On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Summary

Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.

Abstract

Biochemische reacties en biologische processen kunnen het best worden begrepen door aan te tonen hoe eiwitten overgaan tussen hun functionele toestanden. Aangezien cryogene temperaturen niet-fysiologisch zijn en de structurele dynamiek van eiwitten kunnen voorkomen, afschrikken of zelfs veranderen, is een robuuste methode voor routinematige röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur zeer wenselijk. Het kristal-op-kristalapparaat en de bijbehorende hardware en software die in dit protocol wordt gebruikt, zijn ontworpen om in situ röntgendiffractie bij kamertemperatuur mogelijk te maken voor eiwitkristallen van verschillende groottes zonder enige monstermanipulatie. Hier presenteren we de protocollen voor de belangrijkste stappen van apparaatassemblage, on-chip kristallisatie, optische scanning, kristalherkenning tot röntgenopnameplanning en geautomatiseerde gegevensverzameling. Omdat dit platform geen kristaloogst of andere monstermanipulatie vereist, kunnen honderden tot duizenden eiwitkristallen die op chip worden gekweekt, op een programmeerbare en snelle manier in een röntgenstraal worden geïntroduceerd.

Introduction

Vanwege de ioniserende effecten van röntgenstraling is eiwitkristallografie in de afgelopen drie decennia voor een groot deel beperkt gebleven tot cryogene omstandigheden. Daarom komt de huidige kennis van eiwitbewegingen tijdens zijn functie grotendeels voort uit vergelijkingen tussen statische structuren die in verschillende toestanden onder cryogene omstandigheden worden waargenomen. Cryogene temperaturen belemmeren echter onvermijdelijk de progressie van een biochemische reactie of interconversie tussen verschillende conformatietoestanden terwijl eiwitmoleculen aan het werk zijn. Om de structurele dynamiek van eiwitten direct te observeren bij atomaire resolutie d....

Protocol

1. Voormontage van het apparaat

1. Label de buitenste ring (30 mm diameter) voor monsteridentificatie. Vermeld indien nodig de projectnaam, het apparaatnummer, de kristallisatievoorwaarde en de datum (figuur 1A). Plaats de buitenste ring ondersteboven op een schoon oppervlak (figuur 1B) en plaats voorzichtig een kwartswafer in de ring (figuur 1C). Deze eerste kwartswafer dient als toegangspoort voor de incidentele röntgenfoto's.
2. Giet een kleine hoeveelheid microscoop-dompelolie (viscositeit van 150 cSt) in een petrischaaltje. Dompel een shim in d....

Results

Verschillende representatieve datasets zijn gepubliceerd In de afgelopen jaren^{zijn 10,12} samen met de kristallografische resultaten en wetenschappelijke bevindingen van een breed scala aan eiwitmonsters gepubliceerd, waaronder fotoreceptoreiwitten en enzymen, bijvoorbeeld een plant UV-Breceptor UVR8, een lichtgestuurde DNA-reparatiefotolyase PhrB¹⁰, een nieuw verrood licht detecterend eiwit uit een multi-domein sensorische histidinekinase<.......

Discussion

Eiwitkristallografie in de beginjaren uitgevoerd bij kamertemperatuur ondervond enorme moeilijkheden bij het bestrijden van röntgenstralingsschade. Het is dus vervangen door de robuustere cryocrystallografiemethode toen synchrotron röntgenbronnen direct beschikbaar^{kwamen 20}. Met de komst van röntgenvrije elektronenlasers is de eiwitkristallografie op kamertemperatuur de afgelopen jaren nieuw leven ingeblazen, met veel nieuwe ontwikkelingen gedreven door de wens om de structurele dynamiek van eiwit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Outer ring	In-house developed
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed