (Center for Transplantation Sciences, Massachusetts General Hospital) voor zijn hulp bij het opzetten van het hele xenotransplantatiesysteem. We danken Miss Xingling Hu (Shenzhen Second People's Hospital), Miss Xiaohe Tian (University of California, Berkeley), Mr. Bo Zhou (Boston University) voor nuttige discussies en suggesties. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key R&D-programma van China (2017YFC1103701, 2017YFC1103704), speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong (2019) en Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201812079).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm 500 mL wegwerpfilterCorning431097
1 L Plastic fles met blauwe dopCelltransYKBH1
10 mL, 25 mL wegwerppipetCORNING4488
150 mm Petri-schaalBIOLGIX66-1515
1x HBSS basisGIBCOC14175500BT
200 mL kegelvormige  centrifugeerflesFalcon352075
50 mL  centrifugeerbuisNEST602052/430829
500 mL Ricordi ChamberBiorep600-MDUR-03
500-micron maasYikangYKBE
6 welplaatCOSTAR3511
Angiocathether (16G, 18G, 20G)BD682245, 383005, 383012
Anesthesie-apparaatRWDR620-S1
Anesthetica A: Lumianning (2.5–5 mg/kg)Huamu, ChinaAnimal Drugs GMP (2015)
070011777
Anesthetica B: Propofol (2–3 mg/kg)Sigma AldrichS30930-100g
Beker (500 mL, 1000 mL)ShuniuSB500ml, SB1000ml
BloedglucosemeterSinocare2JJA0R05232
Bloedglucose teststripsSinocare41120
Calcein/PI celviabiliteitstestkitBeyotimeC2015M
CMRL 1066Thermo Fisher scientific11530037
Collageenase VSigma AldrichC9263
CyQUANT celproliferatie testkitMolecular ProbesC7026
SpijsverteringskanaalCelltransYKBAO
Wegwerp naald voor bloedafnameFKE20153152149
DithizoneSigma AldrichD5130
SchermenXinwei20182640332
Vlak chassisJinzhongR0B010
Epidural katheterAoocnNr. 20163661148
Heparine natriumChinawanbang99070
HEPESGIBCO15630-080
Histopaque 1077Sigma Aldrich10771-100ml1077 Polysucrose oplossing
Histopaque 1083Sigma Aldrich10831-100ml1083 Polysucrose oplossing
Histopaque 1119Sigma Aldrich11191-100ml1119 Polysucrose oplossing
InfuusbuisBOON20163660440
IodophorLIRCONQ/1400ALX002
IsofluraanRwdlsR510-22-16
Nr. 0-2 hechtdraadJinhuanNr. 20142650770
Nr. 22 chirurgisch mesLianhui2011126
Penicilline/streptomycineGIBCO15140-122
PeristaltiekpompLongerPumpBT300-2J
VarkensserumKangyuan20210601
RPMI-1640 MediumGIBCOC1875500BT
BemonsteringsseringYikangYKBB0
SchaarJinzhongJ11030
Siliconcnitride kralenCelltransYKBI0
Rechte bloedvattangJinzhongJ31120
Rechte zijde van de kanNalgene2118-0001
WeefseltangJinzhongJ41010
WeefselserpJinzhongJ21210
Getande tangJinzhongJD1060
HanddoektangShinva154285
Vacutainer bloedafnamebuisSanli20150049
WaterbadYihengHWS-12

Referenties

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), London, England. 69-82 (2014).
  2. Smith, M. J., Simmons, K. M., Cambier, J. C. B cells in type 1 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 13 (11), 712-720 (2017).
  3. Zullo, A., Sommese, L., Nicoletti, G., Donatelli, F., Mancini, F. P., Napoli, C. Epigenetics and type 1 diabetes: mechanisms and translational applications. Translational Research. 185, 85-93 (2017).
  4. Shapiro, A. M. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews. Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
  5. Warnock, G. L., et al. A multi-year analysis of islet transplantation compared with intensive medical therapy on progression of complications in type 1 diabetes. Transplantation. 86 (12), 1762-1766 (2008).
  6. Foster, E. D., et al. Improved health-related quality of life in a phase 3 islet transplantation trial in type 1 diabetes complicated by severe hypoglycemia. Diabetes Care. 41 (5), 1001-1008 (2018).
  7. Ricordi, C., et al. National Institutes of Health-sponsored clinical islet transplantation consortium phase 3 trial: manufacture of a complex cellular product at eight processing facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  8. Coe, T. M., Markmann, J. F., Rickert, C. G. Current status of porcine islet xenotransplantation. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (5), 449-456 (2020).
  9. Matsumoto, S., Shimoda, M. Current situation of clinical islet transplantation from allogeneic toward xenogeneic. Journal of Diabetes. 12 (10), 733-741 (2020).
  10. Bertera, S., et al. Pig-to-macaque islet xenotransplantation. Methods in Molecular Biology. 2110, Clifton, N.J. 289-314 (2020).
  11. Bertera, S., Marigliano, M., Bottino, R., Trucco, M. Pancreatic islet isolation from swine. Methods in Bioengineering: Cell Transplantation. , Artechhouse. Norwood, MA. 77-99 (2011).
  12. Kim, A., et al. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
  13. Kim, H. -I., et al. Parameters for successful pig islet isolation as determined using 68 specific-pathogen-free miniature pigs. Xenotransplantation. 16 (1), 11-18 (2009).
  14. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  15. Ricordi, C., Finke, E. H., Lacy, P. E. A method for the mass isolation of islets from the adult pig pancreas. Diabetes. 35 (6), 649-653 (1986).
  16. Ulrichs, K., et al. Isolation of porcine pancreatic islets for xenotransplantation. Methods in Molecular Biology. 885, Clifton, N.J. 213-232 (2012).
  17. Dufrane, D., et al. A simple method using a polymethylpenten chamber for isolation of human pancreatic islets. Pancreas. 30 (3), 51-59 (2005).
  18. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Archives of Surgery. 136 (3), 276-279 (2001).
  19. Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Islet isolation from the pancreas of large mammals and humans: 10 years of experience. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes: Official Journal, German Society of Endocrinology [and] German Diabetes Association. 103, Suppl 2 3-14 (1995).
  20. Takei, S., et al. Isolation and function of human and pig islets. Pancreas. 9 (2), 150-156 (1994).
  21. Marchetti, P., et al. Collagenase distension, two-step sequential filtration, and histopaque gradient purification for consistent isolation of pure pancreatic islets from the market-age (6-month-old) pig. Transplantation. 57 (10), 1532-1535 (1994).
  22. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Isolation of porcine pancreatic islets: low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 8 (6), 407-411 (1994).
  23. Noguchi, H. Pancreatic islet purification from large mammals and humans using a COBE 2991 cell processor versus large plastic bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), (2020).
  24. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: Comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  25. Nagaraju, S., Bottino, R., Wijkstrom, M., Trucco, M., Cooper, D. K. C. Islet xenotransplantation: what is the optimal age of the islet-source pig. Xenotransplantation. 22 (1), 7-19 (2015).
  26. Liu, Z., et al. Pig-to-primate islet xenotransplantation: Past, present, and future. Cell Transplantation. 26 (6), 925-947 (2017).
  27. Jiang, X., et al. Islet isolation and purification from inbred Wuzhishan miniature pigs. Xenotransplantation. 19 (3), 159-165 (2012).
  28. Kim, J. H., et al. Influence of strain and age differences on the yields of porcine islet isolation: extremely high islet yields from SPF CMS miniature pigs. Xenotransplantation. 14 (1), 60-66 (2007).
  29. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Influence of porcine strain, age, and pH of the isolation medium on porcine pancreatic islet isolation success. Transplantation Proceedings. 26 (2), 618-620 (1994).
  30. Steffen, A., et al. Production of high-quality islets from goettingen minipigs: Choice of organ preservation solution, donor pool, and optimal cold ischemia time. Xenotransplantation. 24 (1), (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eilandtransplantatievarkenseilandjestype 1 diabetespancreatische b tacellenzuivering van eilandjesxenogene transplantatietekort aan pancreasdonorencellulaire transplantatieglycometabole controle
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen