Methodenartikel

Een aangepaste eenvoudige methode voor het opwekken van een hartinfarct bij muizen

DOI:

10.3791/63042

⸱

3 december 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onder adequate anesthesie werd het muizenhart geëxternaliseerd door de intercostale ruimte en werd een myocardinfarct met succes geïnduceerd door de linker voorste dalende slagader (LAD) af te binden met behulp van materialen die in de meeste laboratoria gemakkelijk verkrijgbaar zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myocardinfarct (MI) is een van de belangrijkste doodsoorzaken. MI-modellen worden veel gebruikt voor het onderzoeken van de pathomechanismen van post-MI-remodellering en evaluatie van nieuwe therapieën. Er zijn verschillende methoden (bijv. behandeling met isoproterenol, cryoletsel, ligatie van de kransslagader, enz.) gebruikt om MI te induceren. Vergeleken met behandeling met isoproterenol en cryoletsel, kan het afbinden van de kransslagader de ischemische respons en chronische remodellering na MI beter weerspiegelen. Traditionele methoden voor coronaire ligatie bij muizen zijn echter technisch uitdagend. De huidige studie beschrijft een eenvoudig en efficiënt proces voor inductie van MI in muizen met direct beschikbare materialen. De borsthuid van de muis werd onder stabiele narcose opengesneden. Het hart werd onmiddellijk geëxternaliseerd door de intercostale ruimte na stompe scheiding van de pectoralis major en pectoralis minor. De linker voorste dalende tak (LAD) werd vastgebonden met een 6-0 hechting op 3 mm van de oorsprong. Na LAD-ligatie duidde kleuring met 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) op succesvolle inductie van MI en temporele veranderingen van post-MI-littekengrootte. Ondertussen toonden de resultaten van de overlevingsanalyse openlijke sterfte binnen 7 dagen na MI, voornamelijk als gevolg van hartruptuur. Bovendien toonde echocardiografische beoordeling na MI een succesvolle inductie van contractiele disfunctie en ventriculaire remodellering aan. Eenmaal onder de knie, kan binnen 2-3 minuten een MI-model in muizen worden vastgesteld met direct beschikbare materialen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myocardinfarct (MI) is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en invaliditeit 1,2,3,4,5. Ondanks tijdige reperfusie is er momenteel een gebrek aan effectieve therapieën om post-MI cardiale remodellering te behandelen. Dienovereenkomstig zijn er aanzienlijke inspanningen geleverd voor mechanistische exploratie en therapie-exploitatie voor MI 6,7,8. Merk op dat de vaststelling van MI-modellen een voorwaarde is om deze doelen te bereiken.

Er zijn verschillende methoden voorgesteld (bijv. behandeling met isoproterenol, cryoletsel, afbinden van de kransslagader, enz.) om MI-modellen bij kleine dieren te induceren. Behandeling met isoproterenol is een eenvoudige methode voor MI-inductie, maar kan geen infarct van het beoogde gebied induceren9. Cryoletsel leidt tot myocardiale necrose via het genereren van ijskristallen en verstoring van het celmembraan in plaats van directe ischemie10. Daarentegen maakt ligatie van de kransslagader nauwkeurige controle van de occlusieplaats en de omvang van het infarctgebied mogelijk en recapituleert het getrouw de remodelleringsrespons na een infarct11,12. Ligatie van de kransslagader wordt meestal uitgevoerd na intubatie, mechanische beademing en thoracotomie, wat technisch uitdagend is13,14. Verschillende aangepaste protocollen voor het afbinden van de kransslagader (bijv. Ventilatievrij) werden gerapporteerd en versterkten de inductie van MI, maar gedetailleerde visuele demonstraties ontbreken15,16,17. Deze problemen vormen een aanzienlijke financiële en technische barrière voor groepen die onderzoek willen doen met behulp van MI-modellen. Dit rapport presenteert een benadering voor inductie van MI bij muizen. De huidige methode is eenvoudig, tijdbesparend en maakt gebruik van chirurgische instrumenten en apparatuur die gemakkelijk in de meeste laboratoria te vinden zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De experimenten met dierarbeid worden uitgevoerd met alle nodige goedkeuringen van de Laboratory Animal Welfare Ethics Committee van het Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine (R52021-0506). Vrouwelijke en mannelijke C57BL/6J-muizen in de leeftijd van 8-10 weken werden in het onderzoek gebruikt.

1. Voorbereiding van de vereenvoudigde anesthesieapparatuur (OPTIONEEL)

OPMERKING: Dit is een optionele preoperatieve opstelling en kan worden vervangen door titreerbare anesthesie zoals vermeld in rubriek 2. De institutionele ethische commissie voor dieren en dierenarts(en) moeten worden geraadpleegd voordat deze opzet in dierproeven wordt aangepast.

  1. Neem een centrifugebuisje van 15 ml en maak een snede loodrecht op de lange as van het buisje op ongeveer 3 cm van de opening.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de snede groter is dan de helft van de cirkelvormige omtrek van het buislumen, zodat de klep met succes kan worden geplaatst.
  2. Boor gaten (diameter, 2 mm) aan de wand van de centrifugebuis tussen de snede en de buisopening.
  3. Snijd een stuk van de klep van de juiste grootte uit een plastic plaat en steek het ventiel in de snede op de buiswand.
    NOTITIE: De klep kan worden gebruikt om de afgiftesnelheid van isofluraan te regelen door de diepte van de inbrenging te wijzigen.
  4. Snijd in een zuurkast de bodem van de buis open en sluit deze aan op de zuurstoftoevoer. Plaats een watje in de buurt van het onderste uiteinde van de buis, voeg 0.5 ml isofluraan (zoals verkregen, zie Materiaaltabel) toe aan het watje en sluit het ventiel.
  5. Test de werkzaamheid van de anesthesie door de muizen te maskeren met buisjes die zijn voorbereid zoals hierboven beschreven. Bewaak de ademhalingsfrequentie en anesthesiediepte door de teenknijprespons.
    NOTITIE: Een ademhalingsfrequentie van minder dan 10 keer/10 s suggereert overmatige anesthesie en de inbrengdiepte van de klep moet worden aangepast. Voor alle ingrepen waarbij anesthesie betrokken is, moet een gasfilter gevuld met actieve koolplaten worden gebruikt (figuur 1A-i) en moet de operatie worden uitgevoerd in een kap.

2. Operatieve voorbereiding en anesthesie

  1. Bereid en steriliseer alle benodigde instrumenten op de dag van de operatie, inclusief een pincet, een micro-muggenhemostaat, een chirurgische schaar, twee paar naaldhouders, 4-0 zijden chirurgische hechtdraad, 6-0 zijden chirurgische hechtdraad, een gasfilter en een lichtbron (zie Tabel met materialen) (Figuur 1A).
  2. Zet een chirurgisch masker en steriele handschoenen op.
  3. Breng de ontharingscrème aan op de borst van de muis en wacht 1 minuut. Veeg de ontharingscrème en het haar voorzichtig af met nat gaasje.
  4. Houd de muis na het ontharen vast met de dominante hand. Induceer anesthesie via inhalatie van verdampte isofluraan (4%) met zuurstoftoevoer (1 l/min) en handhaaf op 2-3% isofluraan.
  5. Bevestig adequate anesthesie door het ontbreken van een teenknijpreactie.
  6. Breng steriele oogcrème aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  7. Zet de muizen vast op een operatieplatform in rugligging. Breng povidonjodium-wattenstaafjes (zie Materiaaltabel) driemaal aan op de borst en bedek de gedesinfecteerde borstkas met een steriel laken.

3. Inductie van een hartinfarct

  1. Vervang de besmette handschoenen om de steriliteit te garanderen.
  2. Maak een snee van 0,5 cm langs de lijn die de xiphoid en oksel verbindt na lokale blokkade met lidocaïne.
  3. Scheid botweg de grote borstspieren en de kleine borstspieren met behulp van een tang en een micro-muggenhemostaat om de vierde intercostale ruimte bloot te leggen.
  4. Open de vierde intercostale ruimte met behulp van een micro-muggenhemostaat.
  5. Externaliseer het hart door het hart met de wijsvinger van de linkerhand naar de vierde intercostale ruimte te duwen.
  6. Zet het hart vast met de linkerhand en bind de linker voorste dalende tak vast met een 6-0 hechting op 3 mm van de oorsprong.
  7. Plaats het hart snel terug in de borstholte.
    NOTITIE: Het is veilig om het hart minder dan 30 s te externaliseren.
  8. Evacueer de lucht uit de borstholte door handmatig zachtjes op de borstholte te drukken.
  9. Sluit de spierlaag over de ribben met een 6-0 zijden hechtdraad.
  10. Sluit de huid met een 4-0 zijden hechtdraad.
  11. Plaats de muizen direct na de operatie op een pad (37 °C).
  12. Injecteer buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) subcutaan om de 4-6 uur om postoperatieve pijn tot 72 uur te verminderen.
  13. Breng de geopereerde muizen terug naar kooien wanneer ze volledig hersteld zijn.
    OPMERKING: De muizen zijn binnen 3-5 minuten na de operatie volledig hersteld.
  14. Houd de muizen nauwlettend in de gaten en geef tot 7 dagen natvoer.

4. Het oogsten van de weefsels

  1. Offer de muizen op verschillende tijdstippen na de vestiging van MI door cervicale dislocatie.
  2. Zet de geofferde muizen vast op het operatieplatform in rugligging.
  3. Maak een ventrale incisie (~3-4 cm) in de bovenbuik. Snijd de ribben aan beide zijden van de thoraxholte af en verwijder het middenrif.
  4. Doordrenk het hart met 10 ml koude, fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS, 4 °C) via intraventriculaire injectie.
  5. Vang het hart op door de aortawortel af te snijden en bewaar het hart onmiddellijk bij -80 °C.
    OPMERKING: Volgens de ervaring van de auteurs is het haalbaar om TTC-kleuring binnen twee weken na opslag uit te voeren.
  6. Kleur het hart met 2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC).
    1. Snijd het bevroren hart met scheermesjes in stukken van 1 mm dik op ijs.
    2. Incubeer de voorbereide hartschijfjes in 1% TTC-oplossing (opgelost in 1x PBS) bij 37 °C gedurende 10-15 minuten.
      NOTITIE: Gooi na 15 minuten incubatie de TTC-oplossing weg en dompel de gekleurde hartschijfjes onder in 1x PBS.
  7. Fotografeer de plakjes met een digitale camera.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het experimentele protocol en enkele van de kritieke stappen zijn weergegeven in figuur 1. De vereenvoudigde anesthesieapparatuur induceerde anesthesie. Zoals te zien is in figuur 2A, was de geïnduceerde anesthesie stabiel, zoals blijkt uit de regelmatige ademhalingsfrequenties (variërend van 90-107 ademhalingen/min bij de geteste muizen). Na het afbinden van de kransslagader duidde TTC-kleuringsanalyse op succesvolle inductie van een myocardinfarct en temporele...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige rapport demonstreerde een eenvoudig protocol voor MI-inductie in muizen met direct beschikbare materialen, dat werd aangepast van een methode gerapporteerd door Gao16. Muizen MI-modellen zijn onmisbaar voor mechanistische exploratie en medicijnscreening voor post-MI-disfunctie en remodellering12. Van de bestaande technieken voor MI-inductie is het afbinden van de kransslagader de meest toegepaste. Ligatie van de kransslagader recapituleert getrouw de ischemieaar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), het Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), de Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (201409005200), Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030) en China Postdoctoral Science Foundation (2020M671161, BX20190216).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,3,5-Triphenyltetrazolium chlorideSIGMAT8877-25GTTC-kleuring
4-0 zijden hechtdraadYUANKANG4-0Chirurgisch instrument
AutoclaafHIRAYAMAHVE-50Sterilisering voor het vaste materiaal
BuprenorfineQinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.H10940181Vermindering van postoperatieve pijn
CentrifugeerbuisBiological Hope1850-K15ML
OntharingscrèmeZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701Ontharingsmiddel voor laboratoriumdieren
PincetRWDF12028Chirurgisch instrument
GasfilterZHAOXINSA-493Bescherming van de operator
IsofluraanRWD20071302Gebruikt voor anesthesie
LichtbronBeijing PDVLG-150BOperatielamp
Micro-muggenklemmenFST13011-12Chirurgisch instrument
NaaldBINXIONG42180104Chirurgisch instrument
Naald en de 6-0 zijden hechtdraadJIAHESC086Chirurgisch instrument
NaaldhouderShangHaiJZJ32030Chirurgisch instrument
NaaldhouderShangHaiJZJ32010Chirurgisch instrument
Povidon-jood wattenSingleLadyGB26368-2010Huiddesinfectie
SchaarCNSTRONGJYJ1030Chirurgisch instrument
Steriele oogcrèmeShenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.H10940177Voorkomen van hoornvliesdroogheid
Ultra-hoog resolutie echografiesysteem voor kleine dierenVisualSonicsVevo 2100Echocardiografische analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074(2018).
  2. Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
  3. Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
  4. Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
  5. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  6. Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
  7. Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
  8. Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
  9. Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
  10. vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
  11. Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
  12. Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
  13. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  14. Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
  15. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  16. Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
  17. Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
  18. Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
  19. Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Myocardial InfarctionCoronary Artery LigationMouse MI ModelVentricular RemodelingTTC StainingPost MI RemodelingContractile DysfunctionEchocardiographic AssessmentCardiac RuptureIntramyocardial Injection

Gerelateerde artikelen