3D-reconstructie en analyse van dunne subcellulaire neuronale structuren met behulp van Focused-Ion Beam Scanning Electron Microscopy Data

Summary

Een flexibele methodologische pijplijn voor het identificeren, visualiseren en kwantificeren van dunne subcellulaire neuronale processen binnen beeldvolumes van gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie met behulp van gebruiksvriendelijke open-source softwarepakketten.

Abstract

Recente ontwikkelingen in de technologieën van de scanning-elektronenmicroscoop maken nu de snelle driedimensionale (3D) analyse van ultradunne subcellulaire processen mogelijk. Hier wordt een methodologische pijplijn gepresenteerd om dunne neuronale processen te identificeren, visualiseren en analyseren, zoals die welke projecteren in de presynaptische boutons van andere neuronen ('spinules' genoemd). Met behulp van gratis beschikbare softwarepakketten demonstreert dit protocol hoe een beslissingsboom kan worden gebruikt om gemeenschappelijke neuronale subcellulaire structuren te identificeren met behulp van morfologische criteria binnen beeldvolumes van gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM), met bijzondere aandacht voor het identificeren van een diversiteit aan spinulen die uitsteken in presynaptische boutons. In het bijzonder beschrijft dit protocol hoe spinulen binnen neuronale synapsen kunnen worden getraceerd om 3D-reconstructies te produceren van deze dunne subcellulaire projecties, hun ouderneurieten en postsynaptische partners. Daarnaast bevat het protocol een lijst met gratis beschikbare open-source softwareprogramma's voor het analyseren van FIB-SEM-gegevens en biedt het tips (bijv. Smoothing, belichting) voor het verbeteren van 3D-reconstructies voor visualisatie en publicatie. Dit aanpasbare protocol biedt een toegangspunt tot de snelle analyse op nanoschaal van subcellulaire structuren binnen FIB-SEM-beeldvolumes.

Introduction

Onderzoek naar de structuur-functierelaties van nanometerdunne subcellulaire componenten heeft vaak baat bij 3D-visualisatie en -analyse¹. Studies met elektronenmicroscopie in seriële doorsnede zijn echter tijdelijk en ruimtelijk beperkt door de noodzaak om een diamantmes te gebruiken om honderden tot duizenden seriële ultradunne secties van ≥40 nm te snijden en uit te lijnen. Deze beperkingen hebben de mogelijkheid beperkt om dunne subcellulaire structuren (<40 nm in diameter) te bemonsteren en effectief te analyseren, en de noodzaak om bedreven te worden in ultradunne seriële doorsnede heeft de toepassing van 3D-structurele analyses belemmerd ^2,3. Recente ontwikkelingen op het gebied van gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) hebben echter een revolutie teweeggebracht in de snelheid en resolutie van verkrijgbare beeldvolumes en maken nu de kwantitatieve analyse mogelijk van dunne subcellulaire structuren zoals gladde endoplasmatische reticula ^4,5, neuronale synapsen ^3,6 en synaptische blaasjes ^7,8 op schaal. Bovendien heeft een breder gebruik van FIB-SEM-beeldvolumes de ontwikkeling versneld van vrij toegankelijke FIB-SEM-beeldvolumeopslagplaatsen⁹ en 3D-analysesoftware (bijv. Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴) die het bereik van deze technologie vergroten en nu onderzoek mogelijk maken naar de structuur en functie van fijne subcellulaire structuren.

Een van die subcellulaire kenmerken op nanoschaal is de neuronale synaptische 'spinule'. Spinules zijn dun (~0,06-0,15 μm breed, 0,1-1 μm lang), vingerachtige uitsteeksels die afkomstig zijn van het ene neuron en worden ingekapseld door de neuriet (bijv. presynaptische bouton) van een ander neuron^15,16. Spinules ingebed in neuronale processen worden al bijna 60 jaar gerapporteerd in de literatuur over elektronenmicroscopie¹⁷, en spinule-achtige uitsteeksels zijn een geconserveerd 18,19,20 en alomtegenwoordig ^21,22 kenmerk van excitatoire synapsen. Desalomtegenwoordig, ondanks de alomtegenwoordigheid van synaptische spinules, blijven hun functie(s) onduidelijk en is er een gebrek aan noodzakelijke gegevens om hun overvloed en structurele conservering te verklaren. Dit gebrek aan experimentele karakterisering van spinules is voornamelijk te wijten aan de moeilijkheid om de prevalentie en grootte van spinules kwantitatief te analyseren. Hun kleine afmetingen zijn het meest geschikt voor analyses met een voorheen onbereikbare z (diepte) resolutie (d.w.z. ≤15 nm).

Hier wordt een FIB-SEM-analysepijplijn gepresenteerd voor het identificeren, visualiseren en analyseren van dunne (met doorsneden ≤40 nm breed) subcellulaire structuren die kunnen dienen als toegangspunt voor zowel FIB-SEM-nieuwkomers als experts. Dit protocol dient als een inleiding voor het identificeren van neuronale subcellulaire structuren binnen een 3D FIB-SEM-beeldvolume, waarbij de nadruk wordt gelegd op het gebruik van specifieke criteria om subtypes van spinules en synapsen te herkennen en te classificeren. Bovendien laat het protocol zien hoe beeldvolumes kunnen worden geïmporteerd in een gratis 3D-analysesoftwareplatform (Reconstruct), deze software kan worden gebruikt om spinulen binnen excitatoire neuronale synapsen te traceren en 3D-reconstructies te produceren van deze subcellulaire projecties, hun ouderneurieten en inkapselende presynaptische boutons. Ten slotte laat het protocol zien hoe gratis, open-source 3D-rendingsoftware (Blender) kan worden gebruikt om de 'huid' op 3D-reconstructies glad te strijken voor visualisatie en mogelijke publicatie, waarbij de voordelen en mogelijke valkuilen van deze techniek worden beschreven.

Protocol

1. Beeldvolumegegevens en subcellulaire objectgrootte: overwegingen en registratie

1. Verkrijg een FIB-SEM-beeldvolume van hoge kwaliteit van het interessegebied dat de subcellulaire objecten bevat.
   OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van segmenten van een FIB-SEM-beeldvolume van de primaire visuele cortex van late adolescente fretten (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, 4 nm isotrope voxels) en een vrij toegankelijk FIB-SEM-volume van de CA1-hippocampus van volwassen ratten (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; 5 nm isotrope voxels) beschikbaar gesteld door het Knott-laboratorium (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Het is van cruciaal belang om weefselblokken voor te bereiden voor FIB-SEM met behulp van een protocol dat ultrastructurele details behoudt en een hoog contrast produceert onder FIB-SEM-beeldvormingsomstandigheden^23,24. Belangrijk is dat het weefsel zo wordt afgebeeld dat de resulterende FIB-SEM-beeldvoxelresolutie <0,5 × de grootte van de diameter van de kleinste subcellulaire structuur van belang is. Omdat de plaatsen van spinule-uitsteeksel in presynaptische boutons bijvoorbeeld zo klein kunnen zijn als 30 nm in diameter, zou een voxelgrootte van <15 nm geschikt zijn om deze structuren boven het Nyquist-criterium te bemonsteren. Bovendien is het nuttig om weefsel af te beelden met een isotrope (gelijk in alle dimensies) resolutie (bijv. 5 x 5 x 5 nm voxels) om visualisatie en reconstructie mogelijk te maken van fijne structuren die gelijke afmetingen hebben in alle x/y/z-vlakken.
2. Download en installeer de Fiji-distributie van ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
3. Lijn het beeldvolume uit.
   OPMERKING: Hoewel moderne FIB-SEM-systemen ruw uitgelijnde beeldvolumes produceren, kan de beeld-naar-beeldregistratie nog steeds last hebben van subpixeldrift.
   1. Navigeer in Fiji naar Plug-ins | Registreer en kies Virtual Stack Slices registreren. Raadpleeg de gebruikershandleiding voor hulp (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Begin met een Rigid-registratie en gebruik vervolgens indien nodig een Affine-techniek.
4. Schaal het afbeeldingsvolume.
   1. Open het uitgelijnde afbeeldingsvolume in Fiji door te klikken op Bestand | Invoer | Afbeeldingsvolgorde en navigeren naar de map met de uitgelijnde afbeeldingen.
   2. Klik in het dialoogvenster op Namen numeriek sorteren als de afbeeldingen in numerieke volgorde worden genoemd. Klik op Virtuele stack gebruiken voor snellere prestaties in Fiji.
   3. Zodra de afbeelding is geopend, klikt u op Afbeelding | Eigenschappen en voeg de fysieke grootte van de pixels van het afbeeldingsvolume in micrometers in de vakken voor pixelhoogte, -breedte en -diepte in. Typ um OF μm in elk van de meest rechtse vakken. Sla dit uitgelijnde afbeeldingsvolume op als een .tiff bestand door te klikken op Bestand | Opslaan als | Tiff.
      OPMERKING: Als de afbeelding is geschaald, moet de bovenkant van de afbeelding nu de grootte van de afbeelding in micrometers aangeven (bijv. 9,82 x 8,65 μm).

2. Identificatie van neurite en synaptische spinule

1. Terwijl u door de stapel bladert (met behulp van de pijltoetsen of het muiswiel), raadpleegt u de beslissingsboom voor neurietidentificatie (Figuur 1) en voorbeelden van gesegmenteerde neurieten (Figuur 2) om de interessante objecten te lokaliseren en te identificeren.
   1. Identificeer synaptische spinulen als membraangebonden uitsteeksels van een neuriet die volledig wordt omhuld door een presynaptische of postsynaptische neuriet.
      OPMERKING: Positieve synaptische spinule-identificatie vereist visueel bewijs van het spinule-uitstekende objectmembraan dat invaginaert in het omgekeerde membraan van een presynaptische of postsynaptische structuur en de aanwezigheid van de membraangebonden spinule die volledig is ingekapseld door het membraan van de pre- of postsynaptische structuur in ten minste één afbeelding.
2. Regio's van belang (ROI's) maken in Fiji
   1. Klik op een geschikte tool in de Fiji-werkbalk (bijv. ovale tool) en klik en sleep vervolgens op de afbeelding om een ROI te vormen. Leg deze ROI vast in de ROI Manager door de letter 'T' te typen.
      OPMERKING: De ROI Manager zou nu moeten verschijnen met de afbeeldingscoördinaten als standaardnaam.
   2. Wijzig de naam van de ROI naar wens door op de knop Naam wijzigen in de ROI-manager te klikken en de gewenste naam te typen in het tekstvak dat verschijnt. Hernoem ROI's op basis van kwantitatieve criteria (bijv. de 12e presynaptische bouton die wordt geanalyseerd en twee synapsen heeft met postsynaptische stekels, kan B12_s,s worden genoemd).
      OPMERKING: Als u elke ROI wilt koppelen aan één "segment" van een afbeelding (in plaats van dat deze in de hele afbeeldingsstapel aanwezig is) en om ROI-namen zichtbaar te maken op afzonderlijke afbeeldingen, klikt u op deze opties in de ROI Manager | Meer | Opties en klik vervolgens op de selectievakjes Alles en Labels weergeven onder aan de ROI-Manager. Houd er rekening mee dat deze stap cruciaal is bij het opslaan van ROI's binnen een afbeeldingsvolume, omdat het koppelen van ROI's aan het volledige afbeeldingsvolume in plaats van individuele afbeeldingen kan leiden tot dubbeltelling van objecten binnen het volume.
   3. Als u alle ROI's die zich momenteel in de ROI-manager bevinden, wilt opslaan als een bestand, klikt u eerst op de knop Deselecteren in de ROI-manager, klikt u op de knop Meer en scrolt u omlaag naar Opslaan.
      OPMERKING: Dit opgeslagen .zip-bestand kan nu worden geopend in Fiji om al deze ROI's opnieuw te laden in de ROI Manager.

3. Bepaal het interessegebied en breng het beeldvolume over naar 3D-analysesoftware

1. Bepaal of het wenselijk is om het volledige beeldvolume over te brengen naar de 3D-reconstructie- en analysesoftware, of dat er een kleinere substack (zie 3.3.2) moet worden gemaakt om een kleiner aantal afbeeldingen en/of interessegebieden van de oorspronkelijke stack te analyseren.
2. Voer een kleine 'pilot'-studie uit op een relatief klein gebied met de objecten die van belang zijn om de effectgrootte te schatten en het aantal interessante objecten dat nodig is om de gewenste sterkte voor statistische vergelijkingen te verkrijgen. Gebruik een conservatieve schatting van de grootte van het beeldvolume dat nodig is om de objecten van belang te bemonsteren als deze subcellulaire objecten niet gelijkmatig zijn verdeeld binnen het beeldvolume.
3. Als u een deel van het afbeeldingsvolume wilt gebruiken voor 3D-analyse, dupliceert u eerst het afbeeldingsvolume door op Afbeelding | Dupliceren.
   1. Als u een bijgesneden deel van de afbeelding wilt gebruiken voor analyse, kiest u de rechthoekige tool op de werkbalk van Fiji en tekent u het gewenste interessegebied; Als dit niet gewenst is, ga dan verder met de volgende stap.
   2. Ga naar afbeelding | Stapels | Gereedschap | Maak Substack. Typ het bereik van afbeeldingen die in de substack moeten worden opgenomen (neem bijvoorbeeld afbeeldingen 1 tot 500 op door 1 - 500 te typen) in het tekstvak.
   3. Raadpleeg de bovenstaande bemonsteringsoverwegingen (opmerking na 1.1) om de vereiste z-resolutie te bepalen op basis van de grootte van het object of de objecten van belang. Als het beeldvolume bijvoorbeeld een voxeldiepte van 5 nm heeft, is het mogelijk om het object van interesse te bemonsteren met intervallen van 10 nm in de z-dimensie, zodat Fiji elk ander beeld in de substack behoudt. Typ hiervoor het nummer van de n-de afbeelding na het bereik (typ bijvoorbeeld 1 - 500 - 2 om alleen elke andere afbeelding in een afbeeldingsbereik van 1 - 500 op te nemen).
      OPMERKING: Elk softwarepakket voor 3D-analyse (zie tabel 1) heeft zijn eigen vereisten voor het importeren van bestanden. Dit protocol richt zich op het importeren van afbeeldingsvolumes die zijn opgeslagen als .tiff bestanden in de software voor afbeeldingsvolumes, Reconstruct.

4. 3D reconstructies en analyse van dunne subcellulaire structuren in Reconstruct

OPMERKING: Het is zeer voordelig om een muis te gebruiken die is uitgerust met een wiel tijdens het gebruik van Reconstruct. Bovendien, als de meeste of alle sporen handmatig worden uitgevoerd, kan het gebruik van een stylus om contouren te tekenen op een computer met een touchscreen de efficiëntie van de tracering drastisch verhogen.

1. Download en installeer Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) voor gebruik op een computer met Microsoft Windows in een native of virtuele omgeving.
2. Start een nieuwe reconstructie door een nieuwe map voor de reconstructiebestanden aan te maken en te klikken op Serie | Nieuw, en het opslaan van deze reconstructie (.ser bestand) met de gewenste bestandsnaam in de map die zojuist is aangemaakt.
3. Importeer het opgeslagen .tiff afbeeldingsvolume in Reconstruct.
   1. Navigeer naar Serie | Invoer | Afbeeldingen, klik op Selecteren in het venster Afbeeldingen importeren en zoek het afbeeldingsvolumebestand. Zoek in het venster Afbeeldingen importeren naar de volumebestanden voor afbeeldingen die als een afzonderlijke regel voor elke afbeelding in het volume worden weergegeven.
   2. Belangrijk: Typ de juiste pixelgrootte in het tekstvak Pixelgrootte die overeenkomt met de x/y-pixelgrootte (in μm) van het afbeeldingsvolume. Zodra dit is gebeurd, klikt u op de knop Importeren in het venster Afbeeldingen importeren .
      OPMERKING: Nadat de afbeeldingen zijn geïmporteerd, moet er een afbeelding in het midden van het venster Reconstructie staan en moet de lijst met Afbeeldingen importeren leeg zijn.
   3. Als er een afbeelding in het midden van het venster Reconstructie staat en de lijst Afbeeldingen importeren leeg is, klikt u op Afsluiten in het venster Afbeeldingen importeren .
   4. Stel de sectiedikte in (d.w.z. voxelhoogte of z-dimensie) door op Sectie | Maak een lijst van secties, markeer alle vermelde secties en klik vervolgens op Wijzigen | Dikte in het menu Sectielijst en typ de sectiedikte (in μm) in het tekstvak (bijvoorbeeld 0,005 voor een sectie van 5 nm dik).
      OPMERKING: Bedenk dat als u werkt met een substack van een groter origineel afbeeldingsvolume dat slechts elke n-de sectie bevat (zie stap 3.3.3), het noodzakelijk is om rekening te houden met deze 'ontbrekende' secties in de totale sectiedikte. Als de sectiedikte van het oorspronkelijke afbeeldingsvolume (ook wel voxelhoogte genoemd) bijvoorbeeld 0,005 μm was en de substack slechts elke derde sectie bevat (bijv. 1-500-3), is de sectiedikte van deze substack 0,015 μm (d.w.z. 0,005 μm x 3 secties).
4. Maak sporen van de interessante objecten.
   1. Ga naar serie | Opties | Tabblad Namen/Kleuren om het nieuwe object een naam te geven. Kies een kleur voor de omtrek en de binnenvulling van de sporen van het object en klik vervolgens op OK.
      OPMERKING: Reconstruct zal proberen alle sporen met dezelfde naam als één object met elkaar te verbinden. Raadpleeg de handleiding Reconstrueren voor naamgevingsconventies voor sporen (neem bijvoorbeeld geen spaties op in namen). Sporenkleuren zijn alleen bedoeld voor het visualiseren van sporen; de kleur van de 3D-reconstructie van dit object kan later gemakkelijk worden gewijzigd.
   2. Selecteer op de werkbalk het gereedschap Tekenen uit de vrije hand dat eruitziet als een potlood. Houd de linkermuisknop ingedrukt en sleep de muis om het membraan van het object te traceren; Laat de linkermuisknop los om de tracering automatisch aan te vullen. Klik op Pagina omhoog / Pagina omlaag of gebruik het muiswiel om naar het volgende optische gedeelte in het afbeeldingsvolume te gaan en geleidelijk sporen aan te brengen totdat de structuur is voltooid.
5. Traceren van synaptische spinules
   OPMERKING: Ingebedde spinulen in presynaptische boutons verschijnen als membraangebonden transparante structuren, soms met actine-achtig elektron-ondoorzichtig materiaal en/of membraanachtige plooien in hun binnenste.
   1. Ga door het beeldvolume en lokaliseer de plaats van spinule-invaginatie in de presynaptische bouton, waarbij u voorzichtig bent om spinules te onderscheiden van endoplasmatische reticula, vacuolen, endosomen, autofagosomen en andere subcellulaire organellen.
      OPMERKING: In tegenstelling tot membraangebonden organellen, moet u ervoor zorgen dat synaptische spinulen altijd uitsteken (d.w.z. naar buiten gekeerd membraan) een neuriet/glia en worden ontvangen door (d.w.z. omgekeerd membraan) een pre- of postsynaptische structuur. Dit visuele bewijs van spinule-invaginatie zou moeten optreden in ≥2 beelden, en een volledig ingekapselde membraangebonden spinule zou aanwezig moeten zijn in de pre- of postsynaptische structuur in ≥1 beeld. Kleine stekels kunnen met clathrine bedekt zijn. Om spinule-invaginatiegebeurtenissen te onderscheiden van met clathrine gecoate endocytose in de pre- of postsynaptische neuriet, moet ervoor worden gezorgd dat positieve identificatie van met clathrine beklede spinules visuele bevestiging vereist van het samenvallende kerende membraan van het spinule-moederobject dat uitsteekt in het inverterende membraan van een pre- of postsynaptische structuur binnen hetzelfde beeld.
   2. Ga door het beeldvolume om de plaats van spinuleprojectie/oorsprong van de ouderneuriet/glia te lokaliseren; zie Figuur 1 en Figuur 2 om deze bovenliggende structuren te helpen identificeren.
   3. Begin met het traceren van de spinule op de plaats van het membraanuitsteeksel in de ontvangende structuur (bijv. presynaptische bouton) en ga door met het tekenen van de spinule zolang deze verschijnt als een membraangebonden structuur in de inkapselende pre- of postsynaptische neuriet.
   4. Blijf de linkermuisknop ingedrukt houden (of blijf langs het spinulemembraan tekenen met een stylus als u een computer met aanraakscherm gebruikt) terwijl u het membraan van de spinule volgt met de muisaanwijzer.
   5. Wanneer het punt is bereikt waar de trace begon, laat je de linkermuisknop los.
      OPMERKING: Als u de linkermuisknop te snel loslaat, wordt de tracering automatisch voltooid, vaak met ongewenste resultaten. Als dit gebeurt, drukt u gewoon op verwijderen terwijl deze tracering is gemarkeerd in de traceerlijst.
   6. Herhaal stap 4.5.2-4.5.5 voor elk gedeelte waar de spinule verschijnt.
      OPMERKING: Vergeet niet om de spinule te traceren als een ingekapselde membraangebonden structuur in de bouton, indien van toepassing. Omdat Reconstruct niet toestaat dat ingekapselde subcellulaire structuren (bijv. spinules, subcellulaire organellen) automatisch worden afgetrokken van het volume van de inkapselende structuur, kan dit post-hoc worden uitgevoerd (bijv. door simpelweg het spinulevolume af te trekken van het totale volume van de presynaptische bouton).
6. Objecten reconstrueren in 3D in Reconstruct
   1. Navigeer naar Serie | Opties | 3D-tabblad en zorg ervoor dat op het keuzerondje Traces wordt geklikt.
   2. Open de objectenlijst door te klikken op Objecten | Objecten weergeven.
   3. Zodra de namen van de getraceerde objecten in het venster zijn geladen, dubbelklikt u op de naam van de objecten in de objectenlijst om ze in 3D te bekijken. Wacht tot het venster 3D-scène verschijnt.
   4. Zorg ervoor dat het begin, het einde en het aantal van de traceringen correct zijn in de objectlijst voor elk object, zodat het aantal = einde - begin. Als de Count ≠ End - Start voor een object is, kunnen een of meer sporen van dit object per ongeluk zijn weggelaten.
   5. Draai de 3D-sporen van het object of de objecten door de linkermuisknop ingedrukt te houden en de muis te bewegen en/of de rechtermuisknop ingedrukt te houden en de muis naar voren en naar achteren te bewegen om in en uit te zoomen. Zorg ervoor dat de sporen van het object op de juiste manier zijn uitgelijnd en dat er een vloeiende overgang lijkt te zijn tussen elke opeenvolgende route.
   6. Traceer indien nodig individuele sporen om fouten te verwijderen die leiden tot scherpe randen en/of overgangen tussen sporen.
   7. Plaats een tetraëdrische mesh-skin op het object door naar Serie | Voorwerp | 3D-tabblad en klik op de radioknop van het Boissonnat-oppervlak .
   8. Klik in het venster 3D-scène op Scène | Wis en dubbelklik vervolgens op de gewenste objectnaam in de objectenlijst.
   9. Roteer het object of de objecten om vloeiende overgangen tussen sporen te garanderen en teken sporen indien nodig opnieuw.
   10. Als u de kleuren en transparantie van objecten wilt wijzigen, klikt u op de naam van het object in de objectenlijst en klikt u vervolgens op Scène | Kleur/transparantie... in het menu Objectenlijst . Dubbelklik op de objectnaam in Objectenlijst om deze wijziging in het venster 3D-scène weer te geven.
       OPMERKING: De kleur, transparantie en afvlakking van het object kunnen met een grotere mate van controle en specificiteit worden gewijzigd met behulp van Blender (zie 5.4-5.6).
7. Kwantitatieve analyse van 3D-objecten
   1. Navigeer naar Serie | Opties | Lijst en klik op alle gewenste afmetingen in de secties Objectlijst en Traceerlijst van dit venster.
   2. Exporteer de objectafmetingen door de objectlijst (Object | Lijst objecten...) en vervolgens op Lijst | Opslaan.
   3. Sla de objectafmetingen op zoals weergegeven in de objectenlijst als een door komma's gescheiden bestand (.csv).
   4. Importeer het .csv bestand in de data-analysesoftware van uw keuze. Als u het bestand wilt importeren (bijv. Microsoft Excel), dubbelklikt u op het bestand of opent u een nieuwe lege werkmap, klikt u op Bestand | Invoer | CSV-bestand en volg de instructies.
   5. Om de afstanden tussen objecten in 3D te meten (bijvoorbeeld om de projectieafstand van een synaptische spinule binnen een presynaptische bouton te meten), gebruikt u de Z-trace-functie in Reconstruct.
   6. Geef eerst de tracering een nieuwe naam door naar de serie | Opties | Tabblad Namen/Kleuren en het typen van een naam voor de Z-trace.
   7. Klik vervolgens op de Z-trace tool in de werkbalk.
   8. Om het Z-spoor van de projectieafstand van een synaptische spinule te tekenen, klikt u op het begin van de synaptische spinule door op de linkermuisknop te klikken en drukt u vervolgens op de knoppen Page Up of Page Down om door het beeldvolume te gaan terwijl u op opeenvolgende punten langs het membraan van de synaptische spinule binnen elke sectie klikt.
   9. Maak deze Z-trace compleet door op de rechtermuisknop te klikken.
   10. Exporteer Z-trace metingen door te klikken op Trace | Lijst sporen... om de Trace List te openen en vervolgens op Lijst | Opslaan om de metingen van de traceerlijst op te slaan als een .csv bestand.
8. Een schaalkubus toevoegen
   1. Navigeer naar een van de eerste of laatste afbeeldingen in de stapel
   2. Ga naar serie | Opties | Namen/Kleuren tabblad en typ een naam voor de schaalkubus.
   3. Kies op de werkbalk het gereedschap Rechthoek tekenen en teken een klein vierkantje (grootte onbelangrijk) naast de objecten, maar zonder ze te verbergen. Ga naar serie | Opties | 3D-tabblad, klik op de keuzerondje Vak in het gebied Genereren en geef de grootte van de schaalkubus (in μm) op door de afmetingen in de vakken A:, B:, C: in het gebied Grootte te typen (typ bijvoorbeeld 0,5 voor A, B en C om een kubus van 0,5 μm/zijschaal te genereren).
      OPMERKING: Voordat u probeert de schaalkubus in 3D te reconstrueren, moet u ervoor zorgen dat de gewenste 3D-objecten al in de 3D-scène zijn gereconstrueerd met behulp van de Traces - of Boissonnat-oppervlakteoptie . Vergeet niet om de optie Genereren terug te zetten naar het Boissonnat-oppervlak en de maten van A, B en C terug naar -1 na het reconstrueren van de schaalkubus (d.w.z. na stap 4.8.5).
   4. Open de Objectenlijst en dubbelklik op de naam van de schaalkubus; wacht tot de schaalkubus verschijnt in het 3D-scènevenster .
   5. Als u de schaalkubus ten opzichte van de andere objecten wilt verplaatsen, gaat u naar de serie | Opties | 3D-tabblad en typ het aantal μm dat u wilt gebruiken om de schaalkubus in de vakken X, Y en/of Z te plaatsen. Klik op OK om het venster te sluiten en dubbelklik vervolgens op de naam van de schaalkubus in de lijst met objecten.
      OPMERKING: Dit kan ook worden gedaan met Blender (zie hieronder).

5. 3D-reconstructies importeren, opnieuw kleuren, gladstrijken en transparantie toevoegen aan 3D-reconstructies in Blender

OPMERKING: Raadpleeg voor gedetailleerde hulp bij het gebruik van de Blender de handleiding van de Blender en/of de talloze "how to"-video's over het gebruik van elke Blender-functie (zoek gewoon op internet naar Blender EN de gewenste functie). Wat volgt is een korte inleiding over hoe u 3D-reconstructies opnieuw kunt kleuren, gladstrijken en transparant kunt maken.

1. Download en installeer de nieuwste versie van Blender, de gratis, open-source 3D-softwaresuite (www.blender.org).
2. Sla in Reconstructie de 3D-reconstructies op door het (de) gewenste object(en) in het 3D-scènevenster weer te geven en vervolgens op Scène | Exporteren als | VRML 2.0.
3. Navigeer in Blender naar Bestand | Invoer | X3D uitbreidbaar 3D (.x3d/.wrl). Klik op het VRML 2.0-bestand dat is opgeslagen vanuit Reconstruct en klik vervolgens op de knop X3D/VRML2 importeren .
4. Kleur de reconstructies opnieuw.
   1. Klik in het venster Scèneverzameling in de rechterbovenhoek om het oogpictogram voor het standaardkubusobject uit of uit te schakelen en klik op de namen van de afzonderlijke objecten om elk object in de scène te markeren. Wijzig de naam van deze objecten indien van toepassing.
   2. Klik op de naam van het eerste object dat u wilt wijzigen in het venster Scèneverzameling .
   3. Klik op de cirkelvormige context. Materiaalpictogram onder aan de rechterstrook met pictogrammen en klik vervolgens op Materiaal toevoegen. Hieronder zou een lijst met opties moeten verschijnen. Klik vervolgens op de balk naast de optie Basiskleur en kies de gewenste luminantie en tint voor het object.
   4. Om het metaalachtige uiterlijk, de glans en de reflecterende eigenschappen van het object te wijzigen, past u de opties Metallic, Specular, Ruwheid en Glans aan om het gewenste effect te produceren.
      OPMERKING: Om bepaalde opties in de scène te laten verschijnen (bijv. transparantie, glans), kan het nodig zijn om in de instelling Viewport Shading: Look Dev of Viewport Shading: Rendered viewport te staan. Als u naar een van de viewport-instellingen wilt gaan, plaatst u de muisaanwijzer op de wereldbolpictogrammen in de rechterbovenhoek en klikt u op de gewenste viewport-instelling.
   5. Om de belichtingshoek te wijzigen, klikt u op het object Licht in het venster Scèneverzameling , klikt u op het pictogram Gizmo weergeven in de rechterbovenhoek en sleept u het licht vervolgens rond de scène om het gewenste lichteffect te bereiken. Wijzig de lichtintensiteit in het venster Objectgegevens dat onder het venster Scèneverzameling wordt weergegeven wanneer het object Licht is geselecteerd.
   6. Als u objecten in bepaalde assen afzonderlijk wilt roteren, klikt u op de namen van de objecten in het venster Scèneverzameling , drukt u op de R-toets , klikt u vervolgens op de letter van de rotatieas (x-, y- of z-toets ) en beweegt u de muis om de gewenste rotatie te produceren. Als u objecten wilt pakken en verplaatsen, selecteert u ze in het venster Scèneverzameling , drukt u op de G-toets en gebruikt u vervolgens de muis om objecten door de scène te verplaatsen.
5. Remesh (d.w.z. gladmaken) de reconstructies.
   1. Klik op de naam van het object van interesse in het venster Scèneverzameling en gebruik vervolgens de gimball en het muiswiel om het object te centreren en erop in te zoomen.
   2. Klik op het moersleutelpictogram Context.Modifiers op de rechterstrook met pictogrammen, klik op Modifier toevoegen en vervolgens op Opnieuw verbinden (onder de kop Genereren ). Gebruik het vervolgkeuzemenu om Vloeiend te selecteren, klik op de knop Vloeiende arcering en wijzig de Octree-diepte en -schaal om de gewenste vloeiendheid te bereiken.
      OPMERKING: Het is handig om in het Viewport Shading: Wireframe-venster te zijn (optie voor het wereldbolpictogram in de rechterbovenhoek) terwijl u opnieuw mesht om de resultaten direct te bekijken. Door opnieuw in elkaar te grijpen ontstaan er tetraëdrische mazen van verschillende grootte op het object. Zorg er bij het gladstrijken van het object om doorsnede- of overtrekartefacten te verwijderen op dat de oorspronkelijke vorm en contouren behouden blijven. Begin bij een Octree-diepte = 7 en een schaal = 0,95, en verminder deze getallen dan langzaam als dat nodig is. Besteed bijzondere aandacht aan kleine, dunne objecten, zoals spinules en postsynaptische dichtheden, omdat het kleine volume van deze objecten het bereik van afvlakking verkleint dat kan worden gedaan zonder hun oorspronkelijke vorm te veranderen.
6. Voeg transparantie toe aan objecten.
   OPMERKING: Het transparant maken van objecten is belangrijk wanneer het wenselijk is om de 3D-relatie van een object (bijv. spinules, presynaptische blaasjes, mitochondriën, endosomen) in een ander object (bijv. een presynaptische bouton) te laten zien.
   1. Klik op de gewenste objectnaam in het venster Scèneverzameling . Scroll naar de onderkant van de context. Materiaalvenster (pictogram rechtsonder in de rechterlijst), open het gedeelte Instellingen en gebruik het vervolgkeuzemenu om de overvloeimodus te wijzigen in Alfa mengen. Open vervolgens het gedeelte Surface , scrol omhoog naar Alpha en wijzig het getal in een waarde kleiner dan één (1 = volledig ondoorzichtig, 0 = volledig transparant).
7. Exporteer snapshots van de 3D-reconstructies.
   1. Zodra de optimale kleuring, vloeiendheid en belichting voor de 3D-reconstructies zijn verkregen, slaat u de afbeelding op in de scène door op de menukop Venster te klikken en Screenshot opslaan te selecteren.
   2. Kies in de opties Screenshot opslaan linksonder het bestandstype, de kleurindeling en de gewenste compressie.
   3. Typ de naam voor de nieuwe schermafbeelding in het tekstvak van de bestandsnaam hierboven en sla de schermafbeelding vervolgens op de gewenste locatie op.

Results

Kwantificering van het percentage synaptische spinules binnen de excitatoire presynaptische bouton-populatie in de primaire visuele cortex van fretten
Hoewel spinule-achtige uitsteeksels van neurieten in excitatoire presynaptische boutons al tientallen jaren worden waargenomen^19,26, is hun potentiële belang voor de synaptische functie onduidelijk gebleven. Deze experimenten waren ontworpen om het aandeel van e...

Discussion

Deze FIB-SEM-pijplijn voor het analyseren van beeldvolumes kan betrouwbare 3D-reconstructies en kwantitatieve metingen van dunne subcellulaire structuren produceren. Hoewel de huidige semi-geautomatiseerde technieken die gebruik maken van diepe neurale netwerk- en segmentatie-algoritmen de snelheid en efficiëntie kunnen verhogen bij het reconstrueren van cellulaire structuren met een relatief hoog membraancontrast binnen grote beeldvolumes³³, zullen veel subcellul...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org