Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Samenvatting

We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.

Samenvatting

Kwantificering van cellen is noodzakelijk voor een breed scala aan biologische en biochemische studies. Conventionele beeldanalyse van cellen maakt meestal gebruik van fluorescentiedetectiebenaderingen, zoals immunofluorescente kleuring of transfectie met fluorescerende eiwitten of randdetectietechnieken, die vaak foutgevoelig zijn vanwege ruis en andere niet-idealiteiten in de beeldachtergrond.

We ontwierpen een nieuw algoritme dat macrofagen en fibroblasten nauwkeurig kon tellen en onderscheiden, cellen van verschillende fenotypen die vaak colocaliseren tijdens weefselregeneratie. MATLAB werd gebruikt om het algoritme te implementeren, dat verschillende celtypen onderscheidde op basis van hoogteverschillen van de achtergrond. Een primair algoritme werd ontwikkeld met behulp van een gebiedsgebaseerde methode om rekening te houden met variaties in celgrootte / structuur en zaaiomstandigheden met hoge dichtheid.

Niet-idealiteiten in celstructuren werden verantwoord met een secundair, iteratief algoritme met behulp van interne parameters zoals celdekking berekend met behulp van experimentele gegevens voor een bepaald celtype. Ten slotte werd een analyse van cocultuuromgevingen uitgevoerd met behulp van een isolatiealgoritme waarbij verschillende celtypen selectief werden uitgesloten op basis van de evaluatie van relatieve hoogteverschillen binnen het beeld. Deze aanpak bleek nauwkeurig cellen te tellen binnen een foutmarge van 5% voor monoculturele cellen en binnen een foutmarge van 10% voor gecocultureerde cellen.

Inleiding

Software wordt routinematig geïmplementeerd tijdens beeldanalysetechnieken om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig, efficiënt en onbevooroordeeld zijn. Voor celgebaseerde assays is een veel voorkomend probleem de verkeerde identificatie van cellen. Beelden met onjuiste focus- en contrastinstellingen kunnen leiden tot celvervaging, waarbij de grens van individuele cellen moeilijk te identificeren is¹. De aanwezigheid van externe beeldkenmerken zoals poriën, bubbels of andere ongewenste objecten kan de telprocedures belemmeren door het telproces te vertragen en tot verkeerde identificatie te leiden. Bovendien kan het tellen van cellen belastend zijn en kan het tellen van honderden replicaties extreem tijdrovend zijn. Bovendien bestaat er een inherente subjectieve bias tijdens handmatig tellen, en daarom is de besluitvorming met betrekking tot celidentificatie vaak onnauwkeurig². Geautomatiseerde software biedt een opwindend potentieel om al deze problemen te omzeilen door cellen snel en nauwkeurig te onderscheiden van externe objecten, inclusief objecten die ver buiten de menselijke capaciteit liggen voor nauwkeurige detectie, op basis van goed gedefinieerde identificatiecriteria die de invloed van onderzoeksbias verminderen. Veelgebruikte technieken om cellen te identificeren met behulp van geautomatiseerde software omvatten twee hoofdmethoden: segmentatie en^{drempeling 3}. Hierin demonstreren we een generaliseerbaar gebiedsgebaseerd protocol dat snelle, nauwkeurige en goedkope celtelling mogelijk maakt binnen een breed toegankelijk softwareframework.

Segmentatietechnieken, zoals randdetectie, proberen individuele cellen te isoleren door gebruik te maken van intensiteitsverschillen binnen een afbeelding. Intensiteitsveranderingen die een cel onderscheiden van de rest van de afbeelding bestaan meestal uit scherpe veranderingen in helderheid⁴. Randdetectie omvat een regulariserende filterstap, gevolgd door een differentiatiestap waarin intensiteitsveranderingen worden gedetecteerd. Het differentiatieproces identificeert randen en contouren binnen het beeld van veranderingen met hoge intensiteit, en deze randen en contouren zijn gecorreleerd met celaanwezigheid. Hoewel beelden met ruis kunnen worden uitgevoerd via^{denoising-algoritmen 4}, worden randdetectietechnieken ideaal gebruikt voor het analyseren van afbeeldingen met weinig achtergrondruis. Het proces functioneert optimaal wanneer celgrenzen duidelijk en gemakkelijk te onderscheiden zijn en niet worden belemmerd door helderheidscontouren die geen verband houden met celaanwezigheid, celonscherpte, vreemde objecten of gedefinieerde interne celstructuren ^1,2. Als een beeld bijzonder luidruchtig is, kunnen cellen verder worden onderscheiden door fluorescerende kleuring of transfectie met fluorescerende eiwitten ^2,5. Hoewel dit de nauwkeurigheid van segmentatietechnieken aanzienlijk verbetert, vereist het extra kosten en extra tijdsinvesteringen om celculturen voor te bereiden op beeldvorming.

Drempeltechnieken omvatten de verdeling van een afbeelding in twee categorieën: de voorgrond en de achtergrond, met cellen toegewezen aan de voorgrond³. Deze technieken maken gebruik van kleur/contrastveranderingen om de schijnbare hoogte van een object te definiëren; objecten die routinematig 'groter' zijn dan de achtergrond kunnen gemakkelijk als cellen worden geïdentificeerd. De waterscheiding-transformatie functioneert op deze manier door oppervlakken te associëren met lichte pixels als voorgrond en die met donkere pixels als achtergrond ^6,7. Door middel van op hoogte gebaseerde identificatie kunnen drempeltechnieken routinematig ruis van gewenste objecten onderscheiden, op voorwaarde dat ze binnen hetzelfde brandpuntsvlak bestaan. In combinatie met een gebiedsgebaseerde kwantificering kan een stroomgebiedtransformatie nauwkeurig groepen objecten identificeren in omgevingen waar typische segmentatietechnieken zoals randdetectie onnauwkeurig zouden zijn.

Stroomgebiedtransformaties worden vaak gekoppeld aan segmentatietechnieken om beelden voor te bereiden voor een schonere analyse, wat resulteert in een hogere nauwkeurigheid van het tellen van cellen. Voor dit proces wordt de waterscheiding-transformatie gebruikt om potentiële interessante regio's te markeren voorafgaand aan segmentatie. Een waterscheidingstransformatie biedt unieke voordelen door cellen op de voorgrond van afbeeldingen te identificeren, wat de nauwkeurigheid van segmentatieanalyse kan verbeteren door potentiële valse positieven voor cellen te verwijderen, zoals ongelijke achtergrondstukken. Er kunnen zich echter problemen voordoen bij het aanpassen van celgebaseerde beelden aan een waterscheidingstransformatie. Beelden met een hoge celdichtheid kunnen worden geplaagd door ondersegmentatie, waarbij aggregaten van cellen worden geïdentificeerd als een enkelvoudige groep in plaats van als individuele componenten. De aanwezigheid van ruis of scherpe intensiteitsveranderingen kan ook leiden tot oversegmentatie, waarbij het algoritme cellen overisoleren, wat resulteert in overmatige en onnauwkeurige celtellingen⁸.

Hierin beschrijven we een methode om de primaire nadelen van de waterscheidingstransformatie te minimaliseren door componenten van een drempelanalyse op te nemen in een gebiedsgebaseerd kwantificeringsalgoritme, zoals weergegeven in figuur 1. Met name werd dit algoritme geïmplementeerd met open-source en / of algemeen beschikbare software, en toepassing van dit raamwerk voor het tellen van cellen was mogelijk zonder dure reagentia of complexe celvoorbereidingstechnieken. RAW264.7 macrofagen werden gebruikt om de methode te demonstreren vanwege hun cruciale rol bij het reguleren van bindweefselonderhoud en wondgenezingsprocessen⁹. Bovendien werden NIH / 3T3 fibroblasten geanalyseerd vanwege hun sleutelrol in weefselonderhoud en -reparatie. Fibroblastcellen bestaan vaak naast en ondersteunen macrofagen, waardoor de noodzaak ontstaat om deze fenotypisch verschillende celtypen te onderscheiden in cocultuurstudies.

Celtellingen van afbeeldingen met een hoge levensvatbare celdichtheid (VCD) kunnen betrouwbaar en efficiënt worden gekwantificeerd door het gebied te berekenen dat door de cellen wordt bestreken en het gemiddelde gebied dat door een enkelvoudige cel wordt ingenomen. Het gebruik van thresholding in tegenstelling tot segmentatie voor celidentificatie maakte ook complexere analyses mogelijk, zoals experimenten waarin verschillende celtypen in coculturen tegelijkertijd werden geanalyseerd. NIH / 3T3 fibroblasten, die vaak blijken te colocaliseren met RAW264.7 macrofagen binnen een wondgenezingsplaats, bleken te groeien op een brandpuntsvlak dat zich onderscheidde van het brandpuntsvlak van macrofagen¹⁰. Dienovereenkomstig werden meerdere drempelalgoritmen uitgevoerd om de achtergrond en voorgrond te definiëren, afhankelijk van het celtype dat wordt geanalyseerd, waardoor nauwkeurig geteld kan worden van twee verschillende celtypen binnen dezelfde afbeelding.

Protocol

1. Celkweek en beeldverwerving

1. Kweek RAW264.7 macrofagen bij 37 °C en 5% CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 1,5 g/l natriumbicarbonaat en 5 μM β-mercaptoethanol.
   1. Voor monocultuurbeeldvorming kweekt u RAW264.7-cellen met een dichtheid van 25.000 cellen/cm² in een celkweekkolf van 5 ml met 1 ml medium.
2. Kweek NIH/3T3 cellen bij 37 °C en 5% CO₂ in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine¹¹.
3. Voor beeldvorming van de cocultuur, kweek RAW264.7 macrofagen en NIH /3T3 fibroblasten samen in verschillende verhoudingen, bij een totale dichtheid van 25.000 cellen / cm². Gebruik een kweekmedium dat bestaat uit 1 deel RAW264,7 medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine, 1,5 g/L natriumbicarbonaat en 5 μM β-mercaptoethanol) en 1 deel NIH/3T3 medium (DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine).
4. Na het zaaien incuberen van cellen bij 37 °C en 5% CO₂ om een levensvatbare celdichtheid van 80% celconfluentie te bereiken.
5. Beeldcellen met een omgekeerde microscoop uitgerust met een 40x objectief. Verkrijg alle afbeeldingen in grijswaarden en exporteer ze in het onbewerkte '.czi'-bestand.
   1. Bepaal de capaciteit van het algoritme om afbeeldingen met een reeks beeldkwaliteiten nauwkeurig te evalueren. Verkrijg afbeeldingen met verschillende foci, waardoor zowel 'niet-bolvormige' afbeeldingen (figuur 2) als 'bolvormige' afbeeldingen (figuur 3) worden geproduceerd.
   2. Exporteer en converteer celafbeeldingen naar het 8-bits tiff-beeldformaat (.tiff) met ImageJ met behulp van de functie 'Batch Convert' op de onbewerkte '.czi'-bestanden voorafgaand aan MATLAB-analyse. Sla geconverteerde afbeeldingen op in een lokale map en breng deze afbeeldingsbestanden handmatig over naar de relevante MATLAB-bak.

2. Beeldanalyse-monocultuur met behulp van het bestand "monocultuur.m"

OPMERKING: De volgende stappen zijn uitgevoerd met MATLAB. Drie bestanden werden gebruikt voor het MATLAB-protocol: "process.m" (Supplemental coding file 1), het bestand met het algoritme, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), het bestand dat moet worden uitgevoerd voor het analyseren van monocultuurafbeeldingen en "coculture_modified.m" (Supplemental coding file 3), het bestand dat moet worden uitgevoerd voor het analyseren van coculture-afbeeldingen.

1. Gebruik de gebiedsgebaseerde methode om afbeeldingen te verkrijgen van cellen met relatieve hoogtevariaties. Beelduitvoer voor elke substap door gebruik te maken van de functie 'imshow()' voor elke subafbeelding. Kopieer en plak het afbeeldingsbestand voor analyse in de prullenbak en voer de bestandsnaam in de volgende opdracht in. Druk op uitvoeren om het programma te starten.
   imread('bestandsnaam.tiff')
   1. Analyseer beelden door 'opening door reconstructie' gevolgd door 'closing by reconstruction' met behulp van bronfuncties⁸ om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten. Gebruik het eerste commando voor het openen door reconstructie en de tweede en derde reeks om te sluiten door reconstructie
      "imopen()"
      "imerode()"
      "imreconstruct()"
2. Binarize de gereconstrueerde beelden naar puur zwart en zuiver wit pixels met behulp van een percentiel-gebaseerd identificatiesysteem. Merk op dat cellen in dit systeem worden geconverteerd naar een zuiver witte pixelwaarde van '255', terwijl achtergrond- en externe (niet-cellulaire) objecten worden geconverteerd naar een zuiver zwarte pixelwaarde van '0'.
   1. Onderscheid cellen van de achtergrond door een percentielverschil te gebruiken met de 'maximale relevante pixel', de grootste pixelwaarde die ten minste 0,5% van een bepaalde afbeelding omvat.
   2. Analyseer en evalueer de pixelwaarden voor RAW264.7-macrofagen. Als deze waarden zich binnen 4,5% van de maximale relevante pixel bevinden, markeert u de pixel als mobiel.
      OPMERKING: Deze opdracht kan worden gegeven met behulp van een eenvoudige if-instructie.
   3. Voor afbeeldingen die bolvormige celprofielen bevatten, zoals die in figuur 2, moet u een iteratieve procedure toepassen om te corrigeren voor onjuiste binarisatie in de centra van de cellen ('eilanden' genoemd; zie hieronder), als volgt.
   4. Bepaal een eerste schatting voor de totale celdekking; 60% werd gebruikt voor deze studie. Merk op dat het aantal cellen dat in het beeld aanwezig is, afhankelijk moet zijn van de celdekking - de relatie tussen celnummer en celdekking kan daarom experimenteel worden bepaald. Bepaal met behulp van deze relatie de variabelen 'Alpha' en 'kappa'.
      OPMERKING: 'Alpha' vertegenwoordigt een 3 x 1 vector met de volgende relatieve hoogte percentielen: het hoogte percentiel waarbij cellen werden geïdentificeerd, het hoogte percentiel waarop de achtergrond werd geïdentificeerd, en het hoogte percentiel op welke eilanden-gebieden waarin intensiteit waarden significant lager waren dan celwaarden - meestal gelegen. 'Kappa' vertegenwoordigt het totale oppervlak dat wordt bedekt door cellen in de afbeelding.
   5. Voer het algoritme uit, dat (i) afbeeldingen analyseert met behulp van initiële schattingen van alfa en kappa om een deel van de eilanden te vullen, en (ii) de postanalyseceltellingen en -dekking gebruikt om kappa opnieuw te berekenen. Als de kappa-waarde binnen 10% van de eerste schatting ligt, gaat u verder met de volgende stap.
      OPMERKING: Voor afbeeldingen die RAW264.7- en NIH/3T3-cellen bevatten, bleek alfa [4.3, 5.5, 10] te zijn. Met andere woorden, een verschil van 4,3% ten opzichte van de maximale relevante pixel bepaalde het hoogtepercentiel waarop cellen werden geïdentificeerd, een verschil van 5,5% van de maximale relevante pixel bepaalde het hoogtepercentiel waarop de achtergrond werd geïdentificeerd. Een verschil van 10% ten opzichte van de maximale relevante pixel bepaalde het hoogtepercentiel waarop eilanden zich doorgaans bevonden.
3. Bepaal na binarisatie van de afbeelding automatisch het gemiddelde celgebied met behulp van het open-source cirkelzoekalgoritme, dat een Hough-transformatie uitvoert op de binarized afbeelding 12,13,14. Gebruik de volgende opdracht om een vector te verkrijgen van alle centrale locaties en stralen van cirkels in de afbeelding.
   "[centra, radii] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])"
   'A' in dit commando is de afbeelding van keuze, en [minradius, maxradius] is het bereik van radii dat het algoritme zal proberen te detecteren.
   OPMERKING: Deze procedure om het gemiddelde celoppervlak te bepalen gaat ervan uit dat de morfologie van macrofaagcellen zowel circulair als consistent was tussen cellen¹⁰. Uit experimentele gegevens blijkt dat de radii van macrofagen meestal tussen 30 en 50 pixels liggen bij 40x vergroting. Dit pixelbereik wordt gedefinieerd als het acceptabele bereik voor het cirkelzoekalgoritme. De radii kunnen aanzienlijk verschillen voor andere celtypen en vereisen bepaling met behulp van experimentele analyse.
   1. Gebruik de radii-uitgangen om het gemiddelde celoppervlak te berekenen door middel van gemiddelden. Analyseer ten minste 10 cellen om nauwkeurige gebiedsidentificatie te garanderen.
4. Bepaal het totale aantal cellen in de afbeelding met behulp van het gemiddelde celoppervlak.
   1. Doorloop de afbeeldingsmatrix en tel het totale aantal celpixels. Bepaal de totale celdekking door het aantal celpixels te delen door het totale aantal pixels in de afbeelding. Bepaal het totale aantal cellen in de afbeelding door het aantal celpixels te delen door het gemiddelde oppervlak van een cel.

3. Beeldanalyse-cocultuur met voornamelijk gebruik van het bestand "coculture_modified.m"

OPMERKING: De volgende stappen zijn uitgevoerd met MATLAB.

1. Gebruik de gebiedsgebaseerde methode om afbeeldingen te verkrijgen van cellen met relatieve hoogtevariaties. Beelduitvoer voor elke substap door gebruik te maken van de functie 'imshow()' voor elke subafbeelding. Kopieer en plak het afbeeldingsbestand voor analyse in de prullenbak en voer de bestandsnaam in de volgende opdracht in. Druk op uitvoeren om het programma te starten.
   'imread('bestandsnaam.tiff')'
   1. Analyseer beelden door 'opening door reconstructie' gevolgd door 'closing by reconstruction' met behulp van bronfuncties¹⁰ om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten. Gebruik het eerste commando voor openen door reconstructie en de tweede en derde reeks om te sluiten door reconstructie.
      "imopen ()"
      "imerode()"
      "imreconstruct()"
2. Voer een analyse uit van coculturen die RAW264.7- en NIH / 3T3-cellen bevatten met behulp van twee selectieve binarisaties, verkregen door gebruik te maken van de hoogteverschillen tussen de twee celtypen.
   1. Experimenteel een parameter 'phi' bepalen met behulp van afbeeldingen van RAW264.7- en NIH/3T3-cellen, waarbij phi het proportionele hoogteverschil tussen de twee celtypen vertegenwoordigt. Raad een initiële phi-waarde en herhaal totdat het aantal cellen en de dekking nauw overeenkomen met handmatige tellingen, specifiek voor de RAW264.7- en NIH / 3T3-cocultuur.
      OPMERKING: De waarde voor phi die in deze studies werd gebruikt, bleek 3,2 te zijn. Phi wordt gebruikt om selectief een afbeelding te filteren zodat deze alleen RAW264.7-cellen lijkt te bevatten, zoals te zien is in figuur 4C.
   2. Bepaal het aantal cellen in RAW264,7 en de totale celdekking op dezelfde manier als voor monocultuurbeelden.
3. Analyseer het door stroomgebied getransformeerde beeld opnieuw zonder de phi-parameter en detecteer zowel macrofagen als fibroblasten. Verkrijg NIH/3T3 fibroblastgegevens door selectief RAW264,7 celpixels af te trekken, verkregen met behulp van de standaard drempel- en gebiedsgebaseerde kwantificeringsmethoden die in stap 2 worden beschreven.
   1. Nadat de hele afbeelding is geanalyseerd, bepaalt u het totale aantal NIH/3T3-pixels door het totale aantal celpixels af te trekken van het aantal RAW264,7 pixels. Bereken de dekking van NIH/3T3- en RAW264.7-cellen door te delen door het aantal celpixels voor elke cellijn door het totale aantal afbeeldingspixels.

Resultaten

Analyse van niet-bolvormige RAW264.7 macrofagen werd uitgevoerd in een monocultuur setting bij 25.000 cellen/cm². Representatieve beelden werden gemaakt van de celcultuur en verwerkt in MATLAB na conversie naar 8-bit tiff in ImageJ. Algoritme-outputs gedurende het hele proces werden geregistreerd en gedocumenteerd in figuur 2 voor het representatieve beeld. In deze afbeelding telde het algoritme 226 cellen en dit aantal afbeeldingen werd geverifieerd door vergelijking met een hand...

Discussie

We ontwierpen een algemene gebiedsgerichte procedure die cellen nauwkeurig en efficiënt telde op basis van celhoogte, waardoor vlekvrije kwantificering van cellen mogelijk is, zelfs in cocultuursystemen. Kritische stappen voor deze procedure omvatten de implementatie van een systeem met relatieve intensiteit waarmee cellen konden worden gedifferentieerd. Het gebruik van een relatieve hoogteanalyse diende twee doelen: de behoefte aan externe parameters werd overbodig gemaakt, omdat relatieve parameters constant waren voor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA