Het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer

Samenvatting

Dit protocol laat zien hoe de plantengastheer kan worden gebruikt om speekseleiwitten van leafhopper en plantaardige virale eiwitten te detecteren die worden vrijgegeven door leafhopper-vectoren.

Samenvatting

Insectenvectoren brengen horizontaal veel plantenvirussen van agrarisch belang over. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgedragen door hemipteraninsecten die piercing-zuigende monddelen hebben. Tijdens virale overdracht overbrugt het insectenspeeksel de virus-vector-gastheer omdat de speekselvectoren, virussen en de insecteneiwitten de immuunrespons van planten van insecten in plantengastheren activeren of onderdrukken. De identificatie en functionele analyses van speekseleiwitten worden een nieuw aandachtsgebied in het onderzoeksveld van arbovirus-gastheerinteracties. Dit protocol biedt een systeem om eiwitten in het speeksel van leafhoppers te detecteren met behulp van de plantengastheer. De leafhoppervector Nephotettix cincticeps besmet met het rijstdwergvirus (RDV) dient als voorbeeld. Het vitellogenine en het belangrijkste buitenste capside-eiwit P8 van RDV, gevectoreerd door het speeksel van N. cincticeps, kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd in de rijstplant waar N. cincticeps zich mee voedt . Deze methode is toepasbaar voor het testen van de speekseleiwitten die tijdelijk in de plantengastheer worden vastgehouden na insectenvoeding. Er wordt aangenomen dat dit detectiesysteem de studie van hemipteran-virus-plant of hemipteran-plant interacties ten goede zal komen.

Inleiding

De vector-host transmissiemodus van arbovirussen, een fundamenteel probleem, bevindt zich op de grens van de biologische wetenschap. Veel plantenvirussen van agrarisch belang worden horizontaal overgedragen door insectenvectoren¹. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgebracht door hemipteran-insecten, waaronder bladluizen, witte vliegen, leafhoppers, planthoppers en trips. Deze insecten hebben verschillende kenmerken die hen in staat stellen om plantenvirussen efficiënt over te brengen¹. Ze bezitten piercing-zuigende monddelen en voeden zich met het sap van floëem en xyleem, en scheiden hun speeksel

Protocol

De niet-virulifere volwassen leafhoppers werden verspreid in het Vector-borne Virus Research Center in Fujian Agriculture and Forestry University, China.

1. Niet-virulifere insectenkweek

1. Voed de volwassenen op rijstzaailingen op in een kubuskooi van 40 cm x 35 cm x 20 cm (lengte x breedte x hoogte). Houd één kant van de kooi bedekt met een insectenbestendig net voor ventilatie.
   1. Bewaar de kooien met leafhoppers in een incubator met een ingebouwde vochtigheidsregelaar op 26 °C met een relatieve vochtigheid van 60-75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker.
2. Gebruik een aspirator om alle vo....

Resultaten

Figuur 1 illustreert alle stappen in dit protocol: insectenkweek, virusverwerving, het verzamelen van speekseleiwitten via rijstvoeding en de western blot. De resultaten van de western blots toonden aan dat specifieke en verwachte banden van ongeveer 220 kDa werden waargenomen in de monsters van het voeden van rijst en speekselklieren van insecten op het membraan geïncubeerd met antilichamen tegen Vg. Daarentegen werd geen band waargenomen in het niet-voedende rijstmonster. Het resu.......

Discussie

Het speeksel dat direct wordt uitgescheiden door de speekselklieren van de piercing-zuigende insecten speelt een cruciale rol omdat het de weefsels van de gastheer en de cross-kingdom biologische factoren van de gastheer voorverteert en ontgift in de gastheren ^1,3,4. De cross-kingdom biologische factoren, waaronder elicitors, effectoren en klein RNA, zijn van cruciaal belang voor de communicatie tussen insecten en gastheer

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	Voor de bereiding van 5×Tris-glycine buffer en 10×TBS buffer
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	Voor de bereiding van 5×Tris-glycine buffer
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	Voor de bereiding van 5×Tris-glycine buffer
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	Voor de bereiding van 10×TBS buffer
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	Voor de bereiding van 10×TBS buffer
ß-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	Voor de bereiding van 4× proteïne monster buffer
bromofenolblauw	Sigma-Aldrich	SHBL3668	Voor de bereiding van 4× proteïne monster buffer
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Voor de bereiding van 4× proteïne monster buffer
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	Voor de bereiding van transfer buffer
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	Voor de bereiding van TBST
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	Voor membraan blokkering, antilichamen verdunning
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Herkenning van de primaire antilichamen
ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescerende substraat
nitrocellulose membraan	Pall Corporation	25312915	Voor proteïne transfer
Buffers en oplossingen
Buffer	Samenstelling		Opmerkingen/Beschrijving
5×Tris-glycine buffer	15.1 g Tris base 94 g glycine  5 g SDS in 1 L steriele water		Stock oplossing
1×Tris-glycine buffer	200 mL van 5×Tris-glycine buffer 800 mL steriele water		Werk oplossing, voor SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L steriele water		Stock oplossing
TBS met Tween 20 (TBST) oplossing	100 mL 10×TBS oplossing 3 mL Tween 20 900 mL steriele water		Werk oplossing
4× proteïne monster buffer	8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromofenolblauw 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		Voor proteïne extractie
Transfer buffer	800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol		Voor proteïne transfer
Instrumenten
Bromofenolblauw	Sigma-Aldrich	SHBL3668	Voor de bereiding van 4x proteïne monster buffer
Constante temperatuur incubator	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	Voor het fokken van leafhoppers
Elektroforese	Tanon Science & Technology Co.,Ltd.	Tanon EP300	Voor SDS-PAGE
Elektroforese overdracht kern module	BIO-RAD	1703935	Voor SDS-PAGE
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Voor de bereiding van 4x proteïne monster buffer
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	Voor de bereiding van 5x Tris-glycine buffer
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Herkenning van de primaire antilichamen
High-pass weefsel maal instrument	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	Voor het malen van plantweefsels
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	Voor de bereiding van 10x TBS buffer
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	Voor de bereiding van transfer buffer
Mini natte warmte overdracht goot	BIO-RAD	1703930	Voor SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	Voor de bereiding van 10x TBS buffer
nitrocellulose membraan	Pall Corporation	25312915	Voor proteïne transfer
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	Voor membraan blokkering, antilichamen verdunning
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescerende substraat
Proteïne kleur instrument	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	Voor het detecteren van proteïnen
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	Voor de bereiding van 5x Tris-glycine buffer
Tris base	Roche	D609K69032	Voor de bereiding van 5x Tris-glycine buffer en 10×TBS buffer
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	Voor de bereiding van TBST
Verticale plaat elektroforese tank	BIO-RAD	1658001	Voor SDS-PAGE
Waterbad	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	Voor het koken van de proteïne monsters
β-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	Voor de bereiding van 4x proteïne monster buffer