Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een labelvrij xenotransplantaatmodel voor het onderzoeken van het gedrag van menselijke stamcelsferoïden in kuikenembryo's

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63067

⸱

15 oktober 2021

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode om menselijke celsferoïden te transplanteren en te identificeren in kuikenembryo's. Dit xenotransplantaatmodel gebruikt de embryonale micro-omgeving als een bron van instructieve signalen om celmigratie, differentiatie en tropisme te testen en is vooral geschikt voor de studie van primaire en/of heterogene celpopulaties.

Samenvatting

Xenotransplantaten zijn waardevolle methoden om het gedrag van menselijke cellen in vivo te onderzoeken. In het bijzonder biedt de embryonale omgeving aanwijzingen voor celmigratie, differentiatie en morfogenese, met unieke instructieve signalen en kiemlaagidentiteit die vaak afwezig zijn in volwassen xenotransplantaatmodellen. Bovendien kunnen embryonale modellen geen onderscheid maken tussen eigen en niet-eigen weefsels, waardoor het risico op afstoting van het transplantaat en de noodzaak van immuunsuppressie van de gastheer wordt geëlimineerd. Dit artikel presenteert een methodologie voor transplantatie van sferoïden van menselijke cellen in kippenembryo's, die toegankelijk zijn, vatbaar zijn voor manipulatie en zich ontwikkelen bij 37 °C.

Spheroïden maken de selectie van een specifiek gebied van het embryo voor transplantatie mogelijk. Nadat ze zijn geënt, worden de cellen geïntegreerd in het gastheerweefsel, waardoor hun migratie, groei en differentiatie kunnen worden opgevolgd. Dit model is flexibel genoeg om het gebruik van verschillende aanhangende populaties mogelijk te maken, waaronder heterogene primaire celpopulaties en kankercellen. Om de noodzaak van voorafgaande cellabeling te omzeilen, wordt ook een protocol beschreven voor de identificatie van donorcellen door hybridisatie van mensspecifieke Alu-sondes , wat vooral belangrijk is bij het onderzoeken van heterogene celpopulaties. Bovendien kunnen DNA-sondes gemakkelijk worden aangepast om andere donorsoorten te identificeren. Dit protocol beschrijft de algemene methoden voor het bereiden van sferoïden, het enten in kippenembryo's, het fixeren en verwerken van weefsel voor paraffinesectie en ten slotte het identificeren van de menselijke cellen met behulp van DNA in situ hybridisatie. Voorgestelde controles, voorbeelden van interpretatie van resultaten en verschillende celgedragingen die kunnen worden getest, zullen worden besproken, naast de beperkingen van deze methode.

Inleiding

Xenotransplantaten zijn nuttige hulpmiddelen om het gedrag van menselijke cellen in vivo te onderzoeken. Deze modellen hebben onschatbare informatie opgeleverd voor een breed scala aan wetenschappelijke onderwerpen, zoals de biologie van menselijke stamcellen1, de observatie van cellulaire gebeurtenissen in realtime2 en het onderzoek naar tumorale angiogenese en metastase3. Daarnaast zijn verschillende aspecten van de kankerbiologie, waaronder de tumorigenese van patiëntspecifieke xenotransplantaten, bestudeerd 4,5. Elk van deze xenotransplantaatmodellen heeft zijn voor- en nadelen en daarom is elk model beter geschikt voor specifieke wetenschappelijke vragen. Kuikenembryo's zijn een populair ontwikkelingsbiologisch model omdat ze een toegankelijk amniote model zijn dat vatbaar is voor chirurgische manipulatie. Heterologe transplantaten hebben onderzoekers in staat gesteld om nauwkeurige lotkaarten te maken6 of te onderzoeken of een eigenschap celautonoom is of wordt geïnstrueerd door de omgeving 7,8. Een vergelijkbare grondgedachte maakt het mogelijk om het kuikenembryo te gebruiken als een xenotransplantaatmodel om het gedrag van menselijke cellen te bestuderen.

De embryonale omgeving orkestreert actief weefselmorfogenese met migratie- en differentiatiesignalen, evenals cel-celinteracties. In vergelijking met volwassen xenotransplantaatmodellen biedt het embryo dus een meer leerzame omgeving om het gedrag van getransplanteerde cellen te testen, bijvoorbeeld door signalen na te bootsen die aanwezig zijn in volwassen stamcelniches (bijv. BMP's, WNT's, NOTCH en SHH9). Bovendien maakt de afwezigheid van een adaptief immuunsysteem tijdens de vroege ontwikkeling het mogelijk om xenotransplantaten uit te voeren zonder het risico van een immuunrespons of afstoting van het donorweefsel10. Eerdere studies hebben voor dit doel xenotransplantaten van menselijke cellen in kippenembryo's onderzocht. Het neurogene potentieel van menselijke stamcellen is getest na injectie in de neurale buis of bloedvaten11 naast de integratie van embryonale stamcellen12 en geïnduceerde pluripotente stamcellen13 in het embryo. Menselijke melanoomcellen zijn ook bestudeerd met behulp van de embryonale omgeving van het kuiken, die verbanden onthulde tussen hun tumorigenese en het gedrag van neurale lijstcellen14, evenals de herprogrammering van de tumorcellen met de informatie van het embryo15. Dit artikel beschrijft een protocol dat vooral geschikt is voor het bestuderen van het gedrag van menselijke primaire en heterogene celpopulaties.

In de afgelopen decennia is de stromale component van diverse weefsels bestudeerd als een autologe bron van voorloper-/stamcellen en vanwege zijn proangiogene en immunoregulerende eigenschappen, voorheen bekend als "mesenchymale stamcellen"16,17,18. De eerste van deze celpopulaties die werd gekarakteriseerd, was de stromale/stamcelpopulatie van het beenmerg (BMSC's), die in vivo een osteo-, adipo- en, in mindere mate, chondrogenisch potentieel hebben 19,20. Van vet afgeleide stromale cellen (ADSC's) zijn een heterogene populatie die wordt verkregen door enzymatische vertering van de lipoaspiratie- of dermolipectomiemonsters, gevolgd door isolatie van de stromale-vasculaire fractie (SVF) en ten slotte uitbreiding in cultuur21. In cultuur worden deze cellen fenotypisch gekenmerkt door markers die worden gedeeld met andere mesenchymale populaties, zoals CD90, CD73, CD105 en CD44, unieke markers zoals CD36 en de afwezigheid van hematopoëtische (CD45) of endotheliale (CD31) markers22. Bovendien hebben ADSC's in vitro een osteo-, adipo- en chondrogenisch potentieel, en het aantal stam-/voorlopercellen in deze populatie kan worden bepaald door de fibroblastoïde kolonievormende eenheid (CFU-F)-assay22. In vivo is gemeld dat cellen met het ADSC-fenotype bestaan in stromale23 en/of perivasculaire24 compartimenten. Het wordt steeds duidelijker dat, ondanks het delen van markers na in vitro cultuur, het stromale compartiment van verschillende weefsels de intrinsieke kenmerken van een bepaald orgaan weerspiegelt, en deze celpopulaties hebben verschillende eigenschappen, afhankelijk van hun bron 17,25,26,27. Bovendien, aangezien deze cellen worden geïsoleerd op basis van hun hechting aan een celkweekschaaltje, kunnen ze zijn samengesteld uit cellen uit verschillende kiemlagen28. Het gebruik van een xenotransplantaatmethode om het differentiatiepotentieel en het tropisme van stromale cellen op een onbevooroordeelde manier te bestuderen, kan dus waardevolle informatie over deze celpopulaties opleveren om de ontwikkeling van toekomstige celtherapieën te sturen.

Het hier beschreven protocol (Figuur 1) is een xenotransplantaatmethode die gebruik maakt van de lage kosten en het gemak van manipulatie van kuikenembryo's. Het is eerder gebruikt om het gedrag van menselijke ADSC29, huidfibroblasten29, van menstruatiebloed afgeleide stromale cellen30 en glioblastoomcellen31 te bestuderen. Deze methode omvat de transplantatie van cellen als sferoïden32, die kunnen worden bereid uit elke populatie van aanhangende cellen (Figuur 2). Chirurgische ingrepen en de voorbereiding van op maat gemaakte chirurgische materialen - de microscalpels en glazen haarvaten - zullen ook worden beschreven (Figuur 3). Menselijke cellen worden gedetecteerd in histologische secties door humane specifieke Alu-sondes te hybridiseren (Figuur 4), waardoor het niet meer nodig is om de getransplanteerde cellen vooraf te labelen. De representatieve resultaten beschrijven het gedrag van humaan ADSC dat zowel in het somitische gebied op het niveau van de vleugelknop is geënt (Figuur 5, Figuur 6 en Figuur 7) als in de eerste farynxboog (Figuur 8), evenals menselijke primaire glioblastoom sferoïden geënt in het prosencephalon (Figuur 8). Celmigratie, differentiatie en interactie met embryonale weefsels van kuikens zullen worden beschreven, evenals voorgestelde assays om het celgedrag verder te onderzoeken met behulp van co-kleuring of kleuring van aangrenzende secties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle in vivo procedures die in dit onderzoek zijn gebruikt, voldeden aan alle relevante experimentele richtlijnen voor dierproeven en onderzoek, in overeenstemming met de Braziliaanse richtlijnen voor het gebruik van proefdieren (L11794). De protocollen die worden gebruikt voor het omgaan met kippenembryo's werden allemaal goedgekeurd door de Ethische Commissie voor het gebruik van dieren in wetenschappelijke experimenten (Centrum voor Gezondheidswetenschappen van de Federale Universiteit van Rio de Janeiro). Het gebruik van menselijke cellen werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Universitair Ziekenhuis Clementino Fraga Filho (nummers 043/09 en 088/04). Er werden specifieke pathogeenvrije (SPF) eieren van White Leghorn-kip (Gallus gallus) gebruikt.

1. Bereiding van celsferoïden

OPMERKING: Celsferoïden kunnen worden bereid met een breed scala aan celtypen, zolang ze maar hechten. Voor dit protocol werden menselijke vet-afgeleide stromale cellen (ADSC's) geïsoleerd zoals eerder beschreven, 21,27 zullen worden gebruikt (Figuur 2A). Cellen werden verkregen door vetweefselfragmenten of lipoaspiraten te verteren met collagenase IA gedurende 1 uur bij 37 °C onder agitatie, gevolgd door plating bij 1-2 × 104 cellen/cm2 en nachtelijke incubatie. Niet-aanhangende cellen werden weggegooid en de aanhangende cellen werden gedurende 3-6 passages geëxpandeerd. ADSC's waren homogeen voor de expressie van de oppervlakte-antigenen CD105, CD90, CD13 en CD44 en negatief voor hematopoëtische antigenen CD45, CD14, CD34, CD3 en CD1927. Hoewel de hier beschreven methode gemakkelijk kan worden uitgevoerd met minimale materialen die verder gaan dan wat routinematig wordt gebruikt voor celkweek, moet de optimale aggregatietijd en de noodzaak van gedeeltelijke dissociatie empirisch worden bepaald. Alternatieve methoden voor het bereiden van celsferoïden kunnen worden gebruikt, zoals de ophangdruppelmethode33 of met agarose beklede putjes34; Zie de discussie voor meer details. Alle procedures moeten worden uitgevoerd op een schone bank met behulp van aseptische technieken.

  1. Verwarm steriel PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing), kweekmedium en trypsineoplossing tot 37 °C voordat u de cellen manipuleert.
  2. Kweek ADSC's in DMEM met een laag glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine. Gebruik een confluente kolf van 25cm2 ADSC's voor de bereiding van twee platen sferoïden. Gooi het kweekmedium weg en was de kweekschaal driemaal met een geschikte hoeveelheid steriel PBS (5 ml PBS voor elke wasbeurt als een 2-cellige kweekkolf van 25 cm wordt gebruikt).
  3. Voeg voldoende trypsineoplossing (met 0,78 mM EDTA) toe om de cellen te bedekken (1 ml trypsineoplossing als een kweekkolf met25 cm 2 cellen wordt gebruikt) en laat de kweekkolf 5 minuten bij kamertemperatuur staan.
  4. Pineer de cellen voorzichtig op en neer om ze te dissociëren. Voeg dezelfde hoeveelheid kweekmedium met FBS toe om de trypsine te inactiveren en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.
  5. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 180 × g. Gooi het bovenstaande weg en tik op de buis om de pellet los te maken.
  6. Resuspendeer de cellen in 500 μl-2 ml kweekmedium dat geschikt is voor het celtype (zie stap 1.2).
    OPMERKING: De minimumconcentratie is 5 × 105 cellen/ml voor aanhangende cellen zoals ADSC's en fibroblasten. Een confluente kolf van 25cm2 ADSC's moet worden geresuspendeerd in 2 ml medium en worden geplateerd in 2 petrischaaltjes, elk met 1 ml. Minder aanhangende cellen, zoals glia, kunnen baat hebben bij plating bij ~2 × 106 cellen/ml in een lager volume.
  7. Breng de celsuspensie voorzichtig over naar één kant van een steriel petrischaaltje van 60 mm (ongecoat en onbehandeld, zoals die worden gebruikt voor het bereiden van agarplaten). Probeer het kweekmedium te beperken tot een zo klein mogelijk oppervlak (Figuur 1B) door de schaal over een opgevouwen, schoon gaas te zetten om het in de broedmachine schuin te houden.
  8. Incubeer de celsuspensie bij 37 °C, 5% CO2, totdat celaggregaten zijn gevormd (6-8 uur na het uitplaten van de ADSC's).
    OPMERKING: De sferoïde aggregatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype.
  9. Indien nodig (zie discussie), grote celaggregaten gedeeltelijk dissociëren door voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van 1000 μL tips. Dissocieer ADSC-sferoïden 6-8 uur na het plateren.
  10. Plaats de plaat in de broedmachine totdat de sferoïden klaar zijn om te worden verplant: rond met gedefinieerde randen en niet gemakkelijk te verspreiden (Figuur 1C,D).
    OPMERKING: ADSC-sferoïden zijn 2 dagen na gedeeltelijke dissociatie klaar.

2. Transplantatie van sferoïden in kuikenembryo's

  1. Voorbereiding
    1. Bereid kippeneieren door 15-30 eieren uit te broeden in een vochtige broedmachine bij 37,5 °C tot het gewenste Hamburger-Hamilton (HH)-stadium is bereikt35: 40-45 uur voor enten bij somieten ter hoogte van de ledemaatknoppen (HH11-12 of 13-19 somieten) of 29-33 uur voor enten in het cephalische gebied (HH8-9 of 5-8 somieten). Plaats de eieren horizontaal en trek met een potlood een lijn op de bovenkant van de eieren voordat ze worden uitgebroed (Figuur 3D).
      OPMERKING: De incubatietijden kunnen enigszins variëren, afhankelijk van de individuele couveuses. Het trekken van een lijn zorgt ervoor dat het bovenste gedeelte van het ei, waar het embryo zich bevindt, gemakkelijk kan worden geïdentificeerd als het ei vóór het experiment wordt gedraaid.
    2. Bereid scherpe naalden ("microscalpels") voor door een naainaald aan een metalen naaldhouder te bevestigen (Figuur 3B). Slijp de naald met een geoliede wetsteen totdat deze lijkt op een klein scalpel met een dunne rand (Figuur 3C). U kunt ook een scherpe wolfraamnaald voorbereiden door elektrolyse36.
    3. Bereid glazen capillairen voor met behulp van de vlam van een bunsenbrander om het dunne deel van een glazen pasteurpipet kort te smelten. Haal het gesmolten deel van de vlammen en rek het uit tot een dun capillair. Verdeel het capillair voorzichtig in twee delen door het te breken met een microtang. Bereid een dun capillair voor voor het injecteren van Oost-Indische inkt en een dik capillair voor het overbrengen van sferoïden (Figuur 3B).
      LET OP: Door de trekkracht te variëren, is het mogelijk om verschillende capillaire meters te maken. Haarvaten moeten vlak voor de operatie worden voorbereid.
    4. Bereid het werkoppervlak en andere materialen voor op het manipuleren van eieren (Figuur 3A). Steriliseer alle chirurgische materialen een nacht in een oven van 100 °C of met 70% ethanol direct voor gebruik. Verwarm steriel PBS tot 37 °C. Bevestig een tip van 200 μL (met barrière) aan de aspiratorbuis voor het injecteren van Oost-Indische inkt en het overbrengen van sferoïden.
      OPMERKING: Gebruik tips met barrières bij het overbrengen van sferoïden van menselijke cellen.
    5. Voeg vlak voor het experiment 2 druppels Oost-Indische inktstockoplossing toe aan het 30 mm petrischaaltje en meng dit met 1 ml steriel PBS. Verwijder de sferoïde plaat uit de broedmachine en plaats deze op een koelbox voor de rest van het experiment.
  2. Bereiding van elk ei
    1. Haal een ei uit de broedmachine en plaats het op een eierhouder. Maak een klein gaatje in het scherpe uiteinde van het ei (Figuur 2D) en zuig 1,5 ml eiwit op met een spuit en naald. Steek de naald loodrecht op het ei om beschadiging van de eidooier te voorkomen. Dicht het gat af met plakband. Herhaal deze stap eventueel voor alle eieren vóór het experiment en broed de rest van de eieren opnieuw uit.
    2. Knip voorzichtig met een schaar een raam aan de bovenkant van het ei open (Figuur 3D). Voeg met behulp van de pipet 1-2 druppels PBS toe aan de dooier. Verwijder indien nodig grote eiwitbelletjes (zoals te zien is in Figuur 3F) met behulp van de pipet.
    3. Bevestig het dunne capillair aan de aspiratorbuis. Vul het glas capillair gedeeltelijk met de Oost-Indische inktoplossing door aspiratie. Injecteer voldoende Oost-Indische inkt in de dooier onder het embryo totdat de embryonale structuren zichtbaar zijn (Figuur 3E,F).
    4. Tel met de stereomicroscoop het aantal somieten (Figuur 4A). Nummer de eieren afzonderlijk met een potlood (Figuur 4B).
  3. Sferoïde transplantatie
    1. Identificeer het gebied van het transplantaat: paraxiaal mesoderm ter hoogte van de vleugelknop (presomitisch mesoderm van de vermoedelijke 15etot 20e somieten37) (Figuur 3G en Figuur 5A) of vermoedelijk eerste farynxbooggebied (tussen het ectoderm en het endoderm lateraal van het achterste mesencephalon/eerste rhombomeer38) (Figuur 8A).
    2. Snijd het vitellinemembraan over het doelgebied met behulp van een microscalpel.
    3. Maak met een paar microscalpels een ondiepe snede in het gebied waar de sferoïde zal worden geïmplanteerd (Figuur 3H).
      OPMERKING: Vermijd beschadiging van het onderliggende endoderm; Anders gaat de dooier lekken (als dit gebeurt, gooi het ei dan weg).
    4. Verwijder het dunne capillair van de aspirator en vervang het door het dikke capillair. Bekijk de sferoïden onder de stereomicroscoop en kies een sferoïde die ongeveer even groot is als de somiet (Figuur 2D). Zuig deze sferoïde op in het capillair.
    5. Breng de sferoïde voorzichtig aan naast het snijgebied (Figuur 3H). Duw met behulp van de scherpe naalden de sferoïde in het snijgebied (Figuur 3I,J).
    6. Voeg 1-2 druppels PBS toe aan het embryo met behulp van de pipet om ervoor te zorgen dat de sferoïde stevig wordt ingebracht.
      OPMERKING: Als het transplantaat is losgeraakt, moet een nieuwe sferoïde worden getransplanteerd (stappen 2.3.4 en 2.3.5).
    7. Verwijder eventuele albuminelekken uit de eierschaal met tissuepapier om ervoor te zorgen dat het ei volledig kan worden afgesloten en besmetting wordt voorkomen. Sluit het raam in het ei af met plakband.
    8. Let op het getransplanteerde gebied (Figuur 4A). Breng het ei voorzichtig terug in de vochtige broedmachine bij 37,5 °C om te voorkomen dat de ingebrachte sferoïde losraakt.
    9. Incubeer het ei tot het gewenste stadium.
      OPMERKING: Wanneer het xenotransplantaat wordt uitgevoerd in somieten op het niveau van de ledemaatknoppen, zijn migratie en celdood met succes getest in embryo's van 3,5 dagen oud (HH21) en zijn celdifferentiatie en tropisme waargenomen in embryo's van 6 dagen oud (HH29) (Figuur 5A). Integratie in gastheerweefsels is ook uitgevoerd in embryo's van 8 dagen oud (HH33). Donorcellen die op het gebied van de keelholte zijn geënt, zijn bestudeerd in embryo's van 4,5 dagen oud (HH25) (figuur 8A).

3. Weefseldissectie, fixatie, verwerking en voorbereiding van histologische secties

  1. Dissectie en fixatie
    1. Bereid het fixeermiddel voor (minimaal 1 ml/embryo): ethanol 100%-formaldehyde 37%-ijsazijn in een verhouding van 6:3:1. Reinig het werkblad, een microtang, een chirurgische schaar of irisschaar en een schuimspaan. Vul een 60 mm glazen petrischaaltje met koude PBS en plaats deze onder een stereomicroscoop.
    2. Open het ei door het plakband uit te knippen.
    3. Snijd de vliezen rond het embryo af en verwijder het met de schuimspaan.
    4. Breng het embryo over naar het petrischaaltje. Als het embryo 5 dagen oud (HH26) of ouder is, onthoofd het dan onmiddellijk voordat het ex ovo wordt gemanipuleerd.
    5. Verwijder de resterende vliezen met een microtang en een schaar. Schud het monster voorzichtig in PBS om eventuele resterende dooierdruppels weg te spoelen.
    6. Als de xenotransplantatie op vleugelniveau is uitgevoerd, gooi dan de kop weg. Als cellen zijn geënt op het cephalische gebied, snijd dan de onderste helft van het lichaam af en gooi deze weg, zodat het hartgebied intact blijft.
    7. Breng elk monster over in een afzonderlijke buis van 2,0 ml met 1 ml van het fixeermiddel. Identificeer de buisjes afzonderlijk zoals eerder (Figuur 4B). Incubeer ze een nacht bij 4 °C en schud.
    8. Gebruik een pellet cellen of sferoïden (figuur 4F) als positieve controle. Centrifugeer hiervoor een celsuspensie (stap 1.5) of celsferoïden (stap 1.10) bij 180 × g gedurende 10 minuten in een tube van 1,5 ml, gooi het kweekmedium weg en voeg 1 ml fixeermiddel toe zonder de pellet te verstoren. Incubeer de buis een nacht bij 4 °C zonder te schudden en ga op dezelfde wijze te werk als bij de kuikenmonsters.
  2. Uitdroging en inbedding
    1. Dehydrateer de embryo's door opeenvolgende wasbeurten van 1 ml 70%, 80%, 90% en 100% ethanol in 1x PBS gedurende ten minste 1 uur elk met agitatie.
    2. Incubeer de monsters een nacht in 1 ml 100% ethanol bij kamertemperatuur met agitatie.
    3. Incubeer de monsters in 1 ml 100% xyleen gedurende 1 uur in een zuurkast. Herhaal dit nog twee keer.
    4. Breng de inhoud van de tube over naar het kleurblok en gooi het xyleen weg. Voeg voldoende gesmolten paraffine toe om het embryo te bedekken en bedek het kleurblok met het glazen deksel. Incubeer een nacht in een oven van 65 °C.
    5. Maak een warme plaat en een vorm voor paraffineblokken klaar om in te bedden.
      OPMERKING: Een paar uitgerekte paperclips zijn handig voor het positioneren van het embryo.
    6. Vul de vorm met gesmolten paraffine en breng het embryo erin. Plaats het embryo om een dwarsdoorsnede van de romp (Figuur 5A) of een coronale doorsnede van het hoofd (Figuur 8A) te verkrijgen.
    7. Steek een papieren naamplaatje in de paraffine, tegenover het oppervlak dat moet worden doorgesneden, om het embryo in de juiste richting te snijden (Figuur 4C).
    8. Indien gebruikt, plaats dan de inbeddingscassette over het monster. Laat het blok volledig afkoelen voordat je het uit de vorm haalt. U kunt ook het uitgeharde paraffineblok met gesmolten paraffine aan de cassette of een andere blokhouder bevestigen en weer laten afkoelen.
  3. Secties
    1. Bereid de materialen voor op secties. Verwarm een hete plaat tot 42 °C en bedek een kartonnen of piepschuimplaat met schone aluminiumfolie van ongeveer 30 cm x 20 cm. Reinig alle oppervlakken voor gebruik.
      OPMERKING: Gebruik handschoenen om besmetting met nucleasen te voorkomen, vooral als sommige secties worden gebruikt voor RNA-in-situhybridisatie . Vermijd om dezelfde reden het gebruik van een histologiebad om de paraffinesecties uit te rekken, tenzij het water en de oppervlakken vooraf grondig kunnen worden gereinigd.
    2. Snijd de overtollige paraffine af met een microtoommesje. Maak aan beide zijden een afschuining, in een trapeziumvorm, voor gemakkelijke scheiding van elk deel met behulp van een scalpelmes in een latere stap (Figuur 3A).
    3. Bevestig het blok aan de microtoom. Plaats het blok voorzichtig om ervoor te zorgen dat de linker- en rechterkant evenwijdig aan elkaar zijn. Voer een fijnere afstelling uit nadat u een paar delen van het monster hebt gesneden en onder een microscoop hebt bekeken.
    4. Wanneer het doelgebied is bereikt (de knop van de ledematen of de eerste farynxboog), snijdt u 7 μm-secties af en plaatst u de paraffinelinten over de plaat die bedekt is met aluminiumfolie. Doorsnede het hele doelgebied (Figuur 4C).
    5. Voor het voorbereiden van seriële secties bedekt u het voldoende aantal diaglazen met druppels steriel gedeïoniseerd water. Breng de afzonderlijke secties achtereenvolgens over op de dia's met behulp van borstels en een scalpel. Breng aangrenzende secties over naar verschillende dia's om seriële secties te maken (Afbeelding 4D). Bereid een reeks van 3 dia's voor 3,5 dagen oud, 4 dia's voor 4,5 dagen oud en 5 dia's voor embryo's van 6 dagen oud. Kleur aangrenzende secties met verschillende sondes, antilichamen of klassieke histologische vlekken.
      OPMERKING: Dezelfde serie kan meerdere aangrenzende dia's bevatten als een groot deel van het embryo is doorgesneden. Meerdere secties kunnen naar elke dia worden overgebracht, waarbij er wat ruimte tussen de secties wordt overgehouden om ze uit te rekken. Plaats de schuif nog niet op de warme plaat.
    6. Nadat alle secties zijn overgebracht naar de glijbanen, voegt u meer water toe totdat alle secties over een enkele waterdruppel drijven. Plaats de dia op een warm bord en laat de secties uitrekken. Verwijder de dia van de warme plaat en verwijder het water door het glaasglas voorzichtig tegen tissuepapier te kantelen.
      OPMERKING: Laat de secties de glasplaat niet rechtstreeks raken voordat ze uitrekken.
    7. Laat de glaasjes een nacht drogen in een broedstoof van 37 °C.

4. Synthese van digoxigenine-gelabelde Alu-sondes door polymerasekettingreactie (PCR)

  1. Bereid een stockoplossing van de volgende voor mens specifieke primers39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' en AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3".
  2. Bereid 50 μL van de volgende PCR-reactie40: 1x PCR-buffer, 2,0 mM MgCl2, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dATP, 0,065 mM dTTP, 0,035 mM dig-11-dUTP, 0,4 μM AluFw primers, 0,4 μM AluRev primers, 0,05 U/μL Taq-polymerase en 1 ng/μL menselijk genomisch DNA.
  3. Voer de PCR uit met de volgende instellingen: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten, gevolgd door 40 cycli van 94 °C gedurende 20 s, 60 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 20 s, gevolgd door een uiteindelijke denaturatie van 72 °C gedurende 5 min.
  4. Meet de sondeconcentratie met behulp van een spectrofotometer. Bewaar de sondes bij -20 °C.
    OPMERKING: Het PCR-product moet 200-300 bp lang na elektroforese zijn in een 2% agarosegel29.

5. Doorsnede in situ hybridisatie met Alu-sondes

  1. Dag 1: Permeabilisatie en hybridisatie
    OPMERKING: Een gesteriliseerde glazen pot met dia moet worden gebruikt voor alle stappen die op dag 1 worden uitgevoerd.
    1. Verwarm een wasbeurt PBT (0,1% tussen 20 in PBS) voor in een waterbad van 37 °C en bereid een vochtige kamer voor met 50% formamide/50% gedeïoniseerd water.
      OPMERKING: Bereken het volume van alle wasbeurten op basis van de grootte van de glazen pot. Tenzij anders vermeld, worden alle wasbeurten uitgevoerd door de objectglaasjes in de oplossing onder te dompelen.
    2. Verwijder de paraffine door drie opeenvolgende wasbeurten in xyleen, elk 5 minuten, in een zuurkast.
    3. Rehydrateer de serie door twee wasbeurten in 100% ethanol van elk 5 minuten, gevolgd door 90/70/30% ethanolwasbeurten in PBS van elk 2 minuten.
    4. Wassen in PBT (0,1% Tween 20 in PBS) drie keer gedurende 5 minuten elk.
    5. Voeg voor de permeabilisatie 2 μg/ml proteïnase K toe aan de voorverwarmde PBT, dompel de objectglaasjes onder in de oplossing en incubeer ze gedurende 14 minuten in een waterbad van 37 °C.
    6. Fixeer de secties door onderdompeling in 4% paraformaldehyde/PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Was met PBS gedurende 5 min.
    8. Nadat u het overtollige PBS van elk objectglaasje hebt gewist, bedek u de secties met 300 μL hybridisatiebuffer (50% gedeïoniseerde formamide, 4x SSC pH 5,0, 1x Denhardt's oplossing, 5% dextraansulfaat, 100 μg/ml zalmsperma-DNA) (Tabel 1). Incubeer gedurende 1 uur bij 42 °C in de formamidekamer.
    9. Bereid een oplossing van 0.2 ng/ml Alu-sonde in hybridisatiebuffer. Kantel het schuifje om de hybridisatiebuffer te verwijderen en voeg 120 μL van de Alu-sondeoplossing toe aan de secties. Dek af met een glazen dekglaasje en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
      OPMERKING: Parafilm mag in deze stap niet worden gebruikt om de dia's af te dekken, omdat deze smelt bij temperaturen boven 70 °C.
    10. Verwarm de dia's op een hete plaat op 95 °C gedurende 5 min.
      OPMERKING: Adem de formamidedampen niet in.
    11. Incubeer de objectglaasjes een nacht bij 42 °C in de formamidekamer.
  2. Dag 2: Stringentie wasbeurten en immunohistochemie
    1. Bereid 20x SSC-buffer voor (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitraat, pH 7,5) (Tabel 1). Verwarm twee wasbeurten 0,1x zoutoplossing natriumcitraat (SSC) buffer, pH 7,5, voor op 42 °C.
    2. Vul een glazen schuifpot met 2x SSC-buffer, pH 7,5. Plaats de glaasjes voorzichtig in de oplossing en wacht tot de dekglaasjes loskomen. Verwijder de dekglaasjes met een tang en incubeer de glaasjes in 2x SSC-buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was de objectglaasjes opnieuw met 2x SSC-buffer, pH 7,5, gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
    4. Was de objectglaasjes twee keer met 0,1x SSC-buffer, pH 7,5, bij 42 °C gedurende 5 minuten elk.
    5. Was de objectglaasjes twee keer met MABT (maleïnezuurbuffer met Tween; 0,1 M maleïnezuur, 0,15 M natriumchloride, 0,1% Tween 20, pH 7,5) (Tabel 1) gedurende 30 minuten elk bij kamertemperatuur.
    6. Veeg het overtollige buffermiddel van elk glaasje en bedek de secties met 400 μL blokkeeroplossing (10% geïnactiveerd normaal geitenserum, 2% blokkerend reagens in MABT). Incubeer gedurende 2 uur in een vochtige kamer (bereid met gedeïoniseerd water) bij kamertemperatuur.
    7. Kantel de objectglaasjes om de vloeistof te verwijderen en voeg 150 μL Fab anti-DIG-fragmenten toe die zijn geconjugeerd aan alkalische fosfatase in een verdunning van 1:2.000 in een blokkerende oplossing. Dek af met een glazen dekglaasje of parafilm en incubeer gedurende 16 uur in de vochtige kamer bij 4 °C.
  3. Dag 3: Kleurontwikkeling
    1. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes of parafilm in een pot met MABT (zoals in stap 5.2.2) en incubeer de glaasjes 30 minuten in MABT bij kamertemperatuur.
    2. Was nog drie keer met MABT gedurende 30 minuten elk.
    3. Wassen met MAB (maleïnezuurbuffer; 0,1 M maleïnezuur, 0,15 M natriumchloride, pH 7,5) (Tabel 1) gedurende 30 min.
    4. Was twee keer met NTM (NaCl-Tris-MgCl2 buffer; 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM natriumchloride, 50 mM magnesiumchloride) (Tabel 1) gedurende elk 10 minuten.
    5. Voeg de kleuroplossing (0,45 μl/ml 4-nitroblauw tetrazoliumchloride, 3,5 μl/ml 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat p-toluïdine in NTM) (tabel 1) toe aan de kleurpot en dompel de objectglaasjes onder in de oplossing. Dek de pot af met aluminiumfolie en laat de kleur een nacht ontwikkelen bij 37 °C.
  4. Dag 4: Tegenbeitsen en monteren
    1. Was de dia's drie keer met PBS op kamertemperatuur gedurende elk 10 minuten.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de kleuroplossing op de juiste manier wordt weggegooid als halogeenafval.
    2. Monteer de dia's zoals ze zijn door druppels van een waterig montagemedium toe te voegen en de secties af te dekken met een glazen dekglaasje. U kunt ook overgaan op nucleair snel rood of Alcian blauw tegenkleuring.
    3. Veeg overtollig PBS weg en voeg 500 μL van een nucleaire contrakleuringsoplossing van 0,1% nucleair snel rood41 (Tabel 1) toe over de secties en incubeer de objectglaasjes gedurende 10 minuten in een vochtige kamer. Tip om overtollig nucleair snel rood te verwijderen en verder te gaan met uitdroging (stap 5.4.5).
    4. Dompel de secties onder in 0,5% Alcian blauwe oplossing (kraakbeen contrakleuring)42 gedurende 10 min; Spoel af in gedestilleerd water en incubeer gedurende 10 minuten in 1% fosfomolydinezuur. Spoel opnieuw af met water en ga verder met uitdrogen.
      OPMERKING: Als de fosfomolybdische zuurwassing wordt weggelaten, wordt Alcian-blauw een nucleaire tegenkleuring.
    5. Dehydrateer in 70/95/100/100% ethanol gedurende 5 minuten elk.
    6. Was met xyleen driemaal gedurende 5 minuten, telkens in een zuurkast.
    7. Monteer met een montagemedium op basis van xyleen en glazen dekglaasjes.
    8. Laat de schuiven minstens 16 uur drogen in een zuurkast.

6. Beeldacquisitie

  1. Nadat de gemonteerde objectglaasjes grondig zijn gedroogd, onderzoekt u alle secties op de aanwezigheid van geënte menselijke cellen met behulp van een rechtopstaande helderveldmicroscoop (Figuur 4E). Zoek naar blauw-paarse Alu-positieve cellen (Figuur 4F,G) en markeer de secties met Alu-positieve cellen met een markeerstift (Figuur 4E).
    OPMERKING: Door de secties te markeren met Alu-positieve cellen, wordt het gemakkelijker om ze te vinden tijdens het fotograferen en het vergelijken van aangrenzende dia's die gekleurd zijn met andere markeringen.
  2. Zorg ervoor dat u secties met het xenotransplantaat fotografeert in dezelfde volgorde als hun plaatsing op de dia (antero-posterieure richting). Geef elke foto een naam met alle relevante informatie, zoals [datum van het xenotransplantaat]_[celtype]_[embryonale leeftijd]_[sondetype]_[sectienummer]_001. Voeg metagegevensbestanden toe om de schaalbalk later toe te voegen.
  3. Als andere objectglaasjes uit dezelfde serie zijn gekleurd met een andere marker, bijvoorbeeld RNA in situ hybridisatie of immunohistochemie, fotografeer en benoem dan aangrenzende secties (Figuur 6) op dezelfde manier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Identificatie van Alu-positieve ADSC's in histologische secties
Alu-sequenties zijn repetitieve elementen die ~10% van het menselijk genoom uitmaken en zijn dus uitstekende doelen voor het identificeren van menselijke cellen op een soortspecifieke manier43. In situ hybridisatie met DNA-sondes kan worden gebruikt om genomische elementen op histologische secties te identificeren, incl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol (Figuur 1) biedt een haalbare optie voor het screenen van het gedrag van primaire populaties van menselijke cellen in vivo, met behulp van kuikenembryo's als model. Dit artikel beschrijft de vorming van celsferoïden (Figuur 2), transplantatie van de sferoïde in het kuikenembryo (Figuur 3), verwerking van specimens en in situ hybridisatie (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Universidade Federal de Rio de Janeiro (UFRJ voor J.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq voor J.B.) en Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ voor J.B.). Met dank aan T. Jaffredo (CNRS, Parijs, Frankrijk) voor de Runx2 (Cbfa1) sonde. Het HNK1-antilichaam werd verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242 USA. We danken V. Moura-Neto voor het verlenen van toegang tot de microtoom en R. Lent voor het verlenen van toegang tot de microscoop. We danken E. Steck voor de hulp bij het synthetiseren van Alu-sondes .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dieren
Gallus gallus eierenGranja TolomeiSPF-freeWitte leghorn kip
Reagentia
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw primersSigma-aldrichOLIGO5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’
AluRev primersSigma-aldrichOLIGO5’-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3’
AluminiumsulfaatSigma-aldrich368458Voor Nuclear fast red oplossing voorbereiding
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentenRoche11093274910Antibody Registry ID: AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 antibody (HNK1, CD57)Developmental Studies Hybridoma Bank3H5Antibody Registry ID: AB_2314644
Anti-muis, geit IgM-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2973Antibody Registry ID: AB_650513
Anti-muis, geit IgG (H+L)-HRPNovexG-21040Antibody Registry ID: AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 antibodyDakoM085129Antibody Registry ID: AB_2811108
AquatexMerck1085620050Waterige montage-agent
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat p-toluidine zout (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Blocking ReagentRoche11096176001
Citrique zuurVETEC238Voor SSC buffer voorbereiding
Collageenase type IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setRoche11969064001
Denhardt oplossing 50XInvitrogen750018Voor hybridisatie buffer voorbereiding
Dextran sulfaat natriumzoutThermo Scientific15885118Voor hybridisatie buffer voorbereiding
DIG RNA Labeling MixRoche11277073910Bevat Dig-11-dUTP
DMEM laag-glucoseSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-aldrich227056Voor NBT en BCIP oplossing voorbereiding
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma-aldrichE6758Voor trypsin oplossing voorbereiding
Entellan newMerck107961Niet-waterige montage medium
EthanolProquímiosN/A
Foetaal runderserumThermoFisher12657029Inactiveren bij 56 °C voor gebruik
Formaldehyde 37% oplossingProquímiosN/A
FormamideVetecV900064
IJsazijnzuurProquímiosN/A
India inktPelikan221143
L-glutamine oplossing (200 mM)Gibco25030-149
MagnesiumchlorideMerck8147330100Voor NTM buffer voorbereiding
MaleïnezuurSigma-aldrichM0375-500GVoor MAB buffer voorbereiding
MethanolProquímios
Normaal geitenserumSigma-aldrichNS02LInactiveren bij 56 °C voor gebruik
4-Nitro blauw tetrazolinium chloride (NBT)Roche11585029001
Nuclear fast redSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penicilline G natriumzoutSigma-aldrichP3032
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Sigma-aldrichP3813
FosfomolybdenzuurMerck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
Zalmbuit DNAInvitrogen15632011Voor hybridisatie buffer voorbereiding
NatriumchlorideSigma-aldrichS9888Voor SSC, MAB en NTM buffer voorbereiding
Streptomycine sulfaatSigma-aldrichS6501
Taq Polymerase kitCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsineSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleenProquímiosN/A
Microscoop en apparatuur
Axioplan rechtopstaande microscoopCarl Zeiss MicroscopyN/A
Axiovision softwareCarl Zeiss MicroscopyN/A
Cel incubatorThermoForma3110
Ei incubator- 50 eierenGP
Gooseneck lampBiocamN/AVoor ei manipulatie
Fiji software; Cell Counter pluginImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Laminaire flow kapTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Roterende microtoomLeica BiosystemsRM2125 RTSVoor secties
StereomicroscoopLabomedLuxeo 4DVoor ei manipulatie
Sterisatie ovenREALIS7261690Voor sterielisatie van chirurgisch materiaal
Consumables

Referenties

  1. Herbert, K. E., Lévesque, J. P., Haylock, D. N., Prince, M. The use of experimental murine models to assess novel agents of hematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 14 (6), 603-621 (2008).
  2. Parada-Kusz, M., et al. Generation of mouse-zebrafish hematopoietic tissue chimeric embryos for hematopoiesis and host-pathogen interaction studies. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (11), (2018).
  3. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  4. Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicological Research. 30 (1), 1-5 (2014).
  5. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nature Genetics. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  6. le Douarin, N., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
  7. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  8. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  9. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  10. Douarin, N., et al. le et al. Evidence for a thymus-dependent form of tolerance that is not based on elimination or anergy of reactive T cells. Immunological Reviews. 149 (1), 35-53 (1996).
  11. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e2071(2010).
  12. Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells and derivatives to the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 584, 367-385 (2010).
  13. Akhlaghpour, A., et al. Chicken interspecies chimerism unveils human pluripotency. Stem Cell Reports. 16 (1), 39-55 (2021).
  14. Kulesa, P. M., Morrison, J. A., Bailey, C. M. The neural crest and cancer: A developmental spin on melanoma. Cells Tissues Organs. 198 (1), 12-21 (2013).
  15. Hendrix, M. J. C., et al. Reprogramming metastatic tumour cells with embryonic microenvironments. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 246-255 (2007).
  16. Singer, N. G., Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of inflammation. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6, 457-478 (2011).
  17. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  18. Griffin, M. D., et al. Concise review: Adult mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory diseases: How well are we joining the dots. Stem Cells. 31 (10), 2033-2041 (2013).
  19. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposium. 136, 42-60 (1988).
  20. Bianco, P., Robey, P. G., Saggio, I., Riminucci, M. "Mesenchymal" stem cells in human bone marrow (skeletal stem cells): A critical discussion of their nature, identity, and significance in incurable skeletal disease. Human Gene Therapy. 21 (9), 1057-1066 (2010).
  21. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  22. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  23. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: Localization, morphology and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  24. Zannettino, A. C. W., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214 (2), 413-421 (2008).
  25. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  27. Baptista, L. S., et al. marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: How close are they. Journal of Stem Cells. , 73-90 (2007).
  28. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS ONE. 8 (12), 84206(2013).
  29. Cordeiro, I. R., et al. Chick embryo xenograft model reveals a novel perineural niche for human adipose-derived stromal cells. Biology Open. 4 (9), 1180-1193 (2015).
  30. Santos, R. deA., et al. Intrinsic angiogenic potential and migration capacity of human mesenchymal stromal cells derived from menstrual blood and bone marrow. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 1-23 (2020).
  31. Menezes, A., et al. Live cell imaging supports a key role for histone deacetylase as a molecular target during glioblastoma malignancy downgrade through tumor competence modulation. Journal of Oncology. 2019, 9043675(2019).
  32. Brito, J. M., Teillet, M. A., le Douarin, N. M. Induction of mirror-image supernumerary jaws in chicken mandibular mesenchyme by Sonic Hedgehog-producing cells. Development. 135 (13), 2311-2319 (2008).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments JoVE. (51), e2720(2011).
  34. de Barros, A. P. D. N., et al. Osteoblasts and bone marrow mesenchymal stromal cells control hematopoietic stem cell migration and proliferation in 3D in vitro model. PLoS One. 5 (2), 9093(2010).
  35. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1951).
  36. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  37. Tickle, C. How the embryo makes a limb: Determination, polarity and identity. Journal of Anatomy. 227 (4), 418-430 (2015).
  38. Couly, G., Grapin-Botton, A., Coltey, P., le Douarin, N. M. The regeneration of the cephalic neural crest, a problem revisited: The regenerating cells originate from the contralateral or from the anterior and posterior neural fold. Development. 122 (11), 3393-3407 (1996).
  39. Walker, J. A., et al. Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 315 (1), 122-128 (2003).
  40. Steck, E., Burkhardt, M., Ehrlich, H., Richter, W. Discrimination between cells of murine and human origin in xenotransplants by species specific genomic in situ hybridization. Xenotransplantation. 17 (2), 153-159 (2010).
  41. Sams, A., Davies, F. M. R. Commercial varieties of nuclear fast red. Stain Technology. 42 (6), 269-276 (1967).
  42. Lison, L. Alcian blue 8 g with chlorantine fast red 5 B. A technic for selective staining of mucopolysaccharides. Biotechnic and Histochemistry. 29 (3), 131-138 (1954).
  43. Cordaux, R., Batzer, M. A. The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 691-703 (2009).
  44. Brüstle, O., et al. Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats. Nature Biotechnology. 16 (11), 1040-1044 (1998).
  45. Warncke, B., Valtink, M., Weichel, J., Engelmann, K., Schäfer, H. Experimental rat model for therapeutic retinal pigment epithelium transplantation - Unequivocal microscopic identification of human donor cells by in situ hybridisation of human-specific Alu sequences. Virchows Archiv. 444 (1), 74-81 (2004).
  46. Kasten, P., et al. Ectopic bone formation associated with mesenchymal stem cells in a resorbable calcium deficient hydroxyapatite carrier. Biomaterials. 26 (29), 5879-5889 (2005).
  47. Baptista, L., et al. Adipose tissue of control and ex-obese patients exhibit differences in blood vessel content and resident mesenchymal stem cell population. Obesity Surgery. 19 (9), 1304-1312 (2009).
  48. Christ, B., Huang, R., Scaal, M. Formation and differentiation of the avian sclerotome. Anatomy and Embryology. 208 (5), 333-350 (2004).
  49. Scaal, M., Christ, B. Formation and differentiation of the avian dermomyotome. Anatomy and Embryology. 208 (6), 411-424 (2004).
  50. Tucker, G. C., Delarue, M., Zada, S., Boucaut, J. C., Thiery, J. P. Expression of the HNK-1/NC-1 epitope in early vertebrate neurogenesis. Cell and Tissue Research. 251 (2), 457-465 (1988).
  51. Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G., le Douarin, N. M. Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and forebrain development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4843-4847 (2004).
  52. Charrier, J. B., Lapointe, F., le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development. 129 (20), 4785-4796 (2002).
  53. Kordes, U., Cheng, Y. C., Scotting, P. J. Sox group e gene expression distinguishes different types and maturational stages of glial cells in developing chick and mouse. Developmental Brain Research. 157 (2), 209-213 (2005).
  54. Stricker, S., Fundele, R., Vortkamp, A., Mundlos, S. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. Developmental Biology. 245 (1), 95-108 (2002).
  55. Grottkau, B. E., Lin, Y. Osteogenesis of adipose-derived stem cells. Bone Research. 1 (2), 133(2013).
  56. Culling, C. F. A. Handbook of histopathological and histochemical techniques. Including museum techniques. , Elsevier. (1974).
  57. Francis, P. H., Richardson, M. K., Brickell, P. M., Tickle, C. Bone morphogenetic proteins and a signalling pathway that controls patterning in the developing chick limb. Development. 120 (1), 209-218 (1994).
  58. Huber, K., et al. Persistent expression of BMP-4 in embryonic chick adrenal cortical cells and its role in chromaffin cell development. Neural Development. 3, 28(2008).
  59. Pouget, C., Gautier, R., Teillet, M. A., Jaffredo, T. Somite-derived cells replace ventral aortic hemangioblasts and provide aortic smooth muscle cells of the trunk. Development. 133 (6), 1013-1022 (2006).
  60. Kirby, M. L., Hutson, M. R. Factors controlling cardiac neural crest cell migration. Cell Adhesion and Migration. 4 (4), 609-621 (2010).
  61. Isern, J., et al. The neural crest is a source of mesenchymal stem cells with specialized hematopoietic stem cell niche function. eLife. 3, 03696(2014).
  62. Yamazaki, S., et al. Nonmyelinating schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell. 147 (5), 1146-1158 (2011).
  63. Carr, M. J., et al. Mesenchymal precursor cells in adult nerves contribute to mammalian tissue repair and regeneration. Cell Stem Cell. 24 (2), 240-256 (2019).
  64. Walker, J. A., et al. Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification. Analytical Biochemistry. 316 (2), 259-269 (2003).
  65. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  66. Yong, K. S. M., Her, Z., Chen, Q. Humanized mice as unique tools for human-specific studies. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 66 (4), 245-266 (2018).
  67. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025(2020).
  68. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  69. Puente, B. N., et al. The oxygen-rich postnatal environment induces cardiomyocyte cell-cycle arrest through DNA damage response. Cell. 157 (3), 565-579 (2014).
  70. Colton, C. K. Implantable biohybrid artificial organs. Cell Transplantation. 4 (4), 415-436 (1995).
  71. Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Menselijke stamcellencelmigratieceldifferentiatiein situ hybridisatieAlu sondesparaffine coupesembryonale transplantatie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.