Methodenartikel

Techniek voor het verkrijgen van mesenchymale stamcel uit vetweefsel en stromale vasculaire fractiekarakterisering bij cryopreservatie op lange termijn

DOI:

10.3791/63036

⸱

30 december 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methodologie voor ADSC-isolatie, wat resulteert in een enorme cellulaire opbrengst met tijdwinst in vergelijking met de literatuur. Deze studie biedt ook een eenvoudige methode voor het verkrijgen van een relatief groot aantal levensvatbare cellen na cryopreservatie op lange termijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel zijn steeds aantrekkelijker geworden omdat ze geschikte kenmerken vertonen en een toegankelijke bron zijn voor regeneratieve klinische toepassingen. Er zijn verschillende protocollen gebruikt om van vetweefsel afgeleide stamcellen te verkrijgen. Dit artikel beschrijft verschillende stappen van een verbeterd tijdbesparend protocol om een grotere hoeveelheid ADSC te verkrijgen, en laat zien hoe ADSC kan worden gecryopreserveerd en ontdooid om levensvatbare cellen te verkrijgen voor kweekuitbreiding. Honderd milliliter lipoaspiraat werd verzameld, met behulp van een 26 cm driegats en 3 mm kaliber spuit liposuctie, uit de buikstreek van negen patiënten die vervolgens electieve abdominoplastiek ondergingen. De stamcelisolatie werd uitgevoerd met een reeks wasbeurten met Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) oplossing aangevuld met calcium en het gebruik van collagenase. Stromale vasculaire fractie (SVF) cellen werden gecryopreserveerd en hun levensvatbaarheid werd gecontroleerd door immunofenotypering. De SVF cellulaire opbrengst was 15,7 x 105 cellen / ml, variërend tussen 6,1-26,2 cellen / ml. Adherente SVF-cellen bereikten confluence na een gemiddelde van 7,5 (±4,5) dagen, met een gemiddelde cellulaire opbrengst van 12,3 (± 5,7) x 105 cellen / ml. De levensvatbaarheid van ontdooide SVF na 8 maanden, 1 jaar en 2 jaar varieerde tussen 23,06% -72,34% met een gemiddelde van 47,7% (±24,64) met de laagste levensvatbaarheid correlerend met gevallen van twee jaar bevriezing. Het gebruik van DPBS-oplossing aangevuld met calcium- en zakrusttijden voor vetprecipitatie met een kortere tijd van collagenasevertering resulteerde in een verhoogde uiteindelijke celopbrengst. De gedetailleerde procedure voor het verkrijgen van hoge opbrengsten van levensvatbare stamcellen was efficiënter met betrekking tot tijd en cellulaire opbrengst dan de technieken uit eerdere studies. Zelfs na een lange periode van cryopreservatie werden levensvatbare ADSC-cellen gevonden in de SVF.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke mesenchymale stamcellen zijn voordelig in zowel fundamenteel als toegepast onderzoek. Het gebruik van dit volwassen celtype overstijgt ethische kwesties - in vergelijking met het gebruik van embryonale of andere cellen - en is een van de meest veelbelovende studiegebieden in autologe weefselregeneratietechniek en celtherapie1, zoals het neoplastische gebied, de behandeling van degeneratieve ziekten en therapeutische toepassingen in het reconstructieve chirurgiegebied 2,3,4, 5. Eerder is gemeld dat er een overvloedige bron is van mesenchymale multipotente en pluripotente stamcellen in de stromale vasculaire celfractie van vetweefsel 6,7. Deze ADSC worden beschouwd als geweldige kandidaten voor gebruik bij celtherapie en transplantatie/infusie, aangezien een aanzienlijk aantal cellen met een sterk expansievermogen ex vivo gemakkelijk kan worden verkregen met een hoge opbrengst van een minimaal invasieve procedure 5,8.

Er werd ook aangetoond dat vetweefsel een groter vermogen heeft om mesenchymale stamcellen te leveren dan twee andere bronnen (beenmerg en navelstrengweefsel)9. Naast het feit dat het slecht immunogeen is en een hoog vermogen heeft om te integreren in het gastheerweefsel en om te interageren met de omliggende weefsels 4,10, heeft ADSC een multipotente capaciteit van differentiatie in cellijnen, met meldingen van chondrogene, osteogene en myogene differentiatie onder geschikte kweekomstandigheden 11,12,13, en in cellen, zoals pancreas, hepatocyten, en neurogene cellen 14,15,16.

De wetenschappelijke gemeenschap is het erover eens dat het immunomodulerende effect van de mesenchymale stamcellen een relevanter werkingsmechanisme is voor celtherapie 17,18,19 dan hun differentiatie-eigenschap. Een van de belangrijkste verdiensten van het ADSC-gebruik is de mogelijkheid van autologe infusie of enting, waardoor het een alternatieve behandeling wordt voor verschillende ziekten. Voor regeneratieve geneeskunde is ADSC al gebruikt in gevallen van leverschade, reconstructie van hartspier, regeneratie van zenuwweefsel, verbetering van de skeletspierfunctie, botregeneratie, kankertherapie en diabetesbehandeling20,21.

Tot op heden zijn er 263 geregistreerde klinische onderzoeken voor de evaluatie van het potentieel van ADSC, vermeld op de website van de National Institutes of Health22 van de Verenigde Staten. Er zijn verschillende protocollen opgesteld om vetweefsel te oogsten, maar er is geen consensus in de literatuur over een gestandaardiseerde methode om ADSC te isoleren voor klinisch gebruik 23,24. Lipoaspiraatverwerkingsmethoden tijdens en na de operatie kunnen direct van invloed zijn op de levensvatbaarheid van cellen, de uiteindelijke cellulaire opbrengst25 en de kwaliteit van de ADSC-populatie20. Wat de chirurgische voorbehandeling betreft, is het niet goed vastgesteld welke chirurgische voorbehandelingstechniek na isolatie een groter aantal levensvatbare cellen oplevert of dat de in vetweefsel geïnjecteerde anesthetische oplossing de celopbrengst en de functies ervan beïnvloedt26. Evenzo kan het verschil tussen technieken voor het verkrijgen van vetcellen leiden tot een afname van 70% van het aantal levensvatbare ADSC20. Volgens de literatuur moeten mechanische behandelingen om celpopulaties met een hoge levensvatbaarheid te verkrijgen - inclusief echografie - worden vermeden, omdat ze het vetweefsel kunnen afbreken20. De handmatige vetaspiratiemethode met spuiten is echter minder schadelijk en veroorzaakt minder celvernietiging, waarbij tumescente liposuctie een aanzienlijk aantal cellen met de beste kwaliteitoplevert 26.

Deze techniek maakt gebruik van een zoutoplossing met lidocaïne en epinefrine die in het liposuctiegebied wordt geïnjecteerd. Voor elk geïnjecteerd oplossingsvolume van 3 ml wordt 1 ml aangezogen. In deze studie werd de natte liposuctietechniek uitgevoerd, waarbij voor elke 1 ml adrenaline en zoutoplossing die wordt geïnjecteerd, 0,2 ml vetweefsel wordt geaspireerd. Het gebruik van spijsverteringsenzymen, met name collagenase, is gebruikelijk voor het proces van het isoleren van ADSC.

Na de eerste isolatiestap in het laboratorium wordt de laatste pellet stromale vasculaire fractie (SVF) genoemd. Het bevat verschillende celtypen27, waaronder endotheelvoorlopercellen, endotheelcellen, macrofagen, gladde spiercellen, lymfocyten, pericyten, pre-adipocyten en ADSC's, die in staat zijn tot adhesie. Zodra de definitieve isolatie uit in vitro culturen is afgerond, worden cellen die zich niet aan het plastic hebben gehecht, geëlimineerd in mediumuitwisselingen. Na acht weken van expansie, mediumveranderingen en passages vertegenwoordigen ADSC's het grootste deel van de celpopulatie in de kolven20. Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van geïsoleerde vetweefsel-afgeleide stamcellen voor een mogelijke toekomstige therapie is de mogelijkheid van cryopreservatie. Er werd aangetoond dat gecryopreserveerd lipoaspiraat een potentiële bron van SVF-cellen is, zelfs na 6 weken bevriezen28, met biologische activiteit zelfs na 2 jaar cryopreservatie29, en volledig vermogen om te groeien en te differentiëren in cultuur30. Tijdens het ontdooiproces gaat echter meestal een aanzienlijk percentage cellen verloren31. Daarom moeten het lipoaspiraatverwijderingsproces en de volgende methoden van celisolatie de hoogste celopbrengst garanderen.

Deze studie beschrijft een snellere methodologie voor het verzamelen en isoleren van ADSC, die een hoge cellulaire opbrengst en levensvatbaarheid aantoont voor een betere efficiëntie van cellulaire therapieën. Bovendien werd het effect van deze verbeterde techniek na langdurige SVF-cryopreservatie geëvalueerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie is goedgekeurd door de Ethische Commissie van de UNIFESP (protocolnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), uitgevoerd na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten volgens de Verklaring van Helsinki (2004). De steekproef van deze studie bestaat uit negen vrouwelijke patiënten in de leeftijd van 33-50 jaar (gemiddelde leeftijd 41,5) en gemiddelde initiële body mass index (BMI) van 24,54 (variërend tussen 22,32-26,77) (tabel 1) die esthetische abdominoplastiek ondergingen als gevolg van een teveel aan huid na zwangerschappen, bij de afdeling Plastische Chirurgie van de Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brazilië. Om bias te verminderen, werden de patiënten geselecteerd als een homogene groep rekening houdend met geslacht, leeftijd en BMI. De datasets die tijdens dit onderzoek zijn gebruikt en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.

1. Verzameling van lipoaspiraat

OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in het operatiecentrum.

  1. Gebruik 4% chloorhexidinegluconaat (zie materiaaltabel) voor huidvoorbereiding en asepsis.
    1. Voer een subcutane huidincisie van 2 mm uit (tussen de subdermis en aponeurose). Plaats een Klein canule van 26 mm 3 G driegats en 3 mm kaliber en een spuit om een totaal volume van 500 ml van een adrenaline-oplossing (1 mg / ml) (zie tabel van materialen) verdund in zoutoplossing (1: 1.000.000) in de infraumbilicale ruimte te injecteren.
  2. Sluit een spuit van 60 ml aan op een 26 mm 3 G driegats en 3 mm kaliber liposuctie canule en steek deze door de huidincisie, waarbij de zuiger wordt vergrendeld om een vacuüm te creëren.
    1. Maak duw- en trekbewegingen zodat, met het gecreëerde vacuüm, het lipoaspiraat in de spuit van 60 ml blijft.
  3. Breng met behulp van een steriele connector met een klep de 100 ml van het verzamelde lipoaspiraat over op een 150 ml polyvinylchloride-overdrachtszak (zie materiaaltabel).
    1. Verpak de transferzak in een polystyreendoos bij kamertemperatuur (~25 °C) en breng deze onmiddellijk naar het laboratorium. Het duurt niet langer dan 30 minuten om de weefselverwerking te starten.

2. Verwerking van lipoaspiraat

OPMERKING: Deze stap moet in het laboratorium worden uitgevoerd.

  1. Weeg eerst de zak, meet de temperatuur met een digitale contactloze infrarood klinische thermometer en laat de zak 5 minuten rusten in de laminaire stroomkamer voor neerslag van de vetmesterlagen (bubbels) en weefselscheiding die de cellen van belang bevat.
    1. Voer een reeks weefselwassingen uit. Eerste wasbeurt: injecteer 100 ml DPBS met calcium (1x) in de transferzak en meng deze met de handen.
    2. Laat het 5 minuten staan en verwijder het grootste deel van de basale vloeistof die neerslaat.
    3. Gooi de basale vloeistof weg met een spuit van 60 ml die aan de zakadapter is bevestigd. Dit proces moet twee keer worden herhaald.
  2. Voeg 100 ml digestieoplossing toe aan de zak (93 ml calciumvrij DPBS + 60 μl calciumchloride (1 g/l) + 7 ml steriel collagenase, zie materiaaltabel) en laat 30 minuten bij 37 °C onder langzaam roeren.
  3. Breng alle inhoud van de zak over in vier conische buizen van 50 ml en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 400 x g bij 22 °C.
    1. Verwijder en gooi het supernatant weg en voeg 5 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) lage glucose aangevuld met 20% FBS (foetaal runderserum) toe aan de celpellet (figuur 1).

3. Tellen van de SVF-cellen

  1. Meng een verse oplossing van 10 μL trypan blauw op 0,05% in gedestilleerd water met 10 μL cellulaire suspensie gedurende 5 min.
  2. Tel levensvatbare cellen in een Neubauer-celtelkamer32 met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop (zie Tabel van Materialen) bij 20x vergroting.
  3. Resuspendeer de celpellet in een cryoprotectief medium (5 ml FBS + 10% dimethylsulfoxide - DMSO) in een concentratie van 1 x 106 cellen / ml.
  4. Doe 1 ml van dit mengsel in cryovialen. Gebruik een vriescontainer (zie Materiaaltabel) met een koelsnelheid van (1 °C/min tot -80 °C).
    1. Bewaren bij -80 °C gedurende 1 jaar.
    2. Bewaar na deze tijd in standaard cassettedozen ondergedompeld in de vloeibare stikstofdampfase (-165 °C).

4. Ontdooiproces van de cellen

  1. Verwijder de injectieflacons met vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in het waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut.
  2. Plaats de SVF-cellen in een conische buis met 4 ml DMEM (lage glucose aangevuld met 20% FBS) voorverwarmd op 37 °C.
  3. Centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C gedurende 5 min.
  4. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml DMEM (lage glucose) + 10% FBS toe. Voer immunofenotypering uit volgens de onderstaande stappen.

5. Flow cytometrie techniek (immunofenotype multiple labeling)

  1. Plaats 1 ml celpellet (concentratie van 1.000 cellen/μL) in vijf cytometriebuizen (elk 200 μL).
  2. Centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg met een pipet.
  3. Voeg 300 μL Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (PBS) (10x) toe, centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C en gooi het supernatant weg met een pipet.
  4. Bereid vijf buizen voor verschillende markercombinaties als volgt voor: 5 μL CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; 5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Cel levensvatbaarheid assay-5 μL van fluorescerende reactieve kleurstof. (zie Materiaaltabel) en een buis met niet-gekleurde cellen en PBS als negatieve controle. Homogeniseer in een vortex en incubeer bij 4 °C gedurende 30 minuten.
    1. Centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg met een pipet, voeg 500 μL PBS (10x) toe en ga verder met celsortering.
      OPMERKING: Vijfduizend gebeurtenissen worden verkregen per antilichaamset in de Flow Cytometer van vier kleuren en vijf parameters en geanalyseerd met CellQuest-software.

6. Zaaien van passage 1 (P1)

  1. Zaai 2 x 105 cellen in een kweekkolf van 75 cm2 .
  2. Voeg 12 ml DMEM lage glucose + 20% FBS + 10% antibioticum / antimycotisch (met 10.000 eenheden penicilline, 10 mg streptomycine en 25 μg amfotericine B per ml, 0,1 μm).
  3. Wanneer de cellen tussen 80% -90% confluence bereiken, voer trypsinisatie van adherente cellen uit met 2 ml 0,25% EDTA-trypsine gedurende 3 minuten.
  4. Tel cellen opnieuw (zoals vermeld in stap 3).
  5. Voer immunofenotypering opnieuw uit (zoals vermeld in stap 5).

7. Statistische analyse

  1. Gebruik Spearman's Rho Calculator33 om de sterkte van de associatie tussen de volgende variabelen met P < 0,05 te meten, zoals hieronder vermeld.
    1. Selecteer SVF-celopbrengst en het aantal dagen dat SVF in cultuur blijft in de eerste passage (P1) tot 80% -90% samenvloeiing (dagen tot P1).
    2. Selecteer SVF cellulaire opbrengst voor en na het gaan naar P1.
    3. Overweeg dagen tot P1 en cellulaire opbrengst voordat u naar P1 gaat.
    4. Selecteer SVF-celopbrengst met het gemiddelde percentage bevestigde ADSC.
    5. Bereken het percentage bevestigde ADSC en de cellulaire opbrengst voordat u naar P1 gaat.
    6. Bepaal de BMI en SVF cellulaire opbrengst.

8. Differentiatietest

  1. Voer de differentiatietest uit volgens een differentiatiekitprotocol (zie materiaaltabel). Figuur 4 toont de resultaten voor casus 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De karakterisering van de negen onderzochte personen, inclusief hun leeftijd, gewicht, lengte en BMI, wordt weergegeven in tabel 1.

Volgens de aanvankelijk gepresenteerde celopbrengst werd het celvolume dat in cultuur werd ingeënt berekend om zo dicht mogelijk bij de capaciteit van de 75 cm2 kweekkolf te liggen. Het monstervolume dat in elk geval wordt gezaaid, wordt beschreven in tabel 2. Vervolgens werd, volgens de initiële cellulaire opbrengst, e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolatieopbrengst
Het is algemeen bekend dat het cryopreservatieproces, vaak vereist bij cellulaire therapie, resulteert in aanzienlijk celverlies, soms groter dan 50% 29,30,35. Een technische verbetering voor het verkrijgen van een hoge initiële cellulaire opbrengst in isolatie is dus van fundamenteel belang. De verzamelmethode van lipoaspiraat en de isolatiemethode van de cellen moeten zich richten op het b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken de patiënten die vrijwillig hebben deelgenomen en het medisch en verplegend personeel van het ziekenhuis São Paulo. Deze studie werd ondersteund door het Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brazilië.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.8 mL cryovialsNunc Thermo Fisher Scientific340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bagJP FARMA80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2Sigma AldrichA5533
Adrenaline (1 mg/mL)HipolaborNA
Alcian Blue solutionSigma Aldrich1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100xGibco15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro AnalysisBD BioSciencesNA
Calcium chloride 10%Merck102379
Chlorhexidine gluconate 4%VIC PHARMANA
Collagenase, Type I, powderGibco17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)Gibco11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Fetal bovine serumGibco10500056
Formaldehyde 4%Sigma Aldrich1,00,496
Inverted light microscopeNikon Eclipse TS100NA
Live and Dead Cell AssayThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105BD BioSciences745927
Monoclonal antibody: CD11BBD BioSciences746004
Monoclonal antibody: CD19BD BioSciences745907
Monoclonal antibody: CD34BD BioSciences747822
Monoclonal antibody: CD45DAKOM0701
Monoclonal antibody: CD73BD BioSciences746000
Monoclonal antibody: CD90BD BioSciences553011
Monoclonal antibody: HLA-DRBD BioSciences340827
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4Gibco 10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation KitGibcoA1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation KitGibcoA1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation KitGibcoA1007201
Sterile connector with one spike with needle injection siteOrigen Biomedical Connector, USANACode mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%Sigma Aldrich93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol redGibco25200056

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123(2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122(2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284(2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693(2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145(2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421(2015).
  32. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
  33. Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718(2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397(2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45(2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66(2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162(2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenchymale stamcellencryopreservatie van cellenisolatie van stamcellenflowcytometrietrypaanblauw assayexpansie van celculturenstamcelmarkerscollagenase digestie

Gerelateerde artikelen