Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63073

⸱

20 oktober 2021

 ,  ,  , 
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Samenvatting

Mitochondriale redox homeostase is belangrijk voor neuronale levensvatbaarheid en functie. Hoewel mitochondriën verschillende redoxsystemen bevatten, wordt de zeer overvloedige thiol-disulfide redoxbuffer glutathion beschouwd als een centrale speler in de antioxidantafweer. Daarom levert het meten van het mitochondriale glutathion redoxpotentiaal nuttige informatie op over mitochondriale redoxstatus en oxidatieve stress. Glutaredoxine1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is een genetisch gecodeerde, op groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde ratiometrische indicator van de glutathion redoxpotentiaal die twee redoxtoestandsgevoelige excitatiepieken heeft bij 400 nm en 490 nm met een enkele emissiepiek bij 510 nm. Dit artikel beschrijft hoe confocale levende microscopie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen kan worden uitgevoerd. Het beschrijft hoe steady-state mitochondriaal glutathion redoxpotentieel kan worden beoordeeld (bijvoorbeeld om ziektetoestanden of langetermijnbehandelingen te vergelijken) en hoe redoxveranderingen bij acute behandelingen kunnen worden gemeten (met behulp van het excitotoxische medicijn N-methyl-D-aspartaat (NMDA) als voorbeeld). Daarnaast presenteert het artikel co-imaging van Grx1-roGFP2 en de mitochondriale membraanpotentiaalindicator, tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE), om aan te tonen hoe Grx1-roGPF2 kan worden gemultiplext met aanvullende indicatoren voor multiparametrische analyses. Dit protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van hoe (i) confocale laserscanmicroscoopinstellingen kunnen worden geoptimaliseerd, (ii) geneesmiddelen voor stimulatie kunnen worden toegepast gevolgd door sensorkalibratie met diamide en dithiothreitol, en (iii) gegevens kunnen worden geanalyseerd met ImageJ / FIJI.

Inleiding

Verschillende belangrijke mitochondriale enzymen en signaalmoleculen zijn onderhevig aan thiol redox regulatie1. Bovendien zijn mitochondriën een belangrijke cellulaire bron van reactieve zuurstofsoorten en zijn ze selectief kwetsbaar voor oxidatieve schade2. Dienovereenkomstig heeft het mitochondriale redoxpotentiaal direct invloed op bio-energetica, celsignalering, mitochondriale functie en uiteindelijk de levensvatbaarheid van cellen3,4. De mitochondriale matrix bevat grote hoeveelheden (1-15 mM) van de thiol-disulfide redoxbuffer glutathion (GSH) om de redoxhomeostase te behouden en de antioxidantafweer te versterken5,6. GSH kan covalent worden gehecht aan doeleiwitten (S-glutathionylatie) om hun redoxstatus en -activiteit te beheersen en wordt gebruikt door een reeks ontgiftende enzymen die geoxideerde eiwitten verminderen. Daarom is de mitochondriale glutathion redoxpotentiaal een zeer informatieve parameter bij het bestuderen van mitochondriale functie en pathofysiologie.

roGFP2 is een variant van GFP die redoxgevoelig is gemaakt door de toevoeging van twee aan het oppervlak blootgestelde cysteines die een kunstmatig dithiol-disulfidepaar vormen7,8. Het heeft een enkele emissiepiek bij ~ 510 nm en twee excitatiepieken bij ~ 400 nm en 490 nm. Belangrijk is dat de relatieve amplitudes van de twee excitatiepieken afhankelijk zijn van de redoxtoestand van roGFP2 (figuur 1), waardoor dit eiwit een ratiometrische sensor is. In de Grx1-roGFP2-sensor is humaan glutaredoxine-1 (Grx1) gefuseerd met het N-eindpunt van roGFP29,10. Covalente hechting van het Grx1-enzym aan roGFP2 biedt twee belangrijke verbeteringen van de sensor: het maakt de sensorrespons specifiek voor het GSH / GSSG glutathion redoxpaar (figuur 1) en het versnelt de evenwichtsbalans tussen GSSG en roGFP2 met een factor van ten minste 100.0009. Daarom maakt Grx1-roGFP2 specifieke en dynamische beeldvorming van het cellulaire glutathion redoxpotentiaal mogelijk.

Grx1-roGFP2-beeldvorming kan worden uitgevoerd op een breed scala aan microscopen, waaronder widefield fluorescentiemicroscopen, confocale microscopen voor draaiende schijven en confocale microscopen voor laserscanning. Expressie van de sensor in primaire neuronen kan worden bereikt door verschillende methoden, waaronder lipofectie11, DNA / calciumfosfaatcoprecipitatie12, virusgemedieerde genoverdracht of gebruik van transgene dieren als celbron (figuur 2). Pseudotypeerde recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAV) met een 1:1 verhouding van AAV1 en AAV2 capsid eiwitten 13,14 werden gebruikt voor de experimenten in dit artikel. Met deze vector wordt de maximale sensorexpressie meestal 4-5 dagen na infectie bereikt en blijft deze gedurende ten minste twee weken stabiel. We hebben Grx1-roGFP2 met succes gebruikt in primaire hippocampus- en corticale neuronen van muizen en ratten.

In dit artikel wordt rAAV-gemedieerde expressie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen van ratten gebruikt om de basale mitochondriale glutathion redoxtoestand en de acute verstoring ervan te beoordelen. Er is een protocol voor confocale live beeldvorming met gedetailleerde instructies voor het optimaliseren van (i) het optimaliseren van confocale microscoopinstellingen voor laserscannen, (ii) het uitvoeren van een live beeldvormingsexperiment en (iii) het analyseren van gegevens met FIJI.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven voldeden aan nationale en institutionele richtlijnen, waaronder richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement van de Raad, en hadden volledige ethische goedkeuring van het ministerie van Binnenlandse Zaken (Bureau voor Dierenwelzijn van de Universiteit van Heidelberg en Regierungspraesidium Karlsruhe, vergunningen T14/21 en T13/21). Primaire hippocampus- en corticale neuronen werden bereid uit pasgeboren muizen- of rattenjongen volgens standaardprocedures en werden gedurende 12-14 dagen gehandhaafd zoals eerder beschreven13.

1. Bereiding van oplossingen

  1. Stockoplossingen voor beeldvormingsbuffer
    1. Bereid elke stamoplossing volgens tabel 1 en bewaar ze bij 4 °C. Voor langdurige opslag (>3 maanden) bewaart u aliquots bij -20 °C.
BestanddeelMWConcentratie (M)Bedrag (g)Volume (ml)
NaCl58.44514.6150
Kcl74.5531.125
MgCl2· 6h2o203.31.925
CaCl2·2H2O147.0111.4710
Glycine75.070.10.37550
Sacharose342.31.525.6750
Natriumpyruvaat110.040.10.5550
Hepes238.3111.950
Glucose180.152.545100

Tabel 1: Stockoplossingen voor beeldvormingsbuffer.

  1. Voorraadoplossingen van geneesmiddelen en kleurstoffen
    1. Los diamide (DA; gebruikt voor kalibratie van maximale 405:488-verhouding) op in water om een stamoplossing van 0,5 M te verkrijgen (bijv. 1 g in 11,615 ml water). Aliquot en bewaren bij -20 °C.
    2. Los dithiothreitol (DTT; gebruikt voor kalibratie van minimaal 405:488 verhouding) op in water om een 1 M stamoplossing te verkrijgen (bijv. 5 g in 32,425 ml water). Aliquot en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.
    3. Los N-methyl-D-aspartaat (NMDA; gebruikt om excitotoxiciteit en mitochondriale oxidatie te induceren) op in water om een voorraadoplossing van 10 mM te verkrijgen (bijv. 25 mg in 16,991 ml water). Bewaar de aliquots bij -20 °C. Voor langdurige opslag (>6 maanden) bewaart u de aliquots op -80 °C.
    4. Tetramethylrhodamine ethylesterperchloraat (TMRE; een indicator met kleine moleculen van het mitochondriale membraanpotentiaal)
      1. Los TMRE poeder op in methanol om een voorraad van 20 mM te verkrijgen (bijv. 25 mg in 2,427 ml methanol).
      2. Verdun de 20 mM-voorraad 1:1.000 in methanol om een voorraad van 20 μM te verkrijgen.
      3. Vul de 20 mM en 20 μM voorraadoplossingen, sluit af met parafilm en bewaar beschermd tegen licht bij -20 °C.
        OPMERKING: Beide voorraadoplossingen zijn meerdere jaren stabiel. Gebruik de 1.000x stockoplossing (20 μM) voor experimenten.
  2. Beeldbuffer
    1. Bereid 100 ml beeldbuffer voor door alle componenten uit tabel 2 toe te voegen aan 80 ml steriel water in een maatcilinder. Breng het volume op 100 ml met steriel water. Meng door de meetcilinder voorzichtig te schudden totdat de oplossing homogeen lijkt.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een osmometer te gebruiken om de osmolariteit van de buffer te controleren. Het moet zo dicht mogelijk bij het groeimedium van de cellen zijn. Hier is dit 315 mOsmol / L. Verhoog of verlaag de sucroseconcentratie indien nodig om de osmolariteit van de beeldvormingsbuffer en het groeimedium te evenaren.
    2. Stel de pH in op 7,4. Maak aliquots en bewaar ze maximaal twee weken op 4 °C. Bewaar de aliquots voor langdurige opslag op -20 °C. Laat de beeldbuffer voor gebruik op kamertemperatuur komen.
BestanddeelVoorraadoplossing (M)Eindconcentratie (mM)Volume (ml)
NaCl51142.3
Kcl35.290.176
MgCl2 1.910.053
CaCl2 120.2
Glycine0.10.0050.005
Sacharose1.5523.5
Natriumpyruvaat0.10.50.5
Hepes1101
Glucose2.550.2

Tabel 2: Samenstelling van de beeldvormingsbuffer. De aangegeven volumes worden gebruikt voor de bereiding van 100 ml beeldbuffer.

  1. Oplossingen voor stimulatie en kalibratie
    OPMERKING: Bereid altijd verse stimulatieoplossingen voor door voorraadoplossingen van geïndiceerde geneesmiddelen vlak voor het experiment aan de beeldvormingsbuffer toe te voegen. Oplossingen voor stimulatie en kalibratie zullen tijdens een experiment achtereenvolgens aan de beeldvormingskamer worden toegevoegd (zie rubrieken 3-5). Afhankelijk van het type experiment zijn verschillende oplossingen nodig om dezelfde eindconcentratie te bereiken in het respectieve eindvolume in de beeldvormingskamer.
    1. Bereid 3x NMDA-oplossing (90 μM; eindconcentratie in de kamer: 30 μM) door 63 μL van een NMDA-voorraad van 10 mM toe te voegen aan 6,937 ml beeldbuffer. Voeg 500 μL van de resulterende oplossing toe aan de kamer (eindvolume: 1,5 ml).
    2. Bereid 2x DA-oplossing voor stap 3 en 4 (1 mM; eindconcentratie in de kamer: 0,5 mM) door 14 μL van een 0,5 M DA-voorraad toe te voegen aan 6,986 ml beeldbuffer. Voeg 1 ml toe aan de kamer (eindvolume: 2 ml).
    3. Bereid 4x DA-oplossing voor stap 5 (2 mM; eindconcentratie in de kamer: 0,5 mM) door 28 μL van een 0,5 M DA-voorraad toe te voegen aan 6,972 ml beeldbuffer. Voeg 500 μL toe aan de kamer (eindvolume: 2 ml).
    4. Bereid 1x DTT-oplossing (5 mM; eindconcentratie in de kamer: 5 mM) door 45 μL 1 M DTT-voorraad toe te voegen aan 8955 μL beeldbuffer. Voeg 1 ml van deze oplossing toe aan de kamer na het aanzuigen van de beeldvormingsbuffer (eindvolume: 1 ml).

2. Laden van cellen met TMRE

OPMERKING: In dit protocol wordt TMRE gebruikt in niet-dempingsmodus15 bij een eindconcentratie van 20 nM. Over het algemeen moet de laagst mogelijke concentratie TMRE worden gebruikt die nog steeds voldoende signaalintensiteit biedt op de microscoop van keuze. Door ongelijke verdamping kan het volume van medium in verschillende putten verschillen in primaire culturen op lange termijn. Om een consistente TMRE-concentratie in alle putten te garanderen, moet u TMRE niet rechtstreeks aan de putten toevoegen. Vervang in plaats daarvan het medium in elke put door dezelfde hoeveelheid TMRE-bevattend medium. Het onderstaande protocol is ontworpen voor primaire neuronen in 24-well platen met ~ 1 ml medium per put.

  1. Werk in een weefselkweek laminaire stroomkap, verzamel 500 μL medium uit elke put in een enkele conische buis.
  2. Voeg per put 0,5 μL van 20 μM TMRE-voorraad toe aan de conische buis (bijv. 12 μL voor 24 putten).
  3. Zuig het resterende medium voorzichtig op uit de eerste put en vervang het door 500 μL TMRE-bevattend medium. Ga verder, goed-bij-goed, met de resterende putten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen niet uitdrogen en dat u de cellen niet verstoort.
  4. Breng de cellen terug naar de incubator en wacht minstens 60 minuten op kleurstofevenwicht.
    OPMERKING: De laadtijd kan worden verlengd tot enkele uren zonder nadelige effecten.
  5. Om consistente TMRE-concentraties en evenwichtsoefeningen tijdens het beeldvormingsexperiment te garanderen, moet u een eindconcentratie van 20 nM TMRE opnemen in de beeldvormingsbuffer en alle stimulatieoplossingen.

3. Optimalisatie van het scannen van confocale microscoopinstellingen

OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het beste compromis te vinden tussen beeldkwaliteit en levensvatbaarheid van cellen tijdens live imaging. In dit gedeelte wordt de optimalisatie van instellingen voor roGFP-beeldvorming beschreven. Als multiparametrische beeldvorming wordt uitgevoerd, moet een vergelijkbare optimalisatie, inclusief het controleren op een stabiele uitgangswaarde zonder tekenen van bleken of fototoxiciteit, worden uitgevoerd voor de aanvullende indicatoren.

  1. Start de confocale microscoop en laad standaardinstellingen voor GFP-beeldvorming (488 nm excitatie, 505 - 550 nm emissie).
  2. Stel de detector in op 12 bits of 16 bits.
    OPMERKING: Meestal zijn 8 bits niet voldoende voor kwantitatieve beeldvorming.
  3. Activeer de sequentiële scanmodus en voeg een tweede reeks/track toe (405 nm excitatie, 505 - 550 nm emissie).
  4. Selecteer voor beide kanalen een pseudokleuropzoektabel die over- en onderbelichte pixels aangeeft (bijvoorbeeld GLOW OU).
  5. Selecteer een doelstelling die geschikt is voor het object van interesse.
    OPMERKING: 10x-40x zijn geschikt voor eencellige analyse, 63x-100x zijn geschikt voor single-mitochondrion-analyse.
  6. Monteer een coverslip met cellen in de beeldvormingskamer, voeg 1 ml beeldbuffer toe en plaats de kamer op de microscoop.
  7. Gebruik het oculair en het doorgelaten licht om de cellen scherp te stellen.
    OPMERKING: Gebruik geen epifluorescentielicht om cellen te lokaliseren en te focussen. Zelfs bij een laag vermogen zal dit de cellen nadelig beïnvloeden.
  8. Neem afbeeldingen op met verschillende pixelindelingen. Selecteer op basis van deze afbeeldingen het laagste pixelaantal dat een acceptabele resolutie van de interessante structuur geeft.
    OPMERKING: Meestal werken 512 x 512 pixels goed voor eencellige beeldvorming met 20x en 40x objectieven, en 1024 x 1024 of 2048 x2048 pixels werken meestal goed voor single-mitochondrion imaging met een 63x objectief.
  9. Neem beelden op met verschillende pinhole-formaten. Selecteer op basis van deze afbeeldingen de grootste pinhole-grootte die een acceptabele resolutie van de interessante structuur geeft.
    OPMERKING: Meestal werken 3-7 luchtige eenheden goed.
  10. Neem beelden op met verschillende laserintensiteiten.
    1. Pas de detectorversterking en -drempel dienovereenkomstig aan. Selecteer op basis van deze afbeeldingen de laagste laserintensiteit die een acceptabele signaalintensiteit en signaal-achtergrondverhouding geeft.
      1. Om de signaal-achtergrondverhouding te bepalen, meet u de signaalintensiteit in een interessegebied (ROI) dat cellen of mitochondriën bevat (ROI1) en in een ROI zonder cellen of mitochondriën (ROI2). Deel vervolgens de intensiteit van ROI1 door de intensiteit van ROI2.
        OPMERKING: Streef naar een signaal-achtergrondverhouding van >3 en signaalintensiteiten van individuele ROI's van 200-1.000 voor 405 nm excitatie met 1-3% laservermogen en intensiteiten van individuele ROI's van 300-1.500 voor 488 nm excitatie met 1% laservermogen.
  11. Neem afbeeldingen op met verschillende scansnelheden en het aantal framegemiddelden. Neem 4-5 afbeeldingen op voor elke combinatie van instellingen. Selecteer op basis van deze afbeeldingsreeksen de hoogste snelheid en laagste gemiddelde instellingen die acceptabele beeldruis en beeld-naar-beeldvariabiliteit bieden.
    OPMERKING: Een scansnelheid van 600 Hz en 1-2 frames voor gemiddelden werken in de meeste gevallen goed.
  12. Gebruik een nieuwe coverslip om een time-lapse-serie op te nemen met de geoptimaliseerde instellingen.
    OPMERKING: De duur en het beeldinterval van de serie moeten lijken op die van de geplande experimenten.
  13. Voeg aan het einde van de time-lapse-serie 1 ml 2x DA-oplossing toe aan de opnamekamer. Afbeelding voor nog eens 2 min.
  14. Zuig de beeldvormingsbuffer op met behulp van een peristaltische pomp of handheld pipet. Voeg 1 ml 1x DTT-oplossing toe. Afbeelding voor nog eens 5 min.
  15. Analyseer het time-lapse-experiment (zie rubriek 5).
    1. Controleer of geen van de twee kanalen over- of onderbelicht raakt tijdens DA- en DTT-behandeling met de geoptimaliseerde instellingen.
    2. Zorg ervoor dat geen van de twee kanalen een aanzienlijke verbleking vertoont tijdens de time-lapse-opname; streef naar <2% intensiteitsverlies tussen de eerste en laatste beelden.
    3. Controleer of de verhouding 405:488 niet aanzienlijk verandert tijdens het maken van de beeldvorming.
  16. Herhaal de hele procedure op een iteratieve manier, met behulp van verschillende coverslips, totdat instellingen zijn gedefinieerd die consistent acceptabele resultaten bieden.

4. Beoordeling van de basale redoxstatus

  1. Start de microscoop en laad de geoptimaliseerde instellingen uit sectie 3.
  2. Stel het framegemiddelde in op 3-5.
  3. Monteer een coverslip met cellen in de beeldvormingskamer, voeg 1 ml beeldbuffer toe en plaats de kamer op de microscoop.
  4. Gebruik het oculair en het doorgelaten licht om de cellen scherp te stellen.
    OPMERKING: Gebruik geen epifluorescentielicht om cellen te lokaliseren en te focussen. Zelfs bij een laag vermogen zal dit de cellen nadelig beïnvloeden.
  5. Schakel over naar de scanmodus en gebruik het 488 nm-kanaal in liveweergave om cellen scherp te stellen en te lokaliseren voor beeldvorming.
  6. Gebruik de multipoint-functie om 3-5 gezichtsvelden op de coverslip te selecteren.
  7. Neem een basislijnafbeelding op.
  8. Voeg 1 ml 2x DA-oplossing toe aan de kamer.
  9. Gebruik na 1, 2 en 3 minuten live view om de focus te bevestigen /aanpassen en neem vervolgens een afbeelding op.
    OPMERKING: Cellen zijn meestal volledig geoxideerd na 2 minuten.
  10. Vervang de buffer in de beeldvormingskamer door 1 ml 1x DTT-oplossing.
  11. Gebruik na 3 en 5 minuten live view om de focus te bevestigen/aanpassen en neem vervolgens een afbeelding op.
    OPMERKING: Cellen zijn meestal volledig verminderd na 4-5 minuten.

5. Live beeldvorming van acute behandelingen

OPMERKING: Het onderstaande protocol beschrijft beeldvorming van de mitochondriale redoxrespons op NMDA-behandeling. Beeldintervallen en duur van het experiment moeten mogelijk worden aangepast voor andere behandelingen.

  1. Start de microscoop en laad de geoptimaliseerde instellingen uit sectie 3.
  2. Stel het time-lapse-interval in op 30 s en de duur op 25 minuten.
  3. Monteer een coverslip met cellen in de beeldvormingskamer, voeg 1 ml beeldbuffer toe en plaats de kamer op de microscoop.
    OPMERKING: Om thermische focusdrift te voorkomen, laat u de cellen 10-15 minuten op het microscooppodium staan voordat u begint met time-lapse-beeldvorming.
  4. Gebruik het oculair en het doorgelaten licht om de cellen scherp te stellen.
    OPMERKING: Gebruik geen epifluorescentielicht om cellen te lokaliseren en te focussen. Zelfs bij een laag vermogen zal dit de cellen nadelig beïnvloeden.
  5. Schakel over naar de scanmodus en gebruik het 488 nm-kanaal in liveweergave om cellen scherp te stellen en te lokaliseren voor beeldvorming.
  6. Optioneel: Als u het aantal opgenomen cellen per run wilt verhogen, gebruikt u de multipointfunctie om 2-3 gezichtsvelden per coverslip weer te geven.
  7. Start de time-lapse acquisitie en neem 5 beelden op als 2 min baseline opname.
  8. Voeg 500 μL 3x NMDA-oplossing toe aan de kamer (eindconcentratie 30 μM) en neem nog eens 20 beelden op als nmda-respons van 10 minuten.
    OPMERKING: Neuronen zijn erg gevoelig voor veranderingen in osmolariteit. Zorg er daarom voor dat de verdamping van de beeldvormingsbuffer tot een minimum wordt beperkt. Voor langere behandelingen moet de beeldvormingskamer worden bedekt met een deksel.
  9. Voeg 500 μL 4x DA-oplossing toe aan de kamer en neem nog 6 beelden op (maximale kalibratie van 3 minuten).
  10. Zuig de buffer uit de beeldvormingskamer en vervang deze door 1 ml 1x DTT-oplossing. Neem nog 10 beelden op (minimaal 5 minuten kalibratie).
  11. Beëindig de opname en sla de beeldreeks op.

6. Data-analyse

  1. Gegevensimport en voorbewerking van afbeeldingen in FIJI
    1. Gebruik de importfunctie voor bio-indelingen om een groep afbeeldingen uit stap 4 of een afbeeldingsbestand uit stap 5 te openen. Klik op Plugins | Bio-Formaten | Bio-Formats Importeur. Gebruik in het dialoogvenster Stapel weergeven met: Hyperstack, stel Kleurmodus: standaard in, selecteer Automatisch schalen en splits niet in afzonderlijke vensters.
      OPMERKING: Automatisch schalen optimaliseert de weergave van de gegevens op het computerscherm. Het verandert de pixelintensiteiten niet.
    2. Als afzonderlijke afbeeldingen uit stap 4 zijn geopend, klikt u op Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Voeg ze samen om ze samen te voegen tot een stapel met één afbeelding.
    3. Als er XY-drift is tijdens de afbeeldingsreeks, klikt u op Plugins | StackReg om de afbeeldingen te registreren. Selecteer in het dialoogvenster Rigid Body of Translation.
    4. Wijzig het beeldformaat naar 32 bit door op Image | Soort | 32-bits.
    5. Splits de kleurkanalen in afzonderlijke vensters door op Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen.
    6. Selecteer kanaal 1 (405 nm) en pas de drempel aan om de mitochondriën voor analyse te selecteren door op Afbeelding | | aanpassen Drempel. Selecteer in het dialoogvenster Standaard, Rood, Donkere achtergrond en Histogram stapelen en wacht tot de geselecteerde pixels rood worden weergegeven. Klik op Toepassen. Selecteer Achtergrondpixels instellen op NaN en Alle afbeeldingen verwerken.
      OPMERKING: Om mogelijke vooringenomenheid van de waarnemer te voorkomen, moet geautomatiseerde drempelbepaling worden gebruikt. FIJI biedt verschillende geautomatiseerde methoden (zoals Default, Huang, Intermodes, Otsu) die kunnen worden geselecteerd in een vervolgkeuzemenu in het drempeldialoogvenster. Meestal geeft de standaardmethode een goed resultaat. Het wordt aanbevolen om tijdens de eerste analyse verschillende methoden te vergelijken om de beste drempelmethode voor de gegeven set afbeeldingen te vinden. Zodra een methode is gekozen, moet deze op alle afbeeldingen worden toegepast.
    7. Herhaal stap 6.1.6 voor kanaal 2 (488 nm).
    8. Maak een verhoudingsafbeelding om de verhouding van 405:488 nm te visualiseren door op proces- | Beeldcalculator. Selecteer in het dialoogvenster Afbeelding 1: kanaal 1, Bewerking: Verdelen, Afbeelding 2: kanaal 2, Nieuw venster maken, Alle afbeeldingen verwerken.
    9. Wijzig de opzoektabel van de verhoudingsafbeelding in pseudokleur. Als u bijvoorbeeld wilt overschakelen naar Fire, klikt u op Afbeelding | | opzoektabellen Vuur.
  2. Beeldanalyse
    1. Teken op de verhoudingsafbeelding ROI's rond individuele cellen of mitochondriën. Nadat u elke ROI hebt getekend, voegt u deze toe aan de ROI Manager. | analyseren Gereedschap | ROI Manager | Toevoegen. (sneltoets: 'T') Selecteer Alles weergeven.
      OPMERKING: Omdat achtergrondpixels in stap 6.1.6 en 6.1.7 zijn ingesteld op 'geen getal' (NaN), hebben ze geen invloed op het resultaat van de meting. Daarom is het acceptabel om enkele achtergrondpixels in de ROI op te nemen.
    2. Meet de 405:488-verhoudingen van afzonderlijke cellen door op ROI Manager | ctrl+A te klikken om alle ROI's te selecteren | Meer | Multi Meten. Selecteer in het dialoogvenster Alle segmenten meten en Eén rij per segment.
    3. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware.
    4. Selecteer de afbeelding van 405 nm. Meet de intensiteiten van alle ROIs zoals in stap 6.2.2. met behulp van de ROI's die zijn opgeslagen in de ROI-manager.
    5. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware.
    6. Selecteer de afbeelding van 488 nm. Meet de intensiteiten van alle ROIs zoals in stap 6.2.2. met behulp van de ROI's die zijn opgeslagen in de ROI-manager.
    7. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware.
    8. Sla ROI's op voor toekomstig gebruik door te klikken op ROI Manager | ctrl+A om alle ROI's te selecteren | Meer | Opslaan.
    9. Aanbevolen: Genereer intensiteit versus tijdplots van de sporen van 405 en 488 nm. Controleer of er geen duidelijke bleeking is in een van de kanalen (de signaalintensiteit aan het einde van de beeldvormingsreeks moet worden ≥98% van het eerste beeld) en of de twee sporen tijdens sensorreacties in tegengestelde richting bewegen (het spoor van 405 nm zou bijvoorbeeld moeten toenemen tijdens oxidatie terwijl het 488 nm-spoor zou moeten afnemen).
  3. Gegevensnormalisatie
    1. Bepaal voor elke ROI van de verhoudingsafbeelding de maximale waarde tijdens DA-behandeling (Rmax) en de minimale waarde tijdens DTT-behandeling (Rmin).
    2. Bereken de genormaliseerde verhouding als volgt:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: Hiermee wordt de maximale verhouding ingesteld op 1,0 en de minimale verhouding op 0.
  4. Analyse van mitochondriale morfologie
    1. Om metingen van mitochondriale morfologie parallel aan roGFP-intensiteiten in stap 6.2.6 te verkrijgen, gaat u naar | analyseren Stel metingen in en controleer Vormbeschrijvingen en Fit-ellips.
      OPMERKING: Naast de gemiddelde intensiteit omvatten de metingen in het resultatenvenster de lengte van de hoofdas (Major), de lengte van de secundaire as (Minor), de beeldverhouding (AR; hoofdas gedeeld door kleine as; ronde mitochondriën hebben een AR ~ 1, langwerpige mitochondriën hebben een grotere AR), evenals metingen van circulariteit (Circ.) en rondheid (Rond).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantificering van verschillen in steady-state mitochondriale redoxtoestand na terugtrekking van de groeifactor
Om de kwantificering van steady-state verschillen in mitochondriale redoxtoestand aan te tonen, werden primaire neuronen gekweekt in standaardmedium vergeleken met neuronen gekweekt zonder groeifactoren gedurende 48 uur vóór beeldvorming. Onttrekking van groeifactoren resulteert in apoptotische neuronale celdood na 72 h16. Cellen werden na 48 uur in beeld gebracht om ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kwantitatieve en dynamische metingen van de mitochondriale redoxtoestand leveren belangrijke informatie op over mitochondriale en cellulaire fysiologie. Er zijn verschillende fluorogene chemische sondes beschikbaar die reactieve zuurstofsoorten, "redoxstress" of "oxidatieve stress" detecteren. Deze laatste termen zijn echter niet goed gedefinieerd en missen vaak specificiteit9,17,18. In vergelijking met chemische kleurstoffen bi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; VOOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wordt ondersteund door een ERASMUS+ beurs. We bedanken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner en Andrea Schlicksupp voor de voorbereiding van primaire neuronen. Wij danken Dr. Tobias Dick voor het leveren van pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. De experimenten in figuur 4 werden uitgevoerd in het Nikon Imaging Center van de Universiteit van Heidelberg. Figuur 2 is opgesteld met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
reagenten
Calciumchloride (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306
Diamide (DA)Sigma-AldrichD3648
Dithiothreitol (DTT)Carl Roth GmbH6908.1
Glucose (2,5 M stockoplossing)Sigma-AldrichG8769
GlucoseSigma-AldrichG7528
GlycineneoFroxx GmbHLC-4522.2
HEPES (1 M stockoplossing)Sigma-Aldrich15630-080
HEPESSigma-AldrichH4034
Magnesiumchloride (MgCl2·6H2O)Sigma-Aldrich442611-M
N-methyl-D-aspartaat (NMDA)Sigma-AldrichM3262
Kaliumchloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Natriumchloride (NaCl)neoFroxx GmbHLC-5932.1
Natriumpyruvaat (0,1 M stockoplossing)Sigma-AldrichS8636
NatriumpyruvaatSigma-AldrichP8574
SucroseCarl Roth GmbH4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchloraat (TMRE)Sigma-Aldrich87917
apparatuur
beeldvormingskamerLife Imaging Services (Basel, Zwitserland)10920Ludin Chamber Type 3 voor Ø12mm dekglasjes
laser scanning confocale microscoop, microscoopLeicaDMI6000
laser scanning confocale microscoop, scanunitLeicaSP8
peristaltpompVWRPP1080 181-4001
spinning disc confocale microscoop, cameraHamamatsuC9100-02 EMCCD
spinning disc confocale microscoop, incubatiesysteemTokaiHitINU-ZILCF-F1
spinning disc confocale microscoop, microscoopNikonTi microscoop
spinning disc confocale microscoop, scanunitYokagawaCSU-X1
software
FIJIhttps://fiji.sc
StackReg pluginhttps://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg pluginhttps://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

Referenties

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604(2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Mitochondriële redoxstatusglutathion-redoxpotentiaalconfocale live-microscopieGrx1-roGFP2-sensormitochondriaal membraanpotentiaalNMDA-behandelingImageJ-analyseTMRE-co-imaging
Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.