3D-reconstructie en analyse van dunne subcellulaire neuronale structuren met behulp van Focused-Ion Beam Scanning Electron Microscopy Data

Summary

Een flexibele methodologische pijplijn voor het identificeren, visualiseren en kwantificeren van dunne subcellulaire neuronale processen binnen beeldvolumes van gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie met behulp van gebruiksvriendelijke open-source softwarepakketten.

Abstract

Recente ontwikkelingen in de technologieën van de scanning-elektronenmicroscoop maken nu de snelle driedimensionale (3D) analyse van ultradunne subcellulaire processen mogelijk. Hier wordt een methodologische pijplijn gepresenteerd om dunne neuronale processen te identificeren, visualiseren en analyseren, zoals die welke projecteren in de presynaptische boutons van andere neuronen ('spinules' genoemd). Met behulp van gratis beschikbare softwarepakketten demonstreert dit protocol hoe een beslissingsboom kan worden gebruikt om gemeenschappelijke neuronale subcellulaire structuren te identificeren met behulp van morfologische criteria binnen beeldvolumes van gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM), met bijzondere aandacht voor het identificeren van een diversiteit aan spinulen die uitsteken in presynaptische boutons. In het bijzonder beschrijft dit protocol hoe spinulen binnen neuronale synapsen kunnen worden getraceerd om 3D-reconstructies te produceren van deze dunne subcellulaire projecties, hun ouderneurieten en postsynaptische partners. Daarnaast bevat het protocol een lijst met gratis beschikbare open-source softwareprogramma's voor het analyseren van FIB-SEM-gegevens en biedt het tips (bijv. Smoothing, belichting) voor het verbeteren van 3D-reconstructies voor visualisatie en publicatie. Dit aanpasbare protocol biedt een toegangspunt tot de snelle analyse op nanoschaal van subcellulaire structuren binnen FIB-SEM-beeldvolumes.

Introduction

Onderzoek naar de structuur-functierelaties van nanometerdunne subcellulaire componenten heeft vaak baat bij 3D-visualisatie en -analyse¹. Studies met elektronenmicroscopie in seriële doorsnede zijn echter tijdelijk en ruimtelijk beperkt door de noodzaak om een diamantmes te gebruiken om honderden tot duizenden seriële ultradunne secties van ≥40 nm te snijden en uit te lijnen. Deze beperkingen hebben de mogelijkheid beperkt om dunne subcellulaire structuren (<40 nm in diameter) te bemonsteren en effectief te analyseren, en de noodzaak om bedreven te worden in ultradunne seriële doorsnede heeft de toepassing van....

Protocol

1. Beeldvolumegegevens en subcellulaire objectgrootte: overwegingen en registratie

1. Verkrijg een FIB-SEM-beeldvolume van hoge kwaliteit van het interessegebied dat de subcellulaire objecten bevat.
   OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van segmenten van een FIB-SEM-beeldvolume van de primaire visuele cortex van late adolescente fretten (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, 4 nm isotrope voxels) en een vrij toegankelijk FIB-SEM-volume van de CA1-hippocampus van volwassen ratten (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; 5 nm isotrope voxels) beschikbaar gesteld door het Knott-laboratorium (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Het is van cruciaal be....

Results

Kwantificering van het percentage synaptische spinules binnen de excitatoire presynaptische bouton-populatie in de primaire visuele cortex van fretten
Hoewel spinule-achtige uitsteeksels van neurieten in excitatoire presynaptische boutons al tientallen jaren worden waargenomen^19,26, is hun potentiële belang voor de synaptische functie onduidelijk gebleven. Deze experimenten waren ontworpen om het aandeel van e.......

Discussion

Deze FIB-SEM-pijplijn voor het analyseren van beeldvolumes kan betrouwbare 3D-reconstructies en kwantitatieve metingen van dunne subcellulaire structuren produceren. Hoewel de huidige semi-geautomatiseerde technieken die gebruik maken van diepe neurale netwerk- en segmentatie-algoritmen de snelheid en efficiëntie kunnen verhogen bij het reconstrueren van cellulaire structuren met een relatief hoog membraancontrast binnen grote beeldvolumes³³, zullen veel subcellul.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org