Methodenartikel

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

DOI:

10.3791/63046

⸱

19 augustus 2021

1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technieken om de activiteit van belangrijke enzymen van glycogeenmetabolisme te meten, worden gepresenteerd, met behulp van een eenvoudige spectrofotometer die in het zichtbare bereik werkt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycogeen wordt gesynthetiseerd als een opslagvorm van glucose door een breed scala aan organismen, variërend van bacteriën tot dieren. Het molecuul bestaat uit lineaire ketens van α1,4-gebonden glucoseresiduen met takken die worden geïntroduceerd door de toevoeging van α1,6-verbindingen. Begrijpen hoe de synthese en afbraak van glycogeen worden gereguleerd en hoe glycogeen zijn karakteristieke vertakte structuur bereikt, vereist de studie van de enzymen van glycogeenopslag. De methoden die het meest worden gebruikt om deze enzymactiviteiten te bestuderen, maken echter meestal gebruik van reagentia of technieken die niet voor alle onderzoekers beschikbaar zijn. Hier bespreken we een reeks procedures die technisch eenvoudig, kosteneffectief en toch in staat zijn om waardevol inzicht te geven in de controle van glycogeenopslag. De technieken vereisen toegang tot een spectrofotometer, die werkt in het bereik van 330 tot 800 nm, en worden beschreven ervan uitgaande dat de gebruikers wegwerpbare, plastic cuvetten zullen gebruiken. De procedures zijn echter gemakkelijk schaalbaar en kunnen worden aangepast voor gebruik in een microplaatlezer, waardoor zeer parallelle analyse mogelijk is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycogeen is wijd verspreid in de natuur, waarbij de verbinding wordt aangetroffen in bacteriën, vele protisten, schimmels en dieren. In micro-organismen is glycogeen belangrijk voor de overleving van cellen wanneer voedingsstoffen beperkend zijn en in hogere organismen zoals zoogdieren, de synthese en afbraak van glycogeen dienen om de bloedsuikerspiegelte bufferen 1,2,3. De studie van het glycogeenmetabolisme is daarom van belang voor zulke uiteenlopende gebieden als microbiologie en zoogdierfysiologie. Het begrijpen van glycogeenmetabolisme vereist het bestuderen van de belangrijkste enzymen van glycogeensynthese (glycogeensynthase en het vertakkende enzym) en glycogeenafbraak (glycogeenfosforylase en debranching enzym). De gouden standaard assays van glycogeensynthase, fosforylase, vertakking en debranching enzymactiviteiten maken gebruik van radioactieve isotopen. Glycogeensynthase wordt bijvoorbeeld over het algemeen gemeten in een gestopte radiochemische test door de opname van glucose uit UDP-[14C]glucose (in het geval van dierlijke en schimmelenzymen) of ADP-[14C]glucose (in het geval van bacteriële enzymen) in glycogeen 4,5 te volgen. Evenzo wordt glycogeenfosforylase gemeten in de richting van glycogeensynthese, na de opname van glucose uit [14C] glucose-1-fosfaat in glycogeen6. Het vertakkende enzym wordt getest door het vermogen van dit enzym te meten om de opname van [14C]glucose uit glucose-1-fosfaat in α1,4-gekoppelde ketens te stimuleren door glycogeenfosforylase7, en de debranching enzymactiviteit wordt bepaald door het volgen van het vermogen van het enzym om [14C]glucose op te nemen in glycogeen8 . Hoewel zeer gevoelig, waardoor hun gebruik in ruwe celextracten met lage niveaus van enzymactiviteit mogelijk is, zijn de radioactieve substraten duur en onderworpen aan de wettelijke vereisten die gepaard gaan met het gebruik van radio-isotopen. Deze barrières plaatsen het gebruik van bepaalde testen buiten het bereik van veel werknemers. In de loop van vele jaren is echter een indrukwekkende verscheidenheid aan spectrofotometrische benaderingen voor het meten van deze enzymen beschreven. Over het algemeen zijn deze benaderingen uiteindelijk afhankelijk van het meten van de productie of consumptie van NADH / NADPH, of het genereren van gekleurde complexen tussen glycogeen en jodium. Ze zijn dus eenvoudig en kunnen worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige spectrofotometers die zijn uitgerust met alleen wolfraam- of xenonflitslampen.

Spectrofotometrische testen van glycogeensynthase zijn gebaseerd op het meten van het nucleosidedifosfaat dat vrijkomt uit de suikernucleotidedonor als glucose wordt toegevoegd aan de groeiende glycogeenketen 9,10. De procedure voor het meten van glycogeensynthase-activiteit beschreven in sectie 1 van het protocol, hieronder, is een wijziging van die beschreven door Wayllace et al.11, en het koppelingsschema wordt hieronder weergegeven:

(Glucose) n + UPD-glucose → (Glucose)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpyruvaat → pyruvaat + ATP

Pyruvaat + NADH + H+ → Lactaat + NAD+

Glycogeensynthase voegt glucose uit UDP-glucose toe aan glycogeen. De UDP die in dit proces wordt gegenereerd, wordt omgezet in UTP door nucleosidedifosfaatkinase (NDP-kinase), in een reactie die ADP genereert. De ADP dient dan op zijn beurt als substraat voor pyruvaatkinase, dat de ADP fosforyleert met behulp van fosfoenolpyruvaat als fosfaatdonor. Het resulterende pyruvaat wordt door het enzym lactaatdehydrogenase omgezet in lactaat in een reactie die NADH verbruikt. De test kan daarom op een continue manier worden uitgevoerd, waarbij de afname van de absorptie bij 340 nm wordt gevolgd als NADH wordt geconsumeerd. Het is gemakkelijk aangepast voor gebruik met enzymen die ADP-glucose als glucosedonor nodig hebben. Hier zijn de koppelingsstappen eenvoudiger omdat de ADP die vrijkomt door de werking van glycogeensynthase direct wordt beïnvloed door pyruvaatkinase.

Er zijn verschillende spectrofotometrische testen beschikbaar voor de bepaling van glycogeenfosforylase-activiteit. In de klassieke versie wordt het enzym naar achteren gedreven, in de richting van glycogeensynthese, zoals hieronder weergegeven:

(Glucose) n + Glucose-1-fosfaat → (Glucose)n+1 + Pi

Met getimede tussenpozen worden aliquots van het reactiemengsel verwijderd en wordt de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat gekwantificeerd12,13. In onze handen is deze test van beperkt nut geweest vanwege de aanwezigheid van gemakkelijk meetbaar vrij fosfaat in veel commerciële preparaten van glucose-1-fosfaat, gecombineerd met de hoge concentraties glucose-1-fosfaat die nodig zijn voor fosforylasewerking. In plaats daarvan hebben we routinematig een alternatieve test gebruikt die het glucose-1-fosfaat meet dat vrijkomt als glycogeen wordt afgebroken door fosforylase13. Er wordt gebruik gemaakt van een gekoppeld reactieschema, dat hieronder wordt geïllustreerd.

(Glucose) n + Pi → (Glucose)n-1 + Glucose-1-fosfaat

Glucose-1-fosfaat → Glucose-6-fosfaat

Glucose-6-fosfaat + NADP+ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H+

Het glucose-1-fosfaat wordt omgezet in glucose-6-fosfaat door fosfoglucomutase en het glucose-6-fosfaat wordt vervolgens geoxideerd tot 6-fosfogluconolacton, met de gelijktijdige reductie van NADP + tot NADPH. De procedure die in paragraaf 2 van het protocol hieronder wordt beschreven, is afgeleid van methoden beschreven door Mendicino et al.14 en Schreiber & Bowling15. De test kan gemakkelijk op een continue manier worden uitgevoerd, met de toename van de absorptie bij 340 nm in de loop van de tijd, waardoor de reactiesnelheid kan worden bepaald.

Spectrofotometrische bepaling van de debranching enzymactiviteit is afhankelijk van de meting van de glucose die vrijkomt door de werking van het enzym op fosforylaselimiet dextrine16. Deze verbinding wordt gemaakt door glycogeen uitputtend te behandelen met glycogeenfosforylase. Omdat de werking van glycogeenfosforylase 4 glucoseresiduen weg van een α1,6-takkenpunt stopt, bevat de limietdextrine glycogeen, waarvan de buitenste ketens zijn verkort tot ~ 4 glucoseresiduen. De bereiding van fosforylaselimiet dextrine wordt hier beschreven, met behulp van een procedure die is afgeleid van die ontwikkeld door Taylor et al.17 en Makino & Omichi18.

Debranching is een proces in twee stappen. De 4-α-glucanotransferase-activiteit van het bifunctionele debranching-enzym brengt eerst drie glucoseresiduen over van het aftakkingspunt naar het niet-reducerende uiteinde van een nabijgelegen α1,4-gekoppelde glucoseketen. Het enkele, α1,6-gebonden glucoseresidu dat op het vertakkingspunt achterblijft, wordt vervolgens gehydrolyseerd door de α1,6-glucosidase-activiteit19. De test wordt meestal op een gestopte manier uitgevoerd, waarbij de glucose die na een bepaalde tijd (of reeks van tijden) vrijkomt, wordt gemeten in een gekoppelde enzymtest zoals hieronder weergegeven:

(Glucose) n → (Glucose)n-1 + Glucose

Glucose + ATP → Glucose-6-fosfaat + ADP

Glucose-6-fosfaat + NADP+ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H+

De bepaling van de geproduceerde NADPH geeft een maat voor de glucoseproductie. De procedure beschreven in sectie 3 van het protocol, hieronder, is gebaseerd op een procedure beschreven door Nelson et al.16. Net als de andere methoden die afhankelijk zijn van de consumptie of generatie van NADH / NADPH, is de test vrij gevoelig. De aanwezigheid van amylasen of andere glucosidasen, die ook vrije glucose uit fosforylaselimietdextrine kunnen vrijmaken, zal echter aanzienlijke interferentie veroorzaken (zie Discussie).

De colorimetrische bepaling van vertakkende enzymactiviteit is gebaseerd op het feit dat α1,4-gekoppelde glucoseketens spiraalvormige structuren aannemen die binden aan jodium en gekleurde complexen vormen20. De kleur van het gevormde complex hangt af van de lengte van de α1,4-gekoppelde ketens. Zo vormt amylose, dat bestaat uit lange, grotendeels onvertakte ketens van α1,4-gebonden glucose, een diepblauw complex met jodium. Glycogenen daarentegen, waarvan de buitenste ketens over het algemeen in de orde van grootte van slechts 6 tot 8 glucoseresiduen lang zijn, vormen oranjerode complexen. Als een oplossing van amylose wordt geïncubeerd met vertakkend enzym, resulteert de introductie van takken in het amylose in de generatie van kortere α1,4-gekoppelde glucoseketens. Zo verschuift het absorptiemaximum van de amylose/jodiumcomplexen naar kortere golflengten. De hier besproken procedure is afgeleid van die beschreven door Boyer &Preiss21 en vertakkende enzymactiviteit wordt gekwantificeerd als een vermindering van de absorptie van het amylose / jodiumcomplex bij 660 nm in de loop van de tijd.

Zoals duidelijk zou moeten zijn uit de bovenstaande discussie, betekent het feit dat de kleuren van de complexen gevormd tussen jodium- en α1,4-glucoseketens variëren met de ketenlengte dat de absorptiespectra van glycogeen / jodiumcomplexen moeten variëren met de mate van glycogeenvertakking. Dit is inderdaad het geval, en minder vertakte glycogenen/glycogenen met langere buitenste ketens absorberen licht op een langere golflengte dan glycogenen die meer vertakt zijn /kortere buitenste ketens hebben. De jodiumkleuringsreactie kan daarom worden gebruikt om snelle, kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking22. De oranjebruine kleur vormt zich wanneer glycogeencomplexen met jodium niet bijzonder intens zijn. De kleurontwikkeling kan echter worden verbeterd door de toevoeging van verzadigde calciumchlorideoplossing22. Dit verhoogt de gevoeligheid van de methode ongeveer 10-voudig en maakt een kant-en-klare analyse van microgramhoeveelheden glycogeen mogelijk. De in paragraaf 4 van het protocol beschreven test voor de bepaling van vertakkingen is gebaseerd op een procedure ontwikkeld door Krisman22. Het wordt eenvoudig uitgevoerd door het glycogeenmonster te combineren met jodiumoplossing en calciumchloride in een cuvette en het absorptiespectrum van 330 nm tot 800 nm te verzamelen. Het absorptiemaximum verschuift naar langere golflengten naarmate de mate van vertakking afneemt.

Gezamenlijk bieden de hier beschreven methoden eenvoudige, betrouwbare middelen om de activiteiten van de belangrijkste enzymen van het glycogeenmetabolisme te beoordelen en om kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bepaling van de glycogeensynthase-activiteit

  1. Bereid stamoplossingen van vereiste reagentia zoals aangegeven in tabel 1 (vóór de experimentele dag).
BestanddeelRoutebeschrijving
50 mM Tris pH 8,0Los 0,61 g Tris-base op in ~ 80 ml water.  Koel af tot 4 °C.   Stel de pH in op 8,0 met HCl en maak het volume tot 100 ml met water.
20 mM HEPES bufferLos 0,477 g HEPES op in ~ 80 ml water.  Stel de pH in op 7,0 met NaOH en vul het volume aan tot 100 ml met water.
132 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8Los 1,94 g Tris base en 0,239 g KCl op in ~90 ml water.  Stel de pH in op 7,8 met HCl en vul het volume aan tot 100 ml met water.
0,8% w/v oesterglycogeenWeeg 80 mg oesterglycogeen af en voeg toe aan water.  Maak het uiteindelijke volume tot 10 ml met water en verwarm voorzichtig / meng om glycogeen volledig op te lossen.
100 mM UDP-glucoseLos 0,31 g UDP-glucose op in water en maak het uiteindelijke volume tot 1 ml.  Bewaren in aliquots, bevroren bij -20 °C.   Stabiel voor enkele maanden.
50 mM ATPLos 0,414 g ATP op in ~ 13 ml water.  Stel de pH in op 7,5 met NaOH en vul het volume aan tot 15 ml met water.  Bewaren in bij -20 °C ingevroren aliquots.   Stabiel voor enkele maanden.
100 mM glucose-6-fosfaat pH 7,8Los 0,282 g glucose-6-fosfaat op in ~ 7 tot 8 ml water.  Stel de pH in op 7,8 met NaOH.  Maak het volume tot 10 ml met water.  Bewaren in aliquots bij -20 °C.   Stabiel voor ten minste zes maanden.
40 mM fosfoenolpyruvaatLos 4 mg fosfoenolpyruvaat op in 0,5 ml 20 mM HEPES-buffer pH 7,0.  Bewaren bij -20 °C.   Stabiel voor minstens 1 week.
0,5 MnCl2Los 9,90 g MnCl2 op in een laatste volume van 100 ml water.
NDP-kinaseReconstitueer gelyofiliseerd poeder met voldoende water om 1 U/μl oplossing te geven.  Bereid aliquots, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C.   Stabiel voor minstens 1 jaar.

Tabel 1: Voorraadoplossingen die nodig zijn voor de bepaling van glycogeensynthaseactiviteit.

  1. Bereid op de dag van de test een verse werkoplossing van 4 mM NADH door 4,5 mg NADH op te lossen in 1,5 ml tris-hcl, pH 8,0. Bewaren op ijs, beschermd tegen het licht.
  2. Ontdooi voorraadoplossingen van UDP-glucose, ATP, fosfoenolpyruvaat en NDP-kinase op ijs.
  3. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C.
  4. Stel elke glycogeensynthasetest in een buis van 1,5 ml in door de in tabel 2 vermelde reactiemengselreagentia toe te voegen.
BestanddeelVolume (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8250
Water179
100 mM glucose-6-fosfaat, pH 7,858
0,8 % m/v oesterglycogeen67
50 mM ATP80
4 mM NADH80
100 mM UDP-glucose28
40 mM fosfoenolpyruvaat20
0,5 MnCl28
Eindvolume770

Tabel 2: Samenstelling reactiemengsel voor bepaling van glycogeensynthase activiteit.

OPMERKING: Om de installatie te vergemakkelijken, kan een hoofdmix worden gemaakt die voldoende van elk van de bovengenoemde reagentia bevat om het aantal geplande testen te voltooien.

  1. Bereid een blancoreactie voor, waarbij de NADH in het bovenstaande mengsel wordt vervangen door water. Breng over naar een wegwerpmethacrylaatcuvet en gebruik dit om de nul op de spectrofotometer op 340 nm in te stellen.
  2. Neem één 770 μL van het aliquot reactiemengsel in een buisje van 1,5 ml. Voeg 2 μL NDP-kinase en 2 μL pyruvaatkinase/lactaatdehydrogenasemengsel toe, meng voorzichtig en incubeer bij 30 °C gedurende 3 minuten om het reactiemengsel voor te verwarmen.
  3. Voeg 30 μL van het glycogeensynthase bevattende monster toe in 20 mM Tris-buffer, pH 7,8; meng en breng het reactiemengsel over in een wegwerpmethacrylaatcuvette.
  4. Plaats het cuvet in de spectrofotometer en noteer de absorptie bij 340 nm met getimede intervallen gedurende 10 tot 20 minuten. Zet de verkregen absorpties uit tegen de tijd.
    OPMERKING: Een reactie waarbij het glycogeensynthasemonster wordt vervangen door 20 mM Tris-buffer moet worden uitgevoerd om te controleren op niet-enzymatische oxidatie van NADH. Afhankelijk van de zuiverheid van het monster kunnen andere controlereacties nodig zijn. Zie Discussie voor meer informatie.
  5. Bepaal de reactiesnelheid (zie Resultaten voor meer informatie).

2. Bepaling van de glycogeenfosforylase-activiteit

  1. Bereid voorraadoplossingen zoals aangegeven in tabel 3 (vóór de experimentele dag).
BestanddeelRoutebeschrijving
125 mM BUIZEN pH 6,8Los 3,78 g PIJPEN op in water.  Stel de pH in op 6,8 met NaOH en vul het volume aan tot 100 ml met water.
8% w/v oesterglycogeenWeeg 0,8 g oesterglycogeen af en voeg toe aan water.  Maak het uiteindelijke volume tot 10 ml met water en verwarm zachtjes / meng om glycogeen op te lossen.  Bewaren bij -20 °C.
200 mM Na fosfaat pH 6,8Los 2,63 g Na2HPO 4,7H 2O en 1,41 g NaH2PO4 op. H2O in water.  Breng het volume op 100 ml met water.
1 mM glucose-1,6-bisfosfaatLos 2 mg glucose-1,6-bisfosfaat op in 4 ml water.  Aliquot en bevroren bewaren bij -20 °C.   Stabiel voor ten minste enkele maanden.
10 mM NAPLos 23 mg NADP op in 3 ml water.  Aliquot en bevroren bewaren bij -20 °C.   Stabiel voor ten minste enkele maanden.

Tabel 3: Stamoplossingen die nodig zijn voor de bepaling van glycogeenfosforylaseactiviteit.

  1. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C
  2. Plaats elke glycogeenfosforylasetest in een buis van 1,5 ml door de onderstaande reactiemengselreagentia toe te voegen (tabel 4).
BestanddeelVolume (μl)
125 mM PIJPEN buffer pH 6,8160
Water70
8% w/v oesterglycogeen100
200 mM Nafosfaat 6,8400
1 mM glucose-1,6-bisfosfaat20
10 mM NAP20
Eindvolume770

Tabel 4: Samenstelling reactiemengsel voor bepaling van glycogeenfosforylase activiteit.

OPMERKING: Om de installatie te vergemakkelijken, kan een hoofdmix worden gemaakt die voldoende van elk van de bovengenoemde reagentia bevat om het aantal geplande testen te voltooien.

  1. Bereid een blancoreactie voor die de in tabel 4 vermelde componenten bevat, maar voeg een extra 30 μL van 25 mM PIJPEN-buffer toe, pH 6,8 (bereid door 125 mM PIJPEN-buffer 1/5 met water te verdunnen). Breng over naar een wegwerpmethacrylaatcuvet en gebruik om de nul op de spectrofotometer op 340 nm in te stellen.
  2. Neem één aliquot reactiemengsel van 770 μL in een buisje van 1,5 ml. Voeg 1 μL glucose-6-fosfaatdehydrogenase en 1 μL fosfoglucomutase toe, meng voorzichtig en incubeer bij 30 °C gedurende 3 minuten om het reactiemengsel voor te verwarmen.
  3. Voeg 30 μL van het glycogeenfosforylase bevattende monster toe aan een PIJP-buffer van 25 mM, pH 6,8. Meng en breng het reactiemengsel over in een wegwerpmethacrylaatcuvet.
  4. Plaats het cuvet in de spectrofotometer en noteer de absorptie bij 340 nm met getimede intervallen gedurende 10 tot 20 minuten. Zet de verkregen absorpties uit tegen de tijd.
    OPMERKING: Een reactie waarbij glycogeenfosforylase wordt vervangen door een PIJPEN-buffer van 25 mM moet worden opgenomen. Afhankelijk van de zuiverheid van het glycogeenfosforylasemonster kunnen ook andere controles nodig zijn (zie Discussie voor meer informatie).
  5. Bepaal de reactiesnelheid (zie Representatieve resultaten voor meer informatie).

3. Bepaling van de glycogeendebranching enzymactiviteit

  1. Bereid stamoplossingen zoals aangegeven in tabel 5 (voorafgaand aan de experimentele dag).
BestanddeelRoutebeschrijving
100 mM maleaatbufferLos 1,61 g maleïnezuur op in ~ 80 ml water.  Stel de pH in op 6,6 met NaOH en maak het uiteindelijke volume tot 100 ml met water.
300 mM triethanolaminehydrochloride/ 3 mM MgSO4 pH 7,5Los 27,85 g triethanolaminehydrochloride en 0,370 g MgSO4 op. 7H2O in ~ 400 ml water.  Stel de pH in op 7,5 met NaOH en vul met water aan tot een eindvolume van 500 ml.
150 mM ATP/12 mM NADPLos 1,24 g ATP op in ~ 10 ml water.  Controleer de pH en voeg NaOH toe om een pH van ~ 7,5 te behouden terwijl de ATP oplost.  Voeg 0,138 g NADP toe.  Stel de pH in op ~ 7,5 met NaOH en vul aan tot een eindvolume van 15 ml met water. Bewaren in aliquots bij – 20 °C. Stabiel voor enkele maanden.
50 mM Na fosfaat buffer pH 6,8Los 32,81 g Na2HPO 4,7H 2O en 17,61 g NaH2PO4 op. H2O in water.  Breng het volume op een eindvolume van 5 L met water.

Tabel 5: Stamoplossingen die nodig zijn voor de bepaling van glycogeendebranching enzymactiviteit.

  1. Bereid fosforylase limiet dextrine
    1. Los 0,3 g oesterglycogeen op in 10 ml natriumfosfaatbuffer van 50 mM, pH 6,8.
    2. Los voldoende gelyofiliseerd fosforylase A-poeder op om 60 E activiteit op te leveren in 50 mM fosfaatbuffer, pH 6,8.
      OPMERKING: Afhankelijk van de partij fosforylase A die wordt gekocht, zal de benodigde massa variëren, maar ligt over het algemeen tussen 5 en 10 mg poeder.
  2. Voeg 60 E fosforylase A toe aan de glycogeenoplossing en breng over in een dialysezak. Dialyseren bij kamertemperatuur tegen 1 L van 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 6,8 gedurende 8 uur. Stap over op de verse dialysebuffer en zet de incubatie 's nachts voort.
  3. Voeg nog eens 10 U fosforylase A toe en verander in verse dialysebuffer. Na 8 uur opnieuw overschakelen op verse dialysebuffer en de incubatie 's nachts voortzetten.
  4. Breng de inhoud van de dialysezak over in een centrifugebuis en kook gedurende 10 minuten. Koel op ijs en centrifugeer vervolgens op 10.000 x g gedurende 15 minuten.
  5. Breng het supernatant over in een dialysezak en dialyseer gedurende 8 uur tegen drie veranderingen van 2 L gedestilleerd water.
  6. Breng de inhoud van de dialysezak over in een centrifugebuis van 50 ml. Meet het volume en voeg twee volumes ijskoude absolute ethanol toe om de limiet dextrine te bespoedigen. Laat de buis 30 min op ijs staan.
    OPMERKING: Een wit neerslag moet onmiddellijk beginnen te vormen na de toevoeging van ethanol, maar als dit niet het geval is, voeg dan een druppel van 3 M NaCl toe.
  7. Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 15 minuten en gooi het supernatant weg. Spoel de witte pellet van limit dextrine tweemaal met 66% v/v ethanol, met ~30 ml voor elke spoeling.
  8. Breng de limietdextrine over in een mortel en laat volledig aan de lucht drogen. Wanneer de limiet dextrine droog is, maalt u tot een poeder met een stamper en brengt u over naar een geschikt vat voor opslag; droog bij 4 °C.
  9. Bereid voor gebruik als debranching enzyme substrate een 1% w/v oplossing in water.
  10. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C.
  11. Verwarm een verwarmingsblok of waterbad voor tot 95 °C.
  12. Bereid vier buisjes van 1,5 ml met elk 100 μL maleaatbuffer, 80 μL fosforylasegrensdextrine en 10 μL water. Deze buizen zullen worden gebruikt om de debranching enzyme assay uit te voeren. Label twee van de buizen Reactie en de andere twee buizen Controle.
  13. Voeg met getimede intervallen 10 μL van het debranching-enzymmonster toe aan de reactiebuizen en 10 μL buffer die werd gebruikt om het vertakkende enzymmonster aan de controlebuizen te bereiden. Incubeer bij 30 °C.
  14. Trek op gedefinieerde tijdstippen (bijv. incubatie van 5, 10 en 20 minuten) 50 μL uit elke reactie- en controlebuis en plaats deze onmiddellijk in het verwarmingsblok of het waterbad bij 95 °C. Verwarm gedurende 3 min.
  15. Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 2 minuten om neergeslagen eiwit te verwijderen.
    OPMERKING: Op dit punt kan de procedure indien nodig worden gestopt. De verwarmde monsters kunnen bevroren bij -20 °C worden bewaard totdat wordt overgegaan tot de meting van de vrijgekomen glucose (stap 17, hieronder).
  16. Meting van vrijgekomen glucose
    1. Breng 40 μL van het supernatant van de verwarmde monsters over naar wegwerpmethacrylaatcuvetten en voeg 833 μL triethanolaminehydrochloride/magnesiumsulfaatbuffer, 67 μL NADP/ATP-mengsel en 60 μL water toe. Meng door voorzichtig op en neer te pipetteren en pas op dat je geen luchtbellen introduceert.
      OPMERKING: Om de installatie te vergemakkelijken, kan een hoofdmix worden gemaakt die voldoende van elk van de bovengenoemde reagentia bevat om het aantal geplande testen te voltooien.
    2. Bereid een blancoreactie voor door 100 μL maleaatbuffer, 80 μL fosforylaselimietdextrine en 20 μL water te combineren. Meng goed en breng 40 μL over in een wegwerpmethacrylaatcuvet. Voeg 833 μL triethanolaminehydrochloride/magnesiumsulfaat, enz. toe zoals beschreven in stap 3.17.1.
    3. Stel de nul op de spectrofotometer in op 340 nm met behulp van de blancoreactie.
    4. Voeg 0,5 μL glucose-6-fosfaatdehydrogenase toe aan elk cuvet. Meng voorzichtig door langzaam op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en noteer vervolgens de absorptie bij 340 nm.
      OPMERKING: De absorptiewaarden moeten laag zijn, wat betekent dat de monsters weinig verontreinigd zijn met glucose-6-fosfaat.
    5. Voeg 0,5 μL hexokinase toe aan elke cuvette. Meng voorzichtig door langzaam op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en noteer vervolgens de absorptie bij 340 nm.
    6. Ga door met de incubatie bij kamertemperatuur gedurende nog eens 5 minuten. Noteer de absorptie bij 340 nm nogmaals. Als de absorptie is toegenomen ten opzichte van de absorptie na 15 minuten, ga dan door met de incubatie gedurende nog eens 5 minuten en controleer de absorptie opnieuw. Noteer de uiteindelijke absorptie bij 340 nm verkregen.
    7. Trek voor elk monster de absorptie bij 340 nm die is geregistreerd na toevoeging van glucose-6-fosfaatdehydrogenase af van de uiteindelijke absorptie verkregen na toevoeging van hexokinase. Zet de verkregen waarden af tegen de tijdsduur dat het overeenkomstige monster was geïncubeerd met debranching-enzym.

4. Bepaling van de glycogeen vertakkende enzymactiviteit

  1. Bereid voorafgaand aan de experimentele dag jodium / KI-oplossing door eerst 2,6 g KI op te lossen in 10 ml water. Weeg in een zuurkast 0,26 g jodium af en voeg toe aan de KI-oplossing.
    LET OP: Jodium is schadelijk bij contact met de huid of bij inademing. Meng om het jodium op te lossen en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen het licht. Bereid ook 125 mM PIJPEN buffer, pH 6,8 (zie tabel 3).
  2. Maak bij het begin van experimenten een werkvoorraad van aangezuurd jodiumreagens.
    1. Neem 45,7 ml water in een buis van 50 ml en voeg 150 μL jodium/KI-oplossing toe, gevolgd door 150 μL 1 M HCl.
    2. Meng goed en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen het licht. De oplossing is stabiel gedurende ten minste 3 dagen onder deze omstandigheden.
  3. Maak op de dag van het experiment een verse 10 mg / ml oplossing van amylose.
    1. Weeg 50 mg amylose af en breng over in een buis van 15 ml.
    2. Voeg 200 μL absolute ethanol toe en schud voorzichtig.
    3. Voeg 500 μL 2 M KOH toe en schud voorzichtig.
      LET OP: KOH veroorzaakt ernstige brandwonden en oogbeschadiging. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    4. Voeg 0,5 ml water toe terwijl je zachtjes schudt. Als het amylose niet volledig oplost, voeg dan nog eens 0,5 ml water toe.
    5. Stel de pH in op ~6,5 tot 7,0 met 1 M HCl.
      LET OP: HCl kan irritatie van ogen, huid en luchtwegen veroorzaken. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    6. Voeg water toe om een eindvolume van 5 ml te bereiken.
    7. Steriliseren door passage door een 0,2 μm spuiteindfilter en bewaren bij kamertemperatuur. Niet koelen of invriezen.
  4. Verwarm een waterbad voor tot 30 °C.
  5. Bereid twaalf buizen van 1,5 ml, elk met 1 ml aangezuurd jodiumreagens. Zet apart op de bank. Deze zullen worden gebruikt om de vertakkende enzymreactie te stoppen.
  6. Bereid vier buizen van 1,5 ml met elk 150 μL amylose, 150 μL PIPES-buffer en 45 μL water. Deze buizen zullen worden gebruikt om de vertakkende enzymtest uit te voeren. Label twee van de buizen Reactie en de andere twee buizen Controle.
  7. Voeg met getimede intervallen 5 μL vertakkend enzymmonster toe aan de reactiebuizen en 5 μL buffer die werd gebruikt om het vertakkende enzymmonster aan de controlebuizen te bereiden. Incubeer bij 30 °C.
  8. Trek op gedefinieerde tijdstippen (bijv. 5, 10 en 15 minuten incubatie) 10 μL uit elke reactie- en controlebuis en voeg toe aan de buizen van 1,5 ml die 1 ml verzuurd jodiumreagens bevatten. Voeg nog eens 140 μL water toe en meng goed. Overzet op wegwerpcuvetten.
    OPMERKING: De monsters moeten blauw van kleur zijn en de oplossing moet vrij zijn van neerslag. De gevormde kleur is stabiel gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur.
  9. Bereid een monster dat 1 ml verzuurd jodiumreagens en 150 μL water bevat. Meng goed en breng over op een cuvette. Gebruik deze cuvette om de nul op de spectrofotometer in te stellen op 660 nm.
  10. Lees de absorptie van elk van de twaalf monsters bij 660 nm. Bepaal de snelheid van de vertakkende enzymreactie door de absorptie verkregen in aanwezigheid van vertakkend enzym (Reactie) af te trekken van de absorptie wanneer er op elk tijdstip geen vertakkend enzym aanwezig is (Controle). Zie Representatieve resultaten voor meer informatie.

5. Kwalitatieve beoordeling van glycogeenvertakking

  1. Bereid verzadigde calciumchlorideoplossing door 74,5 g watervrij calciumchloride toe te voegen aan ~ 40 ml water en roeren. Voeg nog wat water toe en blijf roeren. Maak het volume tot 100 ml met water en blijf roeren tot de CaCl2 volledig is opgelost.
  2. Bereid een werkvoorraad jodium/CaCl2 kleurreagens door 50 μL KI/jodium stockoplossing (zie stap 4.1 hierboven) te mengen met 13 ml verzadigde CaCl2-oplossing in een buis van 15 ml. Meng goed en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen het licht. De oplossing is onder deze omstandigheden minstens 1 week stabiel.
  3. Bepaling van de vertakking
    1. Combineer in een buis van 1,5 ml 650 μL jodium / CaCl2 kleurreagens met 100 μL water en meng grondig. Breng de oplossing over in een wegwerpmethacrylaatcuvet.
      OPMERKING: De oplossing in de cuvette moet helder en lichtgeel van kleur zijn.
    2. Plaats in de spectrofotometer en verzamel, draaiend in een golflengtescanmodus, een achtergrondspectrum van 330 nm tot 800 nm.
    3. Combineer in een buis van 1,5 ml 650 μL werkend jodium / CaCl2 kleurreagens met 50 μg oesterglycogeen. Breng het uiteindelijke volume met water op 750 μL en meng grondig. Breng de oplossing over in een wegwerpmethacrylaatcuvet.
      OPMERKING: De oplossing in de cuvette moet helder zijn en een diep oranje / bruine kleur.
    4. Plaats in de spectrofotometer en verzamel een absorptiespectrum van 330 nm tot 800 nm.
    5. Herhaal stap 4.4.3 tot en met 4.4.4 met 50 μg amylopectine en 30 μg amylose.
      OPMERKING: Het amylopectinemonster moet geel/groen zijn en het amylosemonster moet groen/blauw zijn. Beide monsters moeten duidelijk zijn. De gevormde gekleurde complexen zijn stabiel, zonder verandering in het absorptiespectrum, gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Om een indicatie te krijgen van de vertakte structuur van een niet-gekarakteriseerd glycogeenmonster, combineert u 25 μg tot 50 μg glycogeen met 650 μL werkend jodium / CaCl2 kleurreagens. Ga verder zoals hierboven, breng het volume op 750 μL met water, meng grondig en breng over op een methacrylaatcuvet.
      OPMERKING: Het glycogeenmonster moet een gele / oranje tot oranje / bruine kleur opleveren, afhankelijk van de mate van vertakking (lengte van de buitenste ketens) van het aanwezige glycogeen. Nogmaals, het monster moet duidelijk zijn. Zie Representatieve resultaten voor meer informatie.
    7. Verzamel het absorptiespectrum.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bepaling van glycogeensynthase-activiteit
Figuur 1 toont representatieve resultaten van glycogeensynthase-assays met gezuiverde enzymen. In paneel A was er, na een lichte vertraging, een lineaire afname van de absorptie bij 340 nm in de tijd gedurende een periode van ongeveer 12 minuten. De snelheid van verandering in absorptie in figuur 1A was ~0,12 absorptie-eenheden/min. Een snelheid van verandering in absorptie tussen ~ 0,010 en ~ 0,20 ab...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Over het algemeen zijn de belangrijkste voordelen van alle gepresenteerde methoden hun lage kosten, gemak, snelheid en gebrek aan afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur. Het grote nadeel dat ze allemaal delen is gevoeligheid in vergelijking met andere beschikbare methoden. De gevoeligheid van de procedures die betrekking hebben op de productie of consumptie van NADH/NADPH zijn gemakkelijk in te schatten. Aangezien de extinctiecoëfficiënt van NADH/NADPH 6,22 M-1 cm-1 is, geeft een eenvoudige...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen belangenconflicten bekend die verband houden met dit werk en er is geen financiële steun voor dit werk geweest die de uitkomst ervan had kunnen beïnvloeden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur wil Karoline Dittmer en Andrew Brittingham bedanken voor hun inzichten en vele nuttige discussies. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van het Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 en 03-20-04).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amylopectin (amylose free) from waxy cornFisher ScientificA0456
AmyloseBiosynth CarbosynthYA10257
ATP, disodium saltMilliporeSigmaA3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium saltMilliporeSigmaG6893
D-glucose-6-phosphate, sodium saltMilliporeSigmaG7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeastMilliporeSigma10127655001
Glycogen, Type II from oysterMilliporeSigmaG8751
HexokinaseMilliporeSigma11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mLFisher Scientific14-955-128Methacrylate is vereist omdat sommige procedures worden uitgevoerd bij 340 nm of lager
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium saltMilliporeSigmaN0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium saltMilliporeSigma43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinaseMilliporeSigmaN0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium saltMilliporeSigmaP7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscleMilliporeSigmaP3397
Phosphorylase A from rabbit muscleMilliporeSigmaP1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscleMilliporeSigmaP0294
UDP-glucose, disodium saltMilliporeSigmaU4625

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glycogeen synthase assayGlycogeenvertakkingGlycogeenfosforylaseAbsorbantiemetingEnzymactiviteitsassayGlucosemetingJodiumkleurreagens

Gerelateerde artikelen