Dit protocol toont een nauwkeurige en objectieve benadering om virale titraties te visualiseren met behulp van kristalviolet, door het te vergelijken met optische microscopie en immunocytochemische kleuring.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gebruik van Kristalviolet om visueel cytopathisch effectgebaseerd lezen voor virale titratie te verbeteren met behulp van TCID50-testen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Virale titratie is een belangrijke test voor virologisch onderzoek. De detectie van cytopathisch effect (CPE) via TCID50-assays en plaquevormende eenheden (PFU) -assays zijn de twee belangrijkste methoden om de titer van een virusvoorraad te berekenen en zijn vaak gebaseerd op microscopiedetectie of celkleuring voor visualisatie. In het geval van de TCID50-test is objectieve visualisatie gewoonlijk gebaseerd op immunocytochemische (ICC) kleuring van intracellulair virus om titers te berekenen in combinatie met visuele CPE-detectie via microscopie. ICC-kleuring is echter kostbaar en tijdrovend. In deze studie vergeleken we visuele CPE-observatie via microscopie, ICC-kleuring en kristalvioletkleuring om de titers van twee CPE-vormende virussen te bepalen, Influenza A-virus (IAV) van varkensoorsprong en Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-virus (PRRSV). We laten zien dat zowel kristalviolet- als ICC-kleuring nauwkeuriger zijn dan visuele CPE-detectie, met bijna identieke precisieniveaus op zowel IAV als PRRSV. Om deze reden presenteren we hier kristalvioletkleuring als een snellere en meer betaalbare manier om virale titraties te bepalen op een TCID50-test voor CPE-vormende virussen getitreerd in cellijnen.
Inleiding
Virale titratie via TCID50-test is een veelgebruikte techniek in onderzoek naar infectieziekten1. Hoewel variaties op de wiskunde achter deze methode in de loop van de tijd zijn voorgesteld1,2,3,4, zijn de momenteel toegepaste methoden voor infectiedetectie afhankelijk van visuele bevestiging door de aanwezigheid van cytopathisch effect (CPE) met behulp van microscopie5. Om CPE-visualisatie objectiever te bevestigen op TCID50-assays, is immunocytochemische (ICC) intracellulaire kleurin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Titratieprotocol
OPMERKING: Gebruik een cytopathisch virus dat hechtende cellen infecteert. Voor deze demonstratie werden Influenza A Virus (IAV) van varkensoorsprong (A/California/07/2009/(H1N1)) en Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Type 2, stam NC 1-7-4 gebruikt.
- Titreer deze virussen in 96 putplaten gedurende 7 dagen in een bioveiligheidskast in een Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratorium.
- Om deze titraties uit te voeren, zaait u 96 putplaten met de vereiste cellijn. Gebruik voor PRRSV de MA-104-cellijn en voor IAV mdck-cellijn. Gebruik voor de celkweek DMEM-medium aangevuld ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De vergelijkingen die worden gebruikt voor het wiskundig berekenen van de titer werden eerder beschreven2,3.
Kortom, voor PRRSV passen we de Karber-methode toe:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 waarbij:
In deze formule d = negatief logboek van de laatste verdunning met volledige po.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Virale titraties worden routinematig gebruikt in virologisch onderzoek, met PFU-detectie en TCID50-assays die het meest worden gebruikt1,2,3,4. Beide methoden zijn gebaseerd op de detectie van CPE in geïnfecteerde cellen, en hoewel ze visueel kunnen worden beoordeeld via microscopie, wordt een kleuring meestal toegepast om een objectiever resultaat te verkrijgen of zelfs de incubatieti.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Auteurs willen graag Dr. Frank Scholle bedanken voor zijn nuttige opmerkingen in het manuscript, Chloe Mariant voor haar hulp bij de microscopiebeelden en Teresa M. Tiedge voor haar behulpzame Engelse revisie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Helder, platte bodem |
| AEC-oplossing | Thermo Fisher | 1122 | |
| Kristalviolet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Foetaal runder serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primair influenza antilichaam | Bioss | BS-0344R | |
| Primair PRRSV antilichaam | Bioss | BS-10043R | |
| Saponine | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secundair antilichaam | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Referenties
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
