Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Summary

We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.

Abstract

Kwantificering van cellen is noodzakelijk voor een breed scala aan biologische en biochemische studies. Conventionele beeldanalyse van cellen maakt meestal gebruik van fluorescentiedetectiebenaderingen, zoals immunofluorescente kleuring of transfectie met fluorescerende eiwitten of randdetectietechnieken, die vaak foutgevoelig zijn vanwege ruis en andere niet-idealiteiten in de beeldachtergrond.

We ontwierpen een nieuw algoritme dat macrofagen en fibroblasten nauwkeurig kon tellen en onderscheiden, cellen van verschillende fenotypen die vaak colocaliseren tijdens weefselregeneratie. MATLAB werd gebruikt om het algoritme te implementeren, dat verschillende celtypen onderscheidde op basis van hoogteverschillen van de achtergrond. Een primair algoritme werd ontwikkeld met behulp van een gebiedsgebaseerde methode om rekening te houden met variaties in celgrootte / structuur en zaaiomstandigheden met hoge dichtheid.

Niet-idealiteiten in celstructuren werden verantwoord met een secundair, iteratief algoritme met behulp van interne parameters zoals celdekking berekend met behulp van experimentele gegevens voor een bepaald celtype. Ten slotte werd een analyse van cocultuuromgevingen uitgevoerd met behulp van een isolatiealgoritme waarbij verschillende celtypen selectief werden uitgesloten op basis van de evaluatie van relatieve hoogteverschillen binnen het beeld. Deze aanpak bleek nauwkeurig cellen te tellen binnen een foutmarge van 5% voor monoculturele cellen en binnen een foutmarge van 10% voor gecocultureerde cellen.

Introduction

Software wordt routinematig geïmplementeerd tijdens beeldanalysetechnieken om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig, efficiënt en onbevooroordeeld zijn. Voor celgebaseerde assays is een veel voorkomend probleem de verkeerde identificatie van cellen. Beelden met onjuiste focus- en contrastinstellingen kunnen leiden tot celvervaging, waarbij de grens van individuele cellen moeilijk te identificeren is¹. De aanwezigheid van externe beeldkenmerken zoals poriën, bubbels of andere ongewenste objecten kan de telprocedures belemmeren door het telproces te vertragen en tot verkeerde identificatie te leiden. Bovendien kan het tellen van cellen be....

Protocol

1. Celkweek en beeldverwerving

1. Kweek RAW264.7 macrofagen bij 37 °C en 5% CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 1,5 g/l natriumbicarbonaat en 5 μM β-mercaptoethanol.
   1. Voor monocultuurbeeldvorming kweekt u RAW264.7-cellen met een dichtheid van 25.000 cellen/cm² in een celkweekkolf van 5 ml met 1 ml medium.
2. Kweek NIH/3T3 cellen bij 37 °C en 5% CO₂ in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine¹¹.
3. Voor beeldvorming van de cocultuur, kwee....

Results

Analyse van niet-bolvormige RAW264.7 macrofagen werd uitgevoerd in een monocultuur setting bij 25.000 cellen/cm². Representatieve beelden werden gemaakt van de celcultuur en verwerkt in MATLAB na conversie naar 8-bit tiff in ImageJ. Algoritme-outputs gedurende het hele proces werden geregistreerd en gedocumenteerd in figuur 2 voor het representatieve beeld. In deze afbeelding telde het algoritme 226 cellen en dit aantal afbeeldingen werd geverifieerd door vergelijking met een hand.......

Discussion

We ontwierpen een algemene gebiedsgerichte procedure die cellen nauwkeurig en efficiënt telde op basis van celhoogte, waardoor vlekvrije kwantificering van cellen mogelijk is, zelfs in cocultuursystemen. Kritische stappen voor deze procedure omvatten de implementatie van een systeem met relatieve intensiteit waarmee cellen konden worden gedifferentieerd. Het gebruik van een relatieve hoogteanalyse diende twee doelen: de behoefte aan externe parameters werd overbodig gemaakt, omdat relatieve parameters constant waren voor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA