Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

Summary

De gouden standaard in de cardiologie voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten zijn cardiomyocyten. Dit artikel beschrijft aanpassingen aan de niet-Langendorff-techniek om cardiomyocyten bij muizen te isoleren.

Abstract

De behoefte aan reproduceerbare maar technisch eenvoudige methoden die hoogwaardige cardiomyocyten opleveren, is essentieel voor onderzoek in de hartbiologie. Cellulaire en moleculaire functionele experimenten (bijv. Contractie, elektrofysiologie, calciumcyclus, enz.) op cardiomyocyten zijn de gouden standaard voor het vaststellen van mechanismen van ziekte. De muis is de soort bij uitstek voor functionele experimenten en de beschreven techniek is specifiek voor de isolatie van cardiomyocyten van muizen. Eerdere methoden die een Langendorff-apparaat vereisen, vereisen een hoge mate van training en precisie voor aorta-cannulatie, wat vaak resulteert in ischemie. Het veld verschuift naar Langendorff-vrije isolatiemethoden die eenvoudig zijn, reproduceerbaar zijn en levensvatbare myocyten opleveren voor fysiologische gegevensverzameling en cultuur. Deze methoden verminderen de ischemietijd aanzienlijk in vergelijking met aortacannulatie en resulteren in betrouwbaar verkregen cardiomyocyten. Onze aanpassing aan de Langendorff-vrije methode omvat een eerste perfusie met ijskoude reinigingsoplossing, het gebruik van een stabiliserend platform dat zorgt voor een stabiele naald tijdens perfusie en extra verteringsstappen om betrouwbaar verkregen cardiomyocyten te garanderen voor gebruik in functionele metingen en cultuur. Deze methode is eenvoudig en snel uit te voeren en vereist weinig technische vaardigheid.

Introduction

Al tientallen jaren is een essentieel idee in de hartbiologieliteratuur het moleculaire werkingsmechanisme. Het werkingsmechanisme moet worden vastgesteld om betrouwbare studies te kunnen publiceren. Een gevestigde strategie om het moleculaire mechanisme te bepalen is geïsoleerde cardiomyocytenstudies, die cardiomyocyten van hoge kwaliteit vereisen voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens. Cellulaire en moleculaire experimenten uitgevoerd op cardiomyocyten om het werkingsmechanisme te bepalen zijn de gouden standaard voor het onderzoeken van contractie¹, elektrofysiologie², calcium (Ca 2+) cyclus³, myofilament Ca²⁺ gevoeligheid⁴, cytoskelet⁵, metabolisme⁶, effecten van hormonen⁷, signaalmoleculen⁸, geneesmiddelenstudies⁹ enz. De muis is de voorkeurssoort geworden voor de meeste hartbiologische experimenten vanwege het gemak van genetische manipulatie, zijn kleine formaat, zijn relatief korte levensduur, lage kosten, enz.¹⁰. De betrouwbare isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten van muizen is echter niet triviaal met de huidige technieken.

Labs isoleren cardiomyocyten al bijna 70 jaar¹¹. Vrijwel alle technieken om cardiomyocyten te isoleren zijn afhankelijk van de vertering van het hart via verschillende enzymen (collagenase, protease, trypsine, enz.). In de vroege perioden (jaren 1950-1960) werd de brokmethode gebruikt, waarbij het hart werd verwijderd, in veel kleinere stukjes werd gesneden en in oplossing werd geïncubeerd met collagenase / protease / trypsine¹². In de jaren 1970 implementeerden laboratoria de verbeterde "Langendorff" -methode¹³, die cardiomyocyten isoleerde met behulp van een op coronaire perfusie gebaseerde isolatietechniek (retrograde perfusie met enzym via het Langendorff-apparaat); Deze techniek blijft de dominante methode van myocytenisolatie in het veld vandaag, ~50 jaar later^14,15,16. Recent werk is verschoven naar het in vivo cannuleren van het hart om de hypoxietijd en ischemische schade te beperken, wat resulteert in superieure cardiomyocytenisolaties (betere opbrengsten en hogere kwaliteit)¹⁷. Onlangs is dit geëvolueerd naar het uitvoeren van in vivo, Langendorff-vrije hartperfusies 18,19,20,21,22. We hebben de Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek ontwikkeld op basis van de Ackers-Johnson et ^{al.18-techniek} en verschillende componenten aangepast van de vele eerdere isolatietechnieken. Deze belangrijke aanpassingen omvatten de injectie van een ijskoude opruimbuffer en de integratie van een ondersteunend platform om de naald te stabiliseren, waardoor minder manipulatie van het hart mogelijk is. Ook gedetailleerd in deze techniek is temperatuurregeling van geïnjecteerde buffers (37 °C), die de tijd tussen in vivo injectie en spijsvertering verkortte als gevolg van minder EDTA-perfusie zoals eerder gepubliceerd¹⁸. Door manipulatie van het hart te verminderen en daardoor de grootte van de punctieplaats te minimaliseren, wordt een grondige en constante perfusie van de kransslagaders verkregen. We verfijnden de techniek ook met een secundaire brokmethode vertering, de hoeveelheid EDTA in de geïnjecteerde clearingbuffer en veranderden de pH. Onze beschreven techniek is betrouwbaarder, efficiënter en vereist niet de uitgebreide training / oefening in vergelijking met het gebruik van het Langendorff-apparaat (tabel 1).

Protocol

Alle procedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Ohio State University in overeenstemming met de NIH-richtlijnen.

1. Bereiding van de oplossing

OPMERKING: Zie tabel 2 voor bufferconcentraties.

1. Pre-isolatie (tot 2 weken voor myocytenisolatie)
   1. Perfusiebufferbasis: Bereid 1 L perfusiebufferbasis (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose en BDM) voor in 1 L ultrazuiver 18,2 MΩ·cm H₂O. Stel aan tot pH_7,4 vóór 0,22 μm steriele filtratie. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
   2. Clearing buffer: Bereid 1 L clearing buffer (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA, en BDM) in 1 L ultrapure 18,2 MΩ·cm H₂O. Breng aan op pH_7,4 voorafgaand aan 0,22 μm steriele filtratie. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
   3. 100 mM CaCl 2 stockoplossing: Weeg 1,11 g CaCl 2 af en los op in 100 ml ultrapuur 18,2 MΩ·cm H₂ O. Bewaren bij kamertemperatuur tot de dag van isolatie.
   4. Liberase aliquots: Los 5 mg spijsverteringsenzymen op in 5 ml steriel, RNase-vrij water. Bereid 0,8 ml aliquots en bewaar bij -20 °C tot de dag van isolatie.
   5. Lamineer de gerechten: Breng 100 μL 40 μg/ml muislaminine aan op steriele petrischalen van 30 ml met glazen bodem. Laat 30 minuten zitten en verwijder overtollig laminine. Zet het laminine op een petrischaaltje met UV-incubatie op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie (gelamineerde petrischalen kunnen tot 2 weken worden gebruikt).
   6. DMEM-media: Voeg in een bioveiligheidskast 2,5 ml FBS, 0,5 ml penicilline-streptomycine (50 U / ml-50 μg) en 1 ml 500 mM BDM toe aan 46 ml DMEM. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie (media kunnen maximaal 2 weken worden gebruikt).
   7. M199-media: Bereid 1 l M199-media (NaHCO₃, HEPES, L-glutathion, M199, BDM en BSA) in 1 l ultrapuur 18,2 MΩ·cm H₂O. Stel aan tot pH 7,4 voorafgaand aan steriele filtratie (0,22 μm filter). Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
   8. 500 mM BDM-voorraad: Voeg 0,5 g BDM toe aan 10 ml ultrazuiver 18,2 MΩ·cm H₂O. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.
   9. Stabiliserende platformcreatie: Vorm playdough rond de basis van de naald die in de Luer-stopkraan is geschroefd. Vorm naar de petrischaal die het hart bevat en zorg ervoor dat de naald op de juiste hoogte is voor ventrikelinjectie (~ 5 mm boven de bodem van de schaal).
2. De dag van isolatie
   1. Perfusiebuffer: Voeg op de dag van de isolatie 9,5 mg MgCl₂ toe aan 100 ml perfusiebufferbasis. Laat volledig mengen voordat u 30 ml voltooide perfusiebuffer verwijdert en plaats in een schone, brede mond, 100 ml glazen fles met een schroefdopdeksel (digestiebuffer).
      OPMERKING: Deze toevoegingen kunnen worden gedaan op de dag van isolatie zonder extra pH-aanpassingen, omdat hun toevoeging de pH verwaarloosbaar verandert.
      1. Verwijder 12 ml perfusiebuffer en zet opzij (stopbuffer). Giet de resterende 58 ml perfusiebuffer in een andere schone, brede mond, 100 ml glazen fles met een schroefdopdeksel. Bewaar de resterende perfusiebuffer bij 37 °C gedurende de isolatie.
   2. Digestiebuffer: Voeg 7,5 μL CaCl₂ toe aan 30 ml perfusiebuffer voor een eindconcentratie van 25 μM. Voeg onmiddellijk voorafgaand aan de isolatie 770 μL Liberase toe aan de digestiebuffer voor een eindconcentratie van 26 μg/ml.
   3. Stopbuffer: Los 240 mg BSA op in 12 ml perfusiebuffer. Bewaren bij 37 °C gedurende de gehele isolatie.
   4. Buffer opruimen: Bereid een spuit van 3 ml met opruimbuffer voor en verwijder de naald van bubbels. Bewaren op ijs tot isolatie.

2. Spruitstukvoorbereiding

1. Wis het temperatuurgeregelde spruitstuk met vers voorbereide perfusiebuffer en zorg ervoor dat er geen bubbels achterblijven. Gebruik een Luer-vergrendelingsconnector, schroef een naald van 27 G in en ontdoe je van bubbels. Een vrij spruitstuk is essentieel voor een succesvolle isolatie.

3. Voorbereiding van dieren

1. Injecteer de muis intraperitoneaal met 100 mg/kg ketamine en 20 mg/kg xylazine naar lichaamsgewicht onmiddellijk voorafgaand aan de isolatie. Deze procedure gebruikte een mannelijke, 4 maanden oude C57Bl / 6-muis.
2. Plaats de muis indien nodig op een verwarmd chirurgisch kussen om sedatie aan te moedigen. Tent de armen van de muis en plak de ledematen en de basis van de staart vast aan een blauwe labluier. Zorg ervoor dat het dier volledig wordt verdoofd door het terugtrekken van de teen-knijpreflex. Breng een steriel gordijn aan rond het operatiegebied.

4. Cardiomyocyten isolatie procedure

1. Stel het borstbeen van de muis bloot en snijd, lateraal naar de middellijn, proximaal door de ribben en naar de oksel. Snijd voorzichtig volledig door het middenrif en zorg voor ondiepe snijwonden om het hart te vermijden. Klem het borstbeen vast met een hemostat en vouw de ribben naar achteren om de borstholte bloot te leggen.
2. Verwijder voorzichtig het hartzakje uit het hart en snijd volledig door de inferieure vena cava, onmiddellijk distaal van het hart. Gebruik een spuit van 3 ml met een naald van 27 G om snel 3 ml ijskoude opruimbuffer in de rechterkamer van het hart te injecteren gedurende 1 minuut.
3. Houd het hart voorzichtig vast met een pincet en trek weg van het lichaam, waarbij zoveel mogelijk van de aorta wordt blootgesteld. Gebruik een hemostat, klem de opstijgende aorta, zorg ervoor dat je de boezems niet klemt en snijd het hart uit de borst.
4. Breng het geklemde hart snel over naar het deksel van een polypropyleen petrischaaltje met ongeveer 10 ml warme perfusiebuffer. Plaats het geklemde hart in het ondersteunende platform en gebruik een gestabiliseerde naald van 27 G die aan het spruitstuk is bevestigd om gedurende 5 minuten 10 ml temperatuurgecontroleerde 37 °C perfusiebuffer in de linkerkamer te injecteren.
5. Breng het geklemde hart en het steunplatform over in een petrischaaltje met ongeveer 5 ml verteringsbuffer. Wissel invoerspuiten in voor een spuit van 50 ml met 25 ml verteringsbuffer.
6. Verwijder het spruitstuk van eventuele bubbels en de resterende perfusiebuffer vóór injectie. Vervang de naald voorzichtig in dezelfde naaldpositie in de linkerventrikeltop.
7. Gebruik een perfusiepomp om de temperatuurgecontroleerde 37 °C verteringsbuffer gedurende 15 minuten in de linker ventrikel te injecteren met behulp van een spuit van 50 ml. Regel de temperatuur van de oplossing met een watermantel die vooraf is gekalibreerd om een oplossing van 37 °C aan het einde van de naald uit te werpen.
8. Verwijder de ventrikels uit de boezems en breng over in een bekerglas van 10 ml. Voeg 3 ml verteringsbuffer toe aan het bekerglas en snijd met een scherpe schaar de ventrikels in grote stukken. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en plaats gedurende 5 minuten in een schudwaterbad voorverwarmd tot 37 °C.
9. Gooi het supernatant weg en zorg ervoor dat er geen brokken weefsel worden verwijderd. Resuspendeer de weefselbrokken in 3 ml verteringsbuffer en trituleer gedurende ongeveer 4 minuten of totdat een homogeen mengsel is bereikt.
10. Filter de cellen door een 70 μm nylon celzeef in een polypropyleenbuis van 50 ml.
11. Breng het filtraat terug naar een 14 ml polypropyleenbuis met ronde bodem en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 100 tpm. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 3 ml stopbuffer.
12. Voeg 54 μL CaCl 2-voorraad van 100 mM toe aan de geresuspendeerde cellen voor een uiteindelijke CaCl_{2-concentratie} van 1,8 mM. Deze stap kan ook stapsgewijs worden uitgevoerd om de celopbrengst te verhogen.
13. Laat levende cellen 10 minuten bezinken door de zwaartekracht voordat u het supernatant met dode cellen verwijdert. Resuspendie van de pellet in opslagoplossing (perfusieoplossing met 200 μM CaCl₂). Deze cellen kunnen nu worden gebruikt voor functionele experimenten (d.w.z. calciumbeeldvorming / -contractie, patchklem, enz.), Cultuur, enz.
    OPMERKING: De cellen kunnen ook worden geresuspendeerd in laboratorium- of experimentafhankelijke oplossingen.

5. Celkweek

1. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of door een veldweergave te tellen met behulp van een gerasterde afdeklaag. Omdat myocyten erg groot zijn, is tellen met behulp van een hemocytometer niet altijd nauwkeurig. Dit wordt gebruikt om een idee te krijgen van hoeveel cellen er ongeveer uit de isolatie zijn gehaald.
2. Verdun de cellen tot ~ 25.000 cellen / ml met DMEM-media. Voeg 1 ml celoplossing toe aan elk putje.
3. Incubeer bij 37 °C, 95% O 2, 5% CO 2 gedurende₂ uur.
4. Zuig voorzichtig DMEM-media uit elke put en voeg 2 ml M199-media toe.
5. Incubeer bij 37 °C, 95% O 2, 5% CO₂ gedurende maximaal 24 uur.

Results

Er zijn een paar elementen om te onderzoeken bij het bepalen van het succes van een isolatie. Ten eerste moeten de cardiomyocyten staafvormig zijn zonder membraanblebs, zoals de cellen geïsoleerd in figuur 1. Een typische isolatie levert ~80% op van de myocyten die staafvormig zijn. Als de isolatie iets minder dan 50% staafvormige cellen oplevert, wordt het beschouwd als een mislukte isolatie en worden cardiomyocyten niet gebruikt. Ten slotte moeten de cardiomyocyten rustig zijn. Spontane sa...

Discussion

Het belangrijkste voordeel van onze Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek is dat het hypoxie en ischemische tijd beperkt door geen cannulatie naar een Langendorff-apparaat te vereisen. Als alternatief voor klassieke Langendorff-technieken die enkele minuten nodig hebben om het hart te verwijderen, te reinigen en op te hangen, wat vaak resulteert in ischemische schade aan de myocyt, omvat onze methode een in vivo zuivering van bloed via een ijskoude reinigingsoplossing. De ijskoude zuiveringsb...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815