Methodenartikel

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

DOI:

10.3791/63077

⸱

25 februari 2022

 , 
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestuderen van de fysiologische eigenschappen van specifieke synapsen in de hersenen, en hoe ze plastische veranderingen ondergaan, is een belangrijke uitdaging in de moderne neurowetenschappen. Traditionele in vitro elektrofysiologische technieken gebruiken elektrische stimulatie om synaptische transmissie op te roepen. Een groot nadeel van deze methode is het niet-specifieke karakter; alle axonen in het gebied van de stimulerende elektrode worden geactiveerd, waardoor het moeilijk is om een effect toe te schrijven aan een bepaalde afferente verbinding. Dit probleem kan worden ondervangen door elektrische stimulatie te vervangen door optogenetische stimulatie. We beschrijven een methode om optogenetica te combineren met in vitro patch-clamp opnames. Dit is een krachtig hulpmiddel voor de studie van zowel basale synaptische transmissie als synaptische plasticiteit van precieze anatomisch gedefinieerde synaptische verbindingen en is van toepassing op bijna elke route in de hersenen. Hier beschrijven we de voorbereiding en behandeling van een virale vector die codeert voor channelrhodopsine-eiwit voor chirurgische injectie in een pre-synaptisch gebied van belang (mediale prefrontale cortex) in de hersenen van knaagdieren en het maken van acute plakjes stroomafwaartse doelgebieden (laterale entorhinale cortex). Een gedetailleerde procedure voor het combineren van patch-clamp opnames met synaptische activering door lichtstimulatie om synaptische plasticiteit op korte en lange termijn te bestuderen, wordt ook gepresenteerd. We bespreken voorbeelden van experimenten die pathway- en celspecificiteit bereiken door optogenetica en Cre-afhankelijke celetikettering te combineren. Ten slotte wordt histologische bevestiging van het pre-synaptische gebied van belang beschreven samen met biocytine-etikettering van de post-synaptische cel, om verdere identificatie van de precieze locatie en het celtype mogelijk te maken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van de fysiologie van synapsen en hoe ze plastische veranderingen ondergaan, is van fundamenteel belang om te begrijpen hoe hersennetwerken functioneren in de gezonde hersenen1 en hoe ze niet goed functioneren bij hersenaandoeningen. Het gebruik van acute ex vivo hersensegmenten maakt het mogelijk om de elektrische activiteit van synapsen van afzonderlijke neuronen met een hoge signaal-ruisverhouding te registreren met behulp van patchklemopnamen voor hele cellen. Controle van membraanpotentiaal en eenvoudige farmacologische manipulatie maakt isolatie van receptorsubtypen mogelijk. Deze opnames kunnen met voortreffelijke specificiteit worden gemaakt om het post-synaptische neuron te identificeren, inclusief laminaire en subregionale positie2, cellulaire morfologie3, aanwezigheid van moleculaire markers4, de afferente projecties5, of zelfs als het onlangs actief was6.

Het bereiken van specificiteit van pre-synaptische inputs is echter iets uitdagender. De conventionele methode heeft stimulatie-elektroden gebruikt om de axonen te exciteren die in een bepaalde lamina lopen. Een voorbeeld hiervan is in de hippocampus waar lokale stimulatie in het stratum radiatum synapsen activeert die van de CA3 naar het CA1-subveld7 projecteren. In dit geval wordt presynaptische specificiteit bereikt omdat CA3-input de enige exciterende input vertegenwoordigt die zich in stratum radiatum bevindt en projecteert op CA1 piramidale cellen8. Deze hoge mate van inputspecificiteit die haalbaar is met conventionele elektrische presynaptische activering van CA3-CA1-axonen is echter een uitzondering die wordt weerspiegeld in de intense studie waaraan deze synaps is onderworpen. In andere hersengebieden bestaan axonen van meerdere afferente paden naast elkaar in dezelfde lamina, bijvoorbeeld in laag 1 van neocortex9, waardoor inputspecifieke presynaptische stimulatie onmogelijk wordt met conventionele stimulerende elektroden. Dit is problematisch omdat verschillende synaptische inputs uiteenlopende fysiologische eigenschappen kunnen hebben; daarom kan hun co-stimulatie leiden tot verkeerde karakterisering van synaptische fysiologie.

De komst van optogenetica, de genetische codering van lichtgevoelige membraaneiwitten (opsins) zoals channelrhodopsine-2 (ChR2), heeft een enorme uitbreiding van de mogelijkheden mogelijk gemaakt voor het bestuderen van geïsoleerde synaptische projecties tussen hersengebieden10,11. Hier beschrijven we een generaliseerbare en goedkope oplossing voor het bestuderen van synaptische fysiologie en plasticiteit op lange afstand. De optogenetische constructen worden op een zeer specifieke manier geleverd met behulp van virale vectoren die een uiterst nauwkeurige controle van het pre-synaptische gebied van belang mogelijk maken. Efferente projecties zullen het door licht geactiveerde kanaal uitdrukken, waardoor deze vezels in een doelgebied kunnen worden geactiveerd. Zo kunnen langeafstands-, anatomisch diffuse paden worden bestudeerd die niet onafhankelijk kunnen worden geactiveerd door traditionele, niet-specifieke, elektrische stimulatie.

We beschrijven, als voorbeeldroute, transductie van mediale prefrontale cortex (mPFC) met adeno-geassocieerde virussen (AAV's) die coderen voor exciterende kationkanaalopsinen. Vervolgens beschrijven we de bereiding van acute plakjes uit de laterale entorhinale cortex (LEC), patch-clamp opnames van laag 5 LEC piramidale neuronen en lichtgevooleerde activering van glutamaterge mPFC-LEC projecties (Figuur 1). We beschrijven ook de histologische beoordeling van de injectieplaats om de locatie van het pre-synaptische gebied van belang en identificatie van post-synaptische celmorfologie te bevestigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Britse Animals Scientific Procedures Act (1986) en bijbehorende richtlijnen en lokale institutionele richtlijnen.

1. Stereotaxische virale injectie

OPMERKING: Het huidige protocol vereist anatomische, maar niet post-synaptische celtype, specificiteit.

  1. Kies het juiste dier. Mannelijke wild-type Lister hooded ratten werden gebruikt in dit protocol (300-350 g, ongeveer 3 maanden oud).
  2. Kies de juiste virale constructie. Er zijn verschillende factoren om rekening mee te houden (zie Discussie). Het huidige protocol gebruikt een virus om het optogenetische kanaal ChETATC12 tot expressie te brengen, om exciterende neuronen te transduceren (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; titer: 3,3 x 1013 virale genomen/ml).
  3. Stel de coördinaten en het volume van de injectie vast met behulp van een hersenatlas zoals eerder beschreven35.
  4. Stereotaxische injectie van het virale preparaat
    OPMERKING: Alle relevante nationale en institutionele richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren moeten worden gevolgd. De virale vectoren worden stereotaxisch geïnjecteerd zoals eerder beschreven13 met de volgende wijzigingen.
    1. Houd het virale preparaat op ijs tijdens de verdoving en voorbereiding van het dier.
    2. Induceer anesthesie in een anesthetische inductiekamer met 4% isofluraan. Controleer het niveau van anesthesie dat wordt aangegeven door een langzamere regelmatige ademhalingsfrequentie (1 Hz) en afwezigheid van pedaal- en corneareflexen (test door respectievelijk in de tenen te knijpen en de ooghoek licht aan te raken; er mag geen reactie worden gedetecteerd).
    3. Dien preoperatieve analgeticum zoals meloxicam ten minste 30 minuten vóór de invasieve procedure toe.
    4. Wanneer het dier volledig verdoofd is, gebruik dan tondeuses om de vacht van de hoofdhuid te verwijderen. Schakel de isofluraanstroom naar de neuskegel van het stereotaxische frame en monteer de rat in het frame. Breng bevochtigende ooggel aan op de ogen om uitdroging tijdens de procedure te voorkomen.
    5. De operatie moet worden uitgevoerd in aseptische omstandigheden. Gebruik steriele handschoenen en instrumenten tijdens de procedure. Breng lidocaïnezalf (5% w / w) aan voordat u de hoofdhuid desinfecteert met 4% w / v chloorhexidine-oplossing en bedek vervolgens het lichaam met een steriel gordijn. Maak met behulp van een scalpel een longitudinale incisie van ongeveer 15 mm lang op de hoofdhuid om bregma bloot te leggen.
    6. Laad een Hamilton-spuit in een pomp met micro-injectiespuit die is bevestigd aan een beweegbare arm die op het stereotaxische frame is gemonteerd.
    7. Plaats een aliquot van 5 μL van het virus in een buis van 0,2 ml en draai gedurende een paar seconden totdat al het volume zich in de bodem van de buis bevindt. Pipetteer 2 μL van het virale preparaat in het deksel van de buis.
    8. Vul de spuit met het virale preparaat door eerst de naaldpunt te bekijken met een chirurgische microscoop en plaats vervolgens handmatig de bolus van het virus aan de punt van de naald en trek de zuiger van de spuit op met behulp van de pompbedieningen.
    9. Stel het injectievolume van de pomp in op 300 nL en het debiet op 100 nL/min. Laat de pomp draaien en bevestig de juiste stroom door de druppel van het virus aan de naaldpunt te observeren. Absorbeer het virus op een wattenstaafje en reinig de naald voorzichtig met 70% ethanol.
    10. Navigeer met behulp van de stelschroeven op het stereotaxische frame de naaldpunt naar bregma (het punt op de schedel waar de coronale en sagittale hechtingen elkaar ontmoeten) en let op de stereotaxische metingen die zijn waargenomen op de drie vernier-schalen op het frame. De coördinaten ten opzichte van bregma van rat mPFC zijn anterieur-posterior + 3,1 mm, middellateraal ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; tel deze afstanden van bregmacoördinaten op/trek deze af (zoals aangegeven) en navigeer vervolgens met de naald naar de voorste-achterste en middelmatige coördinaten en laat de naald voorzichtig op het schedeloppervlak zakken.
      OPMERKING: De hierboven gegeven mPFC-coördinaten zijn geschikt voor mannelijke lister hooded ratten van 300-350 g; veranderingen in rattenstam, grootte kunnen wijzigingen in deze coördinaten vereisen (zie discussie).
    11. Til de naald van het schedeloppervlak en markeer dit punt met een permanente markeerpen met fijne punt. Maak op dit punt een braamgat met behulp van een microboor die op de stereotaxische arm is gemonteerd.
    12. Steek de naald in de hersenen bij de vooraf bepaalde dorsoventrale coördinaat en infundeer een vooraf bepaald volume (voor mPFC: 300 nL). Laat de naald 10 minuten in situ om de diffusie van de bolus mogelijk te maken. Laat bij het verwijderen van de naald de pomp draaien om ervoor te zorgen dat de naald niet wordt geblokkeerd.
      OPMERKING: Plaats en verwijder de naald langzaam (~ 3 mm / min) om de schade aan het hersenweefsel en de terugstroom van het virus in het naaldkanaal te minimaliseren.
    13. Dien 2,5 ml verwarmd natriumchloride (0,9% m/v) en glucose (5% w/v) oplossing subcutaan toe om de hydratatie te behouden.
    14. Herhaal stap 1.4.12. voor het tweede halfrond.
    15. Hecht de hoofdhuidincisie en dien na voltooiing van de procedure 2,5 ml natriumchloride en glucoseoplossing en een geschikt, institutioneel aanbevolen, analgeticum toe voor pijnbestrijding, bijvoorbeeld buprenorfine of meloxicam. Laat het dier niet onbeheerd achter terwijl het bewusteloos is. Plaats de rat in een verwarmde herstelbox totdat hij weer volledig bij bewustzijn is. Keer alleen terug naar de thuiskooi met andere dieren als ze volledig zijn hersteld.
    16. Volg de institutionele richtlijnen voor postoperatieve zorg- en huisvestingsprocedures voor virale getransfecteerde knaagdieren. Wacht ten minste 2 weken totdat het opsinetransgen voldoende tot expressie is gebracht voordat u met het experiment begint.
      OPMERKING: De tijd die nodig is voor transductie is afhankelijk van de afstand en sterkte van de verbinding tussen de pre- en post-synaptische regio's. Voor mPFC tot LEC is 4-6 weken nodig.

2. Bereiding van acute hersenplakken

OPMERKING: Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de bereiding van hersenplakken die in onze handen voldoende is om corticale, hippocampale en thalamische plakjes van hoge kwaliteit van volwassen muizen en ratten te bereiken.

  1. Bereid de oplossingen voor dissectie voor.
    1. Vul een bekerglas van 250 ml met ~200 ml ijskoude sucrosesnijdoplossing (189 mM sucrose, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-glucose, 5 mM MgSO4, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 en 0,2 mM CaCl2 gemaakt in ultrapuur water (UPW) met een weerstand van 18,2 MΩ cm bij 25 °C) of een voldoende volume om de vibratomweefselkamer te vullen. Bubbel met carbogen (95% O2, 5% CO2) en houd op ijs.
    2. Vul een plakverzamelkamer met kunstmatige hersenvocht (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-glucose, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4 en 1 mM MgSO4 gemaakt in UPW) bij kamertemperatuur, bubbeld met carbogen. De snijcollectiekamer14 is op maat gemaakt van een microcentrifugebuisrek dat op een vel nylon gaas is gelijmd en in een bekerglas is geplaatst waarin het wordt ondergedompeld in aCSF (figuur 2A).
    3. Vul een buis van 50 ml met 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatbuffer (PB; 75,4 mM Na2HPO 4,7H2O en 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
      LET OP: PFA is giftig. Te gebruiken in zuurkast.
  2. Dissectie van de hersenen.
    1. Verdoof de rat in een inductiekamer met 5% isofluraan totdat de ademhaling langzaam en regelmatig is (~ 1 Hz). Om een voldoende niveau van anesthesietest te garanderen voor de afwezigheid van pedaal- en hoornvliesreflexen.
    2. Onthoofd het dier met behulp van een guillotine.
    3. Ontleed snel de hele hersenen zoals eerder beschreven15 en breng over in sucrose-snijoplossing. Voltooi de stap binnen 90 s na onthoofding voor een goede plakkwaliteit en succesvolle opname van de hele cel.
    4. Pak met een metalen theelepel de hersenen op, gooi overtollige snijoplossing weg en plaats het op een stuk filterpapier op het bankje.
    5. Gebruik een scalpel of scheermesje, verwijder snel het cerebellum en snijd het cerebrum in het coronale vlak ongeveer halverwege de lengte; de achterste helft is het LEC-weefselblok. Zorg ervoor dat u wat overtollig weefsel opneemt naast het gebied dat moet worden gesneden voor de volgende stappen. Breng zowel dit weefselblok als de rest van de hersenen terug naar de sucrose-snijoplossing.
    6. Plaats een druppel cyanoacrylaatlijm op een vibratoomweefselstadium. Verdeel het in een dunne laag met een gebied dat iets groter is dan het weefselblok dat in de vorige stap is gemaakt.
    7. Pak het LEC-weefselblok op met een theelepel, gooi overtollige oplossing weg en breng het over op de lijmpleister zodat de voorste coronale snee zich heeft gehecht.
    8. Installeer het podium in de vibratome weefselkamer en giet snel een voldoende hoeveelheid sucrose-snijoplossing om het weefsel onder te dompelen; bubbel deze oplossing met carbogen. Richt het LEC-weefselblok met het ventrale oppervlak naar het blad. Hoewel de verlichting van de omgevingsruimte onvoldoende is om de opsin te activeren, vermijdt u het gebruik van extra lichtbronnen die mogelijk op het vibratoom aanwezig zijn.
    9. Snijd plakjes van 350 μm dikte van ventraal tot dorsaal met behulp van een hoge bladoscillatiesnelheid (100 Hz) en een langzame bladvoortgangssnelheid (0,06 mm / s). Doorgaans kunnen zeven LEC-plakjes per halfrond worden verkregen.
    10. Breng de segmenten over naar de segmentverzamelingskamer. Breng na voltooiing van het verzamelen van de plakjes de verzamelkamer gedurende 1 uur over naar een waterbad van 34 °C voordat u terugkeert naar kamertemperatuur. Bubbel met carbogen continu. Plakjes zijn voldoende gezond om minstens 6 uur te registreren.
    11. Plaats de rest van de hersenen gedurende 48 uur in PFA voor post-hoc onderzoek van de injectieplaats (zie rubriek 4).

3. Elektrofysiologie en optogenetische stimulatie

  1. Identificatie van de doelcel.
    1. Plaats de plak in een ondergedompelde opnamekamer bij 34 °C doordrenkt met aCSF met een snelheid van 2 ml/min door een peristaltische pomp. Immobiliseer het segment met een segmentanker.
    2. Navigeer onder het lage vergrotingsobjectief (4x) van een widefieldmicroscoop met behulp van schuine infraroodverlichting naar LEC-laag 5. Meet de afstand van het pialoppervlak tot de benodigde laag.
      OPMERKING: Schuine infraroodverlichting werd bereikt door een bijna infrarood LED ongeveer 3 mm onder de coverslip van de opnamekamer te plaatsen onder een hoek van ~ 55 ° ten opzichte van het vlak van de coverslip (figuur 2B). Differentiële interferentiecontrast is een alternatieve en veelgebruikte beeldvormingstechniek voor slice-elektrofysiologie.
    3. Verander naar een wateronderdompelingsdoel met een hoge vergroting (40x) en identificeer piramidale neuronen. Markeer de positie van de cel op het computerscherm met tape.
      OPMERKING: De piramidale neuronen hebben een ruwweg driehoekige morfologie met prominente apicale dendrieten die naar het piale oppervlak van de plak projecteren (figuur 3A). De gezondheid van de cellen kan worden beoordeeld door de afwezigheid van een gecondenseerde, zichtbare kern en inspectie van het plasmamembraan dat er glad uit zou moeten zien. Het is onwaarschijnlijk dat duidelijke fluorescerende etikettering van axonen door het opsine-fluorofoor fusie-eiwit zichtbaar zal zijn bij gebruik van een breedveld fluorescentiemicroscoop. Om axonale projecties te visualiseren, voert u immunohistochemie post-hoc uit met behulp van een primair antilichaam tegen de fluorofoor van de opsine en versterkt u met een secundair antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor van dezelfde of vergelijkbare golflengte.
  2. Vorming van hele-cel patch-klem.
    1. Fabriceer een micropipette van borosilicaatglas met behulp van een pipettrekker en vul met gefilterde intracellulaire opnameoplossing (120 mM k-gluconaat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA en 0,25% biocytine gemaakt in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Plaats de gevulde micropipette in de elektrodehouder op de hoofdtrap van de patchklemversterker, zodat de elektrodedraad in contact komt met de intracellulaire oplossing.
    2. Oefen positieve druk uit via de mond door hard in een mondstuk te blazen (zoals een spuit van 1 ml met de zuiger verwijderd) die door slang is aangesloten op de zijpoort van de elektrodehouder en de druk te handhaven door een in-line driewegklep te sluiten. Verhoog het microscoopdoel zodanig dat zich een meniscus vormt en steek de elektrode in de meniscus totdat deze op de microscoop te zien is.
    3. Open het venster Afdichtingstest in WinLTP16 (of andere acquisitiesoftware/oscilloscoop) en breng met de versterker in de spanningsklemmodus een vierkante puls van 5 mV aan om te bepalen of de pipetweerstand 3-6 MΩ is.
    4. Benader en raak de geïdentificeerde cel aan met de pipetpunt; dit moet resulteren in een inkeping in het celmembraan (figuur 3A; rechterpaneel) en een kleine toename van de pipetweerstand (0,1 MΩ).
    5. Laat positieve druk los en oefen negatieve druk uit door matige zuigkracht op het mondstuk toe te passen; dit zou moeten resulteren in een enorme toename van de pipetweerstand (>1000 MΩ). Druk kan nu neutraal worden gelaten. Oefen negatieve druk uit in een geleidelijk toenemende helling totdat het celmembraan scheurt, wat resulteert in transiënten voor de capaciteit van de hele cel.
  3. Noteer optogenetisch opgeroepen synaptische gebeurtenissen.
    1. Voer de stroom-klemconfiguratie in.
      OPMERKING: In de meeste gevallen is synaptische transmissie over lange afstand glutamaterge, daarom zal registratie op membraanpotentialen dicht bij het chlorideomkeerpotentieel het beste AMPA-receptor (AMPAR) -gemedieerde transmissie isoleren en de meting van eventuele feed-forward inhibitie (FFI) geërfd minimaliseren. Chlorideomkering is afhankelijk van de samenstelling van intracellulaire opnameoplossing en aCSF en kan worden berekend met behulp van de Goldman-Hodgkin-Katz-vergelijking; voor bovenstaande oplossingen was dit -61,3 mV. Laag 5 LEC piramidale neuronen hadden een gemiddeld rustmembraanpotentiaal van -62 mV en werden, waar nodig, op deze potentiaal gehouden door injectie van constante stroom. Als alternatief kunnen cellen worden vastgeklemd aan de gewenste potentiaal. Om langeafstandsremmende projecties16 te registreren of om FFI te registreren, spanningsklem bij kationomkeringspotentiaal om GABAerge chloridegeleiding te isoleren. Wanneer spanningsklemende neuronen op membraanpotentialen boven de actiepotentiaaldrempel liggen, wordt een op cesium gebaseerde intracellulaire oplossing met spanningsafhankelijke natriumkanaalblokkers gebruikt om de spanningsklem te verbeteren en het initiëren van actiepotentialen te voorkomen (130 mM CsMeSO4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 chloride, 4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocytine gemaakt in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
    2. Met behulp van data-acquisitiesoftware stuurt u transistor-transistorlogica (TTL) -signalen naar een LED-driver om een gemonteerde 470 nm LED te activeren. De gemonteerde LED wordt in het microscooplichtpad geleid met behulp van filterkubussen en geschikte optica (figuur 2B) om lichtpulsen op het segment aan te brengen via het 40x-objectief om optogenetische excitatorische post-synaptische potentialen (oEPSP's) op te roepen.
      OPMERKING: Lichtpulsen kunnen perisomatisch /over de dendrieten worden toegepast, wat zal resulteren in activering van opsins in de axonen en presynaptische bouton, of de onderzoeker kan het doel verplaatsen naar axonen weg van de opgenomen cel om over-boutonstimulatie te voorkomen (zie Discussie). Maximale oEPSP-amplitude hangt af van de sterkte van de synaptische projectie, de werkzaamheid van virale injecties en de gebruikte opsine. oEPSP's kunnen worden getitreerd tot de gewenste amplitude door de lichtintensiteit en/of duur18 te variëren; het variëren van de duur van lichtpulsen (typische duur tussen 0,2-5 ms bij maximaal LED-uitgangsvermogen, wat resulteert in 4,4 mW / mm lichtdichtheid19) geeft consistentere oEPSP-amplitudes dan het wijzigen van het uitgangsvermogen van de LED.
    3. Onderzoek presynaptische afgifte-eigenschappen (verandering in spanning) door treinen van meerdere lichtpulsen met verschillende interstimulusintervallen te leveren (figuur 3E); voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van optogenetisch opgewekte overdracht (zie Discussie).
    4. Onderzoek plasticiteit op lange termijn door herhaaldelijk oEPSP's19 op te roepen of door liganden toe te passen. Controleer de oEPSP-amplitude gedurende 5-10 minuten om stabiliteit te garanderen voordat de plasticiteit wordt geïnduceerd en controleer vervolgens totdat een stabiele amplitude is bereikt (meestal 30-40 minuten).
      OPMERKING: De meeste huidige opsins zijn niet in staat om op betrouwbare wijze meerdere actiepotentialen op hoge frequenties op te roepen, bijvoorbeeld 100 stimuli die worden geleverd bij 100 Hz, zoals meestal wordt gebruikt om LTP te induceren.
    5. Om te bevestigen dat oEPSP's monosynaptisch zijn, voert u over-boutonactivering van de getransduceerde route uit door het doel boven het dendritische prieel te plaatsen en te stimuleren in aanwezigheid van 0,5 μM tetrodotoxine en 100 μM aminopyridine. Toepassing van tetrodotoxine zal de transmissie afschaffen als de reacties actiepotentiaalafhankelijk zijn en de daaropvolgende opname van aminopyridine zal de transmissie gedeeltelijk herstellen als de oEPSP's monosynaptisch worden gegenereerd19,20.
    6. Om biocytine in staat te stellen het neuron te vullen, wacht u ten minste 15 minuten na het invoeren van de configuratie van de hele cel. In spanningsklem, monitor membraancapaciteit en ingangsweerstand.
    7. Trek de pipet langzaam terug langs de naderingshoek weg van de soma van de cel, waarbij de langzame verdwijning van capaciteitstransiënten en membraanstroom wordt waargenomen, wat wijst op de herafdichting van het celmembraan en de vorming van een buitenste pleister aan de pipetpunt. Noteer de richting van het segment en de locatie van de cel(en) in het segment. Doe de plak in PFA in een 24-wells plaat en incubeer een nacht bij 4 °C en breng vervolgens over naar 0,1 M PB.
      OPMERKING: Plakjes kunnen maximaal een week worden bewaard. Als langere opslag nodig is, vervang dan de PB regelmatig of gebruik PB met natriumazide (0,02% -0,2% natriumazide).

4. Histologie

  1. Snij-injectieplaats
    1. Na fixatie cryoprotecteert u het weefsel in 30% sucrose (w/v) in PB totdat het zinkt (het zal in eerste instantie drijven in de sucrose-oplossing), meestal 's nachts bij kamertemperatuur of 24-48 uur bij 4 °C.
    2. Bevestig met behulp van een optimaal snijtemperatuur (OCT) medium een blok weefsel aan de cryostat monsterschijf. Vries het weefselblok in volgens de stappen 4.1.3 tot en met 4.1.4.
    3. Plaats isopentane in een geschikte verpakking. Dompel alleen de monsterschijf onder en zorg ervoor dat het weefsel zich boven het niveau van het isopentaan bevindt. Laat de container met isopentane zakken tot vloeibare stikstof (of droogijs) en laat het weefsel bevriezen.
    4. Eenmaal volledig bevroren (het hele weefselblok wordt bleek en hard), laat u het weefselblok gedurende 30 minuten in de cryostaatkamer bij -20 °C om de temperatuur van het blok in evenwicht te brengen.
    5. Snijd 40 μm dikke secties in de cryostaat bij -20 °C. Gebruik een fijne kwast om de secties van het mes te leiden. Hecht bevroren secties aan een kamertemperatuur, poly-L-lysine gecoat, glazen microscoopglaasje door de dia aan de secties aan te raken.
    6. Voeg ongeveer 150 μL montagemedium toe aan elke dia en dek af met een coverslip; verwijder eventuele luchtbellen door zachtjes op de coverslip te drukken. Bedek de dia's ter bescherming tegen fotobleaching en droog aan de lucht bij kamertemperatuur gedurende ten minste 12 uur (of een nacht). Onderzoek met behulp van een fluorescentiemicroscoop de locatie van de virale injectieplaats.
  2. Biocytine kleuring protocol
    OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast op dikke secties; plakjes hoeven niet opnieuw te worden gesneden.
    1. Was de hersenschijfjes zes keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4) gedurende 10 minuten per wasbeurt. Gebruik een transferpipet om de putjes na elke stap te legen.
    2. Incubeer de plakjes in 3% H2O2 (w/v) in PBS gedurende 30 minuten om eventuele endogene peroxidase-activiteit te blokkeren. Hierdoor ontstaan zuurstofbellen.
    3. Was de hersenschijfjes zes keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt of totdat er geen zuurstofbellen meer zichtbaar zijn. Incubeer de hersenschijfjes in 1% (v/v) avidine-gebiotinyleerde HRP complex (ABC) oplossing in PBS met 0,1% (v/v) Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
    4. Was de hersenschijfjes zes keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt.
    5. Incubeer elke plak in 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) oplossing gedurende enkele minuten totdat de biocytinekleuring van neuronale structuren zichtbaar wordt (duurt ongeveer 5-10 min).
      LET OP: DAB is giftig. Te gebruiken in zuurkast.
      OPMERKING: DAB-incubatietijden kunnen onvoorspelbaar zijn, houd het weefsel nauwlettend in de gaten terwijl de kleur zich ontwikkelt.
    6. Stop de reactie door de plakjes over te brengen naar koud (4 °C) PBS. Was de hersenschijfjes zes keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Gebruik een borstel om de hersenplakken op poly-L-lysine gecoate glazen microscoopglaasjes te monteren.
    7. Verwijder alle overtollige PBS met een schone tissue. Bedek elke plak met ongeveer 200 μL montagemedium; dek af met coverslips en druk zachtjes op de coverslip om luchtbellen naar buiten te duwen. Droog aan de lucht bij kamertemperatuur gedurende ten minste 12 uur (of een nacht). Onderzoek met behulp van een lichtmicroscoop de locatie en morfologische details van de cel (en).
      OPMERKING: Biocytine kan ook worden gevisualiseerd met behulp van fluorofoor-geconjugeerde streptavidin; beeldvorming kan echter resectie of het gebruik van een confocale microscoop vereisen21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we hoe we synaptische fysiologie en plasticiteit op lange afstand kunnen bestuderen met behulp van virale afgifte van optogenetische constructen. Het protocol kan heel gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van bijna elke langeafstandsverbinding in de hersenen. Als voorbeeld beschrijven we de injectie van AAV's die coderen voor een opsine in rat mPFC, de bereiding van acute plakjes van LEC, patch-clamp opnames van laag 5 LEC piramidale neuronen en lichtgevoceerde activering van mPFC-t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode om zeer specifieke synaptische projecties op lange afstand te onderzoeken met behulp van een combinatie van stereotaxische chirurgie om AAV's te leveren die coderen voor optogenetische constructies, en elektrofysiologie in acute hersensegmenten (figuur 1). Samen bieden deze technieken hulpmiddelen om de fysiologie en plasticiteit van hersencircuits met hoge precisie te karakteriseren in langeafstands- en anatomisch diffuse paden die voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door Wellcome grant 206401/Z/17/Z. We willen Zafar Bashir bedanken voor zijn deskundige mentorschap en Dr. Clair Booth voor technische assistentie en commentaar op het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL tubeFisher Scientific Ltd12134102
10 µL pipetteGilsonFD10001
24 well plateSARSTEDT83.3922
3 way luer valveCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrateVector LaboratoriesSK-4105
40x objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
4x objectiveOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lensEdmund Optics49363Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifugeBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Borosillicate glass capillaryWarner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Camera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Chlorhexidine surgical scrubVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lensThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Cyanoacrylate glueRapid Electronics Ltd84-4557
Data acquisition deviceNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Dichroic mirror 500 nm long-passEdmund Optics69899
Dichroic mirror 600 nm long-passEdmund Optics69901
Dichroic mirror cubeThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Electrode holder with side portHEKA895150
Emission filterChroma59022m
Excitation filterChromaET570/20x
Eye gelDechraLubrithal
Fine paint brushScientific Laboratory SuppliesBRU2052
GuillotineWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH100930% (w/w)
IsofluraneHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconateSigma-AldrichG4500
Kinematic fluorescence filter cubeThorLabsDFM1T1
LED driverThorLabsLEDD1B
Lidocaine ointmentTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro drillHarvard Apparatus75-1887
Microelectrode pullerSutter instrumentsP-87
Microinjection syringeHamilton7634-01/00
Microinjection syringe needleHamilton7803-05Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pumpWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Mounted blue LEDThorLabsM470L5
Mounted green LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT mediumVWR InternationalRAYLLAMB/OCTOptimal cutting temperature medium
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Patch clamp amplifierMolecular Devices700A
Peristaltic pumpWorld Precision InstrumentsMinistar
Poly-L-lysine coated microscope slidesFisher Scientific Ltd23-769-310
Recording chamberWarner InstrumentsRC-26G
Scalpel bladeSwann Morton#24
Slice anchorWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Stereotaxic frameKopfModel 902
Stereotaxic holder for micro drillHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Surgical MicroscopeCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Syringe filter for intracellular recording solutionThermo Scientific Nalgene171-0020
Tetrodotoxin citrateHello BioHB1035
Transfer pipettesFisher Scientific Ltd10458842

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
  3. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174(2019).
  4. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).
  5. Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
  6. Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
  7. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  8. van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
  9. Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  12. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  13. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  14. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
  15. Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  16. Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
  17. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  18. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  19. Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
  20. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  21. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
  22. Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
  23. Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
  24. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  25. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
  26. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  27. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  29. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  30. Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310(2013).
  32. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  33. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  34. Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6(2020).
  35. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
  36. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
  37. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  38. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  39. Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
  40. Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
  41. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetische stimulatiepatchclamp registratiesynaptische plasticiteitvirale injectieacute hersensnedenchannelrhopsine expressiebiocytine labeling

Gerelateerde artikelen