Methodenartikel

Een onontkoombaar protocol voor blootstelling aan kattengeur voor het bestuderen van aangeboren en contextuele dreigingsconditionering bij ratten

DOI:

10.3791/63078

⸱

10 november 2021

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Instituto de Ciencias Sociales, Universidad de O'Higgins, 3Department of Psychology, University of Arizona, Tucson, 4Escuela de Psicología, Universidad Católica del Norte, 5Laboratorio de Neurociencia Afectiva, Facultad de Psicología, Universidad del Desarrollo

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blootstelling aan huid/vachtgeur bij katten biedt een betrouwbare methode om neurale circuits en mechanismen van verdedigingsreacties bij knaagdieren te onderzoeken en kan inzicht bieden in mechanismen die angst bij mensen bemiddelen. Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoeken van de rol van de interoceptieve cortex in bedreigingsreacties bij ratten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieren reageren op bedreigende situaties door een aantal defensieve gedragingen te vertonen, waaronder vermijding, bevriezing en risicobeoordeling. Een diermodel met een ethologische insteek biedt een dieper inzicht in de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan dreigingsreacties. Dit artikel beschrijft een methodologie om defensief gedrag te meten ten opzichte van zowel aangeboren als aangeleerde aversieve stimuli bij ratten. Dieren werden individueel blootgesteld aan de geur van roofdieren in een onontkoombare kamer om een meetbare, aanhoudende, defensieve toestand op te wekken. Het experimentele ontwerp omvatte het plaatsen van een rat in een bekende kamer gedurende 10 minuten, gevolgd door blootstelling aan kattengeur gedurende nog eens 10 minuten in dezelfde context. De volgende dag werden de ratten gedurende 10 minuten opnieuw blootgesteld aan dezelfde contextkamer waar blootstelling aan kattengeur plaatsvond. Sessies werden op video opgenomen en op beide dagen werd defensief gedrag beoordeeld.

De gedragstest werd gekoppeld aan reversibele functionele inactivatie en c-Fos immunohistochemie technieken om de rol van de interoceptieve cortex in dreigingsreacties te bepalen. Ratten die op de eerste dag werden blootgesteld aan kattengeur en op de tweede dag opnieuw werden blootgesteld aan de contextkamer, vertoonden hogere niveaus van defensief gedrag, en die kattengeur veroorzaakte een robuuste toename van de neurale activiteit van de interoceptieve cortex. Bovendien verminderde muscimol-inactivatie van de interoceptieve cortex de expressie van defensief gedrag als reactie op kattengeur en een verminderd contextueel dreigingsgeheugen. Deze resultaten tonen aan dat deze gedragstest een nuttig hulpmiddel is voor het bestuderen van neurale mechanismen van defensief gedrag en inzicht kan bieden in mechanismen die angst bij mensen en de daarmee samenhangende stoornissen bemiddelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Defensief gedrag treedt op als reactie op stimuli die wijzen op een potentiële bedreiging voor het voortbestaan van een dier. Dit gedrag is sterk geconserveerd bij zoogdieren en wordt snel geassocieerd met stimuli of omstandigheden die verband houden met dreiging 1,2,3. In de natuur zijn de bedreigende prikkels voor de meeste dieren roofdieren; Daarom is de detectie van roofdiersignalen, zoals geursignalen, bijzonder voordelig om predatie te voorkomen. Gedragsreacties op signalen van roofdieren zijn uitgebreid onderzocht bij knaagdieren.

Prikkels, zoals natuurlijke kattenvacht of huidgeuren, activeren bijvoorbeeld het reuk- en het vomeronasale systeem, waardoor een hoog niveau van defensief gedrag wordt geïnduceerd4. Deze stimuli gaan gepaard met veranderingen in neuronale en endocriene activiteit 5,6,7,8, en het zijn sterke, ongeconditioneerde, aversieve stimuli voor contextuele dreigingsconditionering bij ratten 7,8,9,10,11. Studies hebben aangetoond dat ratten ten minste 24 uur na blootstelling aan signalen van natuurlijke roofdieren robuuste en langdurige geconditioneerde angstachtige toestanden vertonen 7,12,13. Dit fenomeen is van bijzonder belang voor het ontwikkelen van meer realistische modellen van posttraumatische stressstoornis (PTSS)14,15,16,17, gegeneraliseerde angststoornis (GAD)5 en paniekstoornis (PD)18,19.

In laboratoriumomgevingen wordt angstgedrag gemeten als vluchten, vermijden (bijv. terugtrekken, verstoppen) of bevriezen. Bovendien kan angst worden gemeten als rekhoudingen en waakzaam scannen gericht op het monitoren van een roofzuchtige stimulus - een reeks reacties die algemeen bekend staat als risicobeoordelingsgedrag 6,9,20. Studies hebben aangetoond dat bevriezingsgedrag de overheersende verdedigingsstrategie is bij ratten tegen een onontkoombare bedreiging, terwijl risicobeoordeling wordt waargenomen wanneer de dreiging dubbelzinnig of niet-gelokaliseerd is 12,21,32. Hoewel bekend is dat een aangeboren of aangeleerde stimulus defensief gedrag kan uitlokken, is er een gebrek aan laboratoriumgedragsparadigma's die defensieve reacties op betrouwbare wijze vastleggen in een meer ethologische context. Om deze leemte op te vullen, hebben we een protocol ontworpen met een ethologische benadering die het mogelijk maakt om aanhoudend aangeboren en contextueel bedreigingsgedrag te meten, samen met hersenreacties op naturalistische bedreigingsstimuli.

Stressvolle ervaringen, zoals blootstelling aan een onontkoombare roofdiergeur, veroorzaken blijvende veranderingen in gedrags- en fysiologische respons bij ratten 14,22,23. Deze veranderingen weerspiegelen het symptoomprofiel dat wordt waargenomen bij angst- en angstgerelateerde stoornissen zoals PTSS. In het huidige model wordt een testkamer gebruikt zonder een veilige schuilplaats om ratten bloot te stellen aan een onontkoombare dreiging en zo de defensieve reacties te verbeteren. Ratten vertoonden robuust bevriezings- en risicobeoordelingsgedrag als reactie op zowel kattengeur als de testcontext. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van dit protocol als een betrouwbare en valide methode voor het onderzoeken van biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan defensief gedrag en het ontwikkelen en verfijnen van nieuwe strategieën voor de behandeling van angststoornissen bij mensen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de institutionele richtlijnen van de National Institutes of Health (USA) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publicatie nr. 80-23, herzien in 1996). Het Institutioneel Comité voor Bioveiligheid en Ethiek van de Pontificia Universidad Católica de Chile keurde alle procedures goed. Alle experimentele sessies werden uitgevoerd tijdens de actieve fase van de rat (donkere fase).

1. Voorbereiding van de testruimte en de testkamer

OPMERKING: Het overzicht van het apparaat wordt weergegeven in figuur 1. De testkamer is ontwikkeld en aangepast volgens eerdere studies24,25.

  1. Gebruik een transparante, rechthoekige testkamer van poly (methylmethacrylaat) met de volgende afmetingen: 60 cm (lengte) x 40 cm (breedte) x 40 cm (hoogte). Bedek de zij- en achterwanden van de testkamer met zwart papier. Zorg ervoor dat de voorkant van de testkamer transparant is om het gedrag van de dieren vast te leggen.
  2. Bevestig een stalen beugel aan de vloer in de rechterbenedenhoek van de testkamer en gebruik deze om de kattenhalsbanden voor de testprocedures te bevestigen.
  3. Reinig de testkamer met 5% (v/v) ethanol voor en na de tests om eventuele geuraanwijzingen van de proefratten te verwijderen en de aversiereactie van de rat te voorkomen. Wacht 5 minuten tussen elke sessie totdat de ethanol volledig is verdampt.
  4. Voer de testsessie uit in een rustige ruimte die slecht verlicht is door een rode gloeilamp van 80 W die zich 20 cm boven de testkamer bevindt. Gebruik een videocamera die zich voor de kamer bevindt om het gedrag van de dieren vast te leggen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de testkamer. Het apparaat bestaat uit een testcompartiment met: (1) ventilatieopeningen, (2) zij- en (3) verduisterde achterwanden, en een stalen beugel vergrendeld op de linkerhoekvloer (4) om de kattenhalsband te bevestigen (afmetingen: breedte 15 mm, dikte 5 mm, lengte 300 mm). De afmetingen van de kamer zijn aangegeven op de cartoon (60 L x 40 B x 40 H cm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbereiding op kattengeur

  1. Zorg voor een kattenhalsband met een met vilt beklede binnenkant om de kattengeur beter vast te houden. Zorg ervoor dat er meerdere halsbanden beschikbaar zijn voor gebruik als controlehalsband (geen geur) of testhalsband (kattengeur).
    OPMERKING: Het cruciale punt is dat de kattenhalsband een binnenvoering moet hebben voor het opvangen en opvangen van geuren.
  2. Doe een halsband om een huiskat die ovariëctomie heeft ondergaan en laat de kat de halsband een week dragen voordat u gaat testen. Probeer de poes binnen te houden terwijl u de testhalsband draagt.
    OPMERKING: Gebruik tijdens het hele onderzoek dezelfde kat.
  3. Bewaar de versleten kattenhalsband in een luchtdichte plastic container en bewaar deze bij 4 °C. Vervang de versleten kattenhalsband om de drie dagen door een halsband met een frisse kattengeur.

3. Ratten voorbereiden op de experimentele procedure

  1. Gebruik volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten die 270-290 g wegen. Huisvesting ze in individuele kooien met voer en water beschikbaar ad libitum.
  2. [Optioneel] Ratten voorbereiden op een chirurgische ingreep (optioneel)
    1. Voer de operatie uit onder steriele omstandigheden. Reinig en desinfecteer het werkgebied met een oplossing van 70% ethanol en steriliseer alle chirurgische materialen en instrumenten.
    2. Verdoof de rat met een intraperitoneaal mengsel van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (20 mg/kg). Wacht tot het juiste vlak van anesthesie is bereikt wanneer de rat niet reageert op een teenknijpstimulus of hoornvliesstimulatie. Om de verdoving tijdens de operatie te behouden, dient u elke 45 minuten een extra dosis van de verdovingscocktail toe.
    3. Scheer de kop van de rat voorzichtig van achter het oor tot tussen de ogen en desinfecteer het operatiegebied met een steriel alcoholbereidingskussen gevolgd door een povidon-jodiumoplossing. Breng smeermiddel oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de chirurgische ingreep te voorkomen.
    4. Plaats de rat in een stereotactisch apparaat en houd de kop vast door de oorstangen goed in de gehoorgangen te plaatsen. Steek vervolgens voorzichtig de snijtanden van de rat in de snijstang en zet de neusklem vast.
    5. Plaats een steriele roestvrijstalen geleidecanule van 26 G in de stereotactische houder. Neem een scalpel en maak een incisie in de middellijn langs de hoofdhuid. Plaats 2 of meer klemmen rond de incisie (2-3 cm).
    6. Maak de schedel volledig vrij van weefsel totdat zowel de bregma- als de lambdaschedelnaden zichtbaar zijn.
    7. Controleer de symmetrische positionering van het hoofd door de uitlijning van de dorsoventrale en anteroposterieure as van de schedel met behulp van respectievelijk de snijtand en de oorstangen. Identificeer de coördinaten van de geleidecanule voor het interessegebied van de hersenen. Houd de bregma en lambda in hetzelfde horizontale vlak met behulp van de snijtand.
    8. Bereken de coördinaten van de implantatieplaats van de geleidecanule in het interessegebied volgens de stereotactische coördinaten van Paxinos en Watson26 of Swanson-atlas27.
      OPMERKING: Voor de primaire interoceptieve insulaire cortex werden de volgende stereotactische coördinaten gebruikt: Bregma -0,51 mm, middellijn 5,0 mm, diepte vanaf het schedeloppervlak 4,5 mm, mediaal 10° schuin ten opzichte van verticaal.
    9. Controleer de implantatiecoördinaten van de geleidecanule door deze naar beneden te brengen totdat deze de schedel raakt en boor vervolgens een gat door de schedel op de geverifieerde site. Boor 3 extra gaten rond het doelgebied om 3 schroeven in de schedel te plaatsen.
    10. Steek de canule in het interessegebied van de hersenen en gebruik schroeven en tandheelkundig acryl om de canule aan de schedel te verankeren. Giet tandheelkundig acryl op de droge schedel en zorg ervoor dat deze de schroeven afdekt om de canule op zijn plaats te bevestigen. Laat de acryltandheelkunde uitharden en verwijder vervolgens voorzichtig de stereotactische arm, waarbij u de geleidecanule op zijn plaats laat.
      OPMERKING: Deze procedure immobiliseert de geïmplanteerde canule en stelt onderzoekers in staat om meerdere micro-injecties uit te voeren in het interessegebied.
    11. Steek een roestvrijstalen stilet in de geleidecanule om obstructie en vervuiling te voorkomen.
    12. Aan het einde van de operatie dient u een enkele dosis antibioticum (enrofloxacine 5%; 19 mg/kg i.p.) en ontstekingsremmend (ketophen 0,2 mg/kg i.p.) toe. Herhaal deze stap gedurende drie opeenvolgende dagen na de operatie.
    13. Laat de ratten ten minste een week volledig herstellen voordat u met de experimenten begint.
  3. Houd de ratten gedurende ten minste tien dagen voor het begin van de experimenten in een omgekeerde licht/donkercyclus van 12/12 uur (lichten aan om 19.00 uur) (Figuur 2).
    OPMERKING: Als de onderzoeker een chirurgische ingreep moet uitvoeren, moet deze worden uitgevoerd voordat de donker-lichtcyclus wordt omgekeerd. Dit zorgt voor een vermindering van stress na de operatie.
  4. Behandel alle ratten gedurende 20 minuten per dag gedurende 2-3 dagen. Neem één rat tegelijk, houd het dier stevig vast bij de romp (niet bij de staart) en aai ze gedurende deze tijd. Als dieren tekenen van stress vertonen, behandel ze dan voor langere tijd.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om de hanteringsstress te minimaliseren die van invloed kan zijn op de volgende stappen.
  5. Stel de dieren gedurende drie dagen vóór de experimenten 30 minuten per dag bloot aan de testkamer (kattengeurkamer met een ongedragen kattenhalsband) om de dieren te laten wennen aan de testcontext.
    OPMERKING: Er wordt gesuggereerd dat de onderzoeker geen geparfumeerde parfums of lotions draagt.
  6. Nadat u het dier in de kamer hebt geplaatst, wacht u ongeveer 10-15 minuten, steekt u een arm in de testkamer en verwisselt u de kattenhalsband voor een andere kattenhalsband met dezelfde kenmerken.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om elke stap van de gedragsprocedures zo nauwkeurig mogelijk te simuleren om stress te minimaliseren, die de gedragsprestaties van de rat in de laatste 10 minuten van de test kan beïnvloeden.
  7. Reinig de testkamer met 5% (v/v) ethanol tussen de sessies door.

figure-protocol-2
Figuur 2: Tijdlijn van het experimentele ontwerp. Ratten werden gedurende 10 dagen blootgesteld aan een omgekeerde donkerlichtcyclus en vervolgens gewenning aan de testkamer met een (niet-gedragen) controlekattenhalsband gedurende 30 minuten gedurende de laatste drie dagen. Op dag 0 werden ratten eerst gedurende 10 minuten blootgesteld aan een vertrouwde testkamer (CONTEXT) en vervolgens gedurende een extra periode van 10 minuten (TEST) in dezelfde context blootgesteld aan een halsband met of zonder kattengeur. Op dag 1 werden ratten die op dag 0 werden blootgesteld aan kattengeur (TEST) teruggebracht naar dezelfde testkamer gedurende 10 minuten (CONTEXT) en opnieuw blootgesteld aan kattengeur (RETEST) voor een extra periode van 10 minuten. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Afkorting: R-Dark/light = omgekeerde donker-lichtcyclus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Testprocedures voor kattengeur

  1. Beoordeel op dag 0 van het experimentele protocol de dreigingsreacties op de kattengeur.
  2. Indien nodig corticale injecties toedienen vóór de gedragstests volgens de hieronder beschreven methode. Als u alleen een gedragsprotocol uitvoert, slaat u deze stap over en gaat u verder met stap 4.3.
    1. Breng een steriele injectiecanule van 33 G gekoppeld aan een Hamilton-spuit van 1 μl in de geleidecanule nadat u de afsluiter hebt verwijderd.
    2. Vul de Hamilton-spuit met steriele zoutoplossing (controleratten) of de GABA-A-receptoragonist, muscimol (behandelingsratten), en injecteer 0,5 μl/hemisfeer gedurende 2 minuten. Wacht 2 minuten om diffusie van het geneesmiddel mogelijk te maken, verwijder langzaam de injectiecanule en breng onmiddellijk de occluders in.
      OPMERKING: Voer deze stap uit bij een rustig, wakker dier en injecteer de medicijnen langzaam om jitter van de injectiecanule en de daaruit voortvloeiende diffusie naar aangrenzende hersengebieden te minimaliseren.
    3. Zodra de corticale injectie/hemisfeer is voltooid, wacht u 30 minuten en gaat u verder met de volgende stap.
  3. Plaats de dieren 20 minuten in de testkamer. Stel de dieren de eerste 10 minuten bloot aan een ongedragen vertrouwde halsband. Breng de halsband geïmpregneerd met kattengeur (TEST) of een ongedragen vertrouwde halsband (CONTEXT) gedurende de volgende 10 minuten (Figuur 3).

figure-protocol-3
Figuur 3: Het tegenkomen van kattengeur verhoogt het aangeboren verdedigingsgedrag. (A, B) Ratten werden eerst gedurende 10 minuten blootgesteld aan de bekende testkamer (CONTEXT) en vervolgens blootgesteld aan een halsband met kattengeur (kattengeurgroep, zwarte cirkels) of zonder kattengeur (geurvrije groep, open cirkels) gedurende een extra periode van 10 minuten (TEST) in dezelfde context. De cirkels tonen het percentage van de tijd doorgebracht in bevriezing (B) en risicobeoordeling (C) van naïeve ratten. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden +SEM. *p < 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Plaats een videocamera voor de testkamer en registreer het gedrag van het dier voor latere gedragsscores door een onderzoeker die blind is voor de experimentele omstandigheden.
  2. Aan het einde van de kattengeursessie brengt u de dieren terug naar hun thuiskooien en plaatst u ze terug in de dierenopvang tot de volgende sessie.
  3. Reinig de testkamer met 5% (v/v) ethanol tussen de sessies door.
  4. Vierentwintig uur na de kattengeursessie (dag 1) beoordeelt u de defensieve reacties op de testcontext.
  5. Herhaal indien nodig stap 4.2 vóór blootstelling aan de context.
  6. Breng de ratten terug naar dezelfde testkamer met de niet-gedragen vertrouwde halsband en scoor voor defensief gedrag om het contextuele bedreigingsgeheugen gedurende 10 minuten te meten (Figuur 4).
  7. Plaats een videocamera voor de testkamer en registreer het gedrag van het dier voor latere gedragsscores door een onderzoeker die blind is voor de experimentele omstandigheden.
  8. Vervang gedurende de volgende 10 minuten de ongedragen vertrouwde halsband, stel het dier opnieuw bloot aan een halsband met kattengeur en meet defensief gedrag.
  9. Na de tweede blootstelling aan kattengeur, brengt u het dier terug naar zijn thuiskooi en reinigt u de testkamer met 5% (v/v) ethanol. Zet de rat terug in de dierenfaciliteit.

figure-protocol-4
Figuur 4: Ontmoeting met kattengeur induceert contextueel leren over bedreigingen. De cirkels tonen het percentage van de tijd dat wordt doorgebracht in bevriezing (zwarte cirkels) en het risicobeoordelingsgedrag (grijze cirkels). De stippellijn scheidt de aangeboren angsttest (dag 0, links) van de contextuele angsttest (dag 1, rechts). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden + SEM. *p < 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Immunohistochemische procedures

  1. Verdoof het dier met een intraperitoneaal mengsel van ketamine (0,45 mg/kg) en xylazine (0,05 mg/kg) 90 minuten na voltooiing van de experimenten. Euthanaseer vervolgens de rat door transcardiale perfusie met 4% paraformaldehyde.
    OPMERKING: Als het nodig is om de eerste blootstelling aan kattengeur, geconditioneerde reactie op de context of hernieuwde blootstelling aan kattengeur te evalueren, voer deze stap dan uit na elk van deze experimentele situaties. Draag handschoenen en laboratoriumjas en ga voorzichtig om met paraformaldehyde onder een chemische zuurkast.
  2. Fixeer de hersenen na perfusie gedurende 2 uur in dezelfde fixerende oplossing en breng deze vervolgens over op 30% sucrose met 0,02% natriumazide in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) totdat de hersenen naar de bodem zinken. Bewaar de hersenen bij 4 °C.
  3. Bevries de hersenen met behulp van droogijs en snijd ze in 50 μm dikke seriële coronale secties op een glijdende microtoom. Verzamel drie sets hersensecties van het interessegebied, één voor verificatie van de plaatsing van de canule en twee sets voor de immunohistochemische procedure.
  4. Incubeer de vrij zwevende hersensecties in 0,3% H2O2 in PBS gedurende 30 min, was ze in PBS en breng deze secties over naar de blokkerende (0,4% Triton X-100, 0,02% natriumazide, 3% normaal geitenserum in PBS) oplossing gedurende 1 uur.
  5. Breng de secties over naar de primaire antilichaamincubatieoplossing die c-Fos-antilichaam bevat, verdund 1:20.000 in blokkeeroplossing en laat ze een nacht bij kamertemperatuur staan.
  6. Spoel de secties gedurende 1 uur in PBS en incubeer ze vervolgens in de secundaire antilichaamoplossing verdund 1:1.000 in 0,4% Triton X-100 en 1,5% normaal geitenserum in PBS.
  7. Spoel de secties gedurende 40 minuten en incubeer ze gedurende 1 uur in het peroxidasesysteem op basis van avidine/biotine (zie de materiaaltabel), verdund 1:500 in PBS.
  8. Spoel en incubeer de secties in een 0,05% oplossing van 3-3′ diaminobenzidinehydrochloride (DAB) met 0,003% H2O2 en 0,05% nikkelchloride om een donkerblauw reactieproduct te verkrijgen.

6. Cellen tellen

  1. Onderzoek secties onder een camera lucida met behulp van een objectief met een laag vermogen (10x) om de c-Fos punctiforme kleuring in de kernen van neuronen te lokaliseren (Figuur 5).
  2. Gebruik een telraster dat is gerelateerd aan de grootte van het interessegebied. Gebruik voor de pIC, bijvoorbeeld van Bregma 0,95 tot -0,26, een telraster van 0,25 mm x 1 mm; van Bregma -0,51 tot -2,45 mm, gebruik een telrooster van 0,5 mm x 1 mm.
  3. Kwantificeer het aantal c-Fos immunoreactieve (Fos-ir) cellen per sectie met behulp van een handmatige cijferteller.
  4. Tel alle coronale secties van belang twee keer en zorg ervoor dat dezelfde waarnemer, blind voor de experimentele omstandigheden, de telling uitvoert.
  5. Maak een foto met een microscoop in combinatie met een digitale camera.

figure-protocol-5
Figuur 5: Kattengeur lokt neuronale activering uit in de primaire interoceptieve cortex. (A) Representatieve microfoto van de pIC die een bijna afwezigheid van c-Fos-ir-cellen (zwarte pijlpunten) laat zien bij ratten die zijn blootgesteld aan een niet-gedragen kattenhalsband (geen geur, links) vergeleken met een opmerkelijk verhoogd aantal c-Fos-ir-cellen bij ratten die zijn blootgesteld aan kattengeur (rechts). (B) Kwantificering van c-Fos-ir-cellen in de pIC in beide experimentele omstandigheden. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden + SEM. *p < 0,05. Schaalbalken = 200 μm. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Afkortingen: pIC = primaire interoceptieve cortex; c-fos-ir = c-fos-immunoreactief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Gegevensanalyse

  1. Scoor defensief gedrag van de op video opgenomen experimenten en analyseer ze met behulp van statistische software.
  2. Evalueer bevriezing door periodes te timen, uitgedrukt als een percentage van de tijd die gedurende 10 minuten aan bevriezing is besteed. Bereken het percentage bevriezing met behulp van Eq (1).
    Bevriezen = (seconden bevriezen/600 s) × 100 (1)
    OPMERKING: Bevriezing werd gedefinieerd als het volledige gebrek aan beweging, met uitzondering van ademhaling gedurende ten minste 1 s28.
  3. Scoor risicobeoordeling door waakzame scanperiodes te timen en druk dit uit als een percentage van de tijd die gedurende 10 minuten aan risicobeoordeling wordt besteed. Bereken het percentage van de risicobeoordeling met behulp van Eq (2).
    % Risicobeoordeling = (seconden besteed aan risicobeoordeling/600 s) × 100 (2)
    OPMERKING: Risicobeoordelingsgedrag werd gedefinieerd als waakzaam scannen (observatorium, zijwaartse hoofdbewegingen, zonder locomotie) gedurende ten minste 1 s29.
  4. Scoor deze gedragsparameters handmatig en zorg ervoor dat ze worden geteld door een onderzoeker die blind is voor de experimentele omstandigheden (d.w.z. geur- en medicijnaandoeningen). Afhankelijk van de normaliteit van de datasets, kunt u parametrische of niet-parametrische tests gebruiken om twee of meer groepen te vergelijken.
    OPMERKING: In dit onderzoek zijn alle statistische tests uitgevoerd met behulp van SPSS-software.
    1. Gebruik de Kruskal-Wallis H-test met de Mann-Whitney U-test voor paarsgewijze vergelijkingen tussen groepen.
    2. Analyseer vergelijkingen binnen de groep in de loop van de tijd met de Friedman-test gevolgd door de Wilcoxon-signed-rank-test voor paarsgewijze vergelijkingen.
      OPMERKING: In alle figuren werden de significantieniveaus ingesteld op p < 0,05 (*) en p < 0,01 (**).
  5. Voor de analyse van c-Fos-expressie in specifieke hersengebieden, telt u het aantal c-Fos-positieve cellen per sectie door de dichtheid van c-Fos-ir-cellen per mm2 te berekenen en vergelijkt u het gemiddelde aantal tussen controle- (geen geur) en gestimuleerde (kattengeur) omstandigheden.
    1. Afhankelijk van de normaliteit van de gegevens, gebruikt u de t-toets van de ongepaarde student of de Mann-Whitney U-toets.
      OPMERKING: In dit onderzoek werd de Mann-Whitney U-test gebruikt; Verschillen werden als significant beschouwd als p < 0,05 (*).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werden de bevriezings- en risicobeoordelingspercentages gemeten als indicatoren van respectievelijk angst- en angstachtige toestanden bij ratten. De tijdlijn van het experimentele ontwerp wordt weergegeven in figuur 2. De resultaten van de dieren die op dag 0 aan kattengeur zijn blootgesteld, worden weergegeven in figuur 3. Ratten vertoonden significant hogere niveaus van bevriezing (Figuur 2A, Cat Odor-groep, Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -2.201, p = 0.028) en risicobeoordeling (Figuur 2B, Cat Odor-groep, Wilcoxon Signed-ranks-test Z = -2.336 p = 0.018) als reactie op kattengeur (TEST) dan op vertrouwde context (CONTEXT). Lage niveaus van bevriezing (Figuur 2A, no-odor groep, Wilcoxon Signed-ranks test, Z = -0,184, p = 0,854) en risicobeoordeling (Figuur 2B, no-odor groep, Wilcoxon Signed-ranks test, Z = -1,753, p = 0,08) werden waargenomen bij ratten die tijdens het tweede deel van de test werden blootgesteld aan een ongedragen halsband.

Aanvullende analyse toonde aan dat de niveaus van bevriezing (Figuur 2A, Mann-Whitney-test, U = 0,000, p = 0,004) en risicobeoordeling (Figuur 2B, Mann-Whitney-test, U = 4,000, p = 0,025) hoger waren in de Cat Odor-groep dan in de geen-geurgroep tijdens het tweede deel van de test. Er waren geen significante verschillen in bevriezing (Figuur 2A, Mann-Whitney-test, U = 11.000, p = 0,256) en risicobeoordeling (Figuur 2B, Mann-Whitney-test, U = 15,00, p = 0,627) tussen de twee groepen tijdens de eerste 10 minuten van blootstelling aan een vertrouwde context (CONTEXT). Deze resultaten tonen aan dat het protocol geschikt is voor het testen van defensief gedrag als reactie op kattenvacht/huidgeur.

De geconditioneerde dreigingsrespons op de testcontext (CONTEXT) op dag 1 wordt weergegeven in figuur 4. Ratten die werden blootgesteld aan kattengeur werden 24 uur na de eerste ontmoeting met de geur van het roofdier teruggebracht naar de testkamer. Op dag 1 vertoonden de dieren hogere niveaus van bevriezing (Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -2.366, p = 0.018) en risicobeoordeling (Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -2.201, p = 0.028) als reactie op de testcontext dan op dag 0. Bovendien waren er geen verschillen in bevriezing (Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -0,841, p = 0,400) of risicobeoordeling (Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -0,943, p = 0,345) niveaus tussen CONTEXT en RETEST. De ratten vertoonden dezelfde vriesniveaus (Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -0,105, p = 0,917) en risicobeoordeling (Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -0,980, p = 0,327) tijdens RETEST en TEST. Deze resultaten toonden aan dat een enkele blootstelling van 10 minuten aan kattenvacht/huidgeur resulteerde in een aangeleerde dreigingsreactie op de context waarin de dieren werden geconfronteerd met roofdiergeur.

Figuur 5 en Figuur 6 tonen twee reeksen experimenten met behulp van het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd. We hebben getest of de primaire interoceptieve cortex (pIC), een hersengebied dat betrokken is bij emotieverwerking 8,30,31,32, nodig is voor de expressie van defensief gedrag. Door kattengeur geïnduceerde neuronale activering werd beoordeeld in de pIC door c-Fos-ir-cellen te tellen in gescheiden diergroepen: geen geur en kattengeuromstandigheden. Deze ratten werden 90 minuten na voltooiing van de TEST geëuthanaseerd. Er werd een significante toename waargenomen van het aantal c-Fos-ir-neuronen in de pIC in de kattengeurgroep (Mann-Whitney-test, U = 3.000, p = 0.016) in vergelijking met de controlegroep (Figuur 5).

figure-results-1
Figuur 6: Muscimol-inactivatie van de primaire interoceptieve cortex schaadt het contextuele bedreigingsgeheugen. (EEN, TER) De behandelingsgroep werd geïnjecteerd met zoutoplossing op dag 0 en muscimol op dag 1 in de pIC (behandelingsgroep). Controleratten werden op beide dagen geïnjecteerd met zoutoplossing in de pIC. Op dag 1 werden de dieren teruggebracht naar de vertrouwde testkamer en gedurende 10 minuten blootgesteld aan de CONTEXT en opnieuw blootgesteld aan kattengeur (RETEST) voor een extra periode van 10 minuten. De cirkels tonen het percentage van de tijd dat wordt doorgebracht in bevriezing (zwarte cirkels) en risicobeoordelingsgedrag (open cirkels). De stippellijn scheidt de aangeboren angsttest (dag 0, links) van de contextuele angsttest (dag 1, rechts). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden + SEM. *p < 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van 8. Afkortingen: pIC = primaire interoceptieve cortex; Sal-Sal = zoutoplossing geïnjecteerd op dag 0 en dag 1; Sal-Mus = zoutoplossing geïnjecteerd op dag 0 en muscimol op dag 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

We hebben ook het effect gemeten van muscimol-inactivatie van de pIC op het contextuele bedreigingsgeheugen (Figuur 6). De behandelde groep (sal-mus ratten) kreeg op dag 0 een injectie met zoutoplossing in de pIC en op dag 1 GABA-A-agonist muscimol. Deze groep dieren vertoonde geen verschillen in bevriezing (Figuur 6A, Wilcoxon Signed-ranks test, Z = -0,140, p = 0,889) of risicobeoordeling (Figuur 6B, Wilcoxon Signed-ranks test, Z = -0,700, p = 0,484) niveaus op dag 1 als reactie op de vertrouwde context in vergelijking met dag 0, wat wijst op een verslechtering van het contextuele dreigingsgeheugen. Interessant is dat bevriezing (Figuur 6A, Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -2.100, p = 0.036), maar niet risicobeoordeling (Figuur 6B, Wilcoxon Signed-ranks-test, Z = -0.980, p = 0.327), significant werd verminderd tijdens RETEST in vergelijking met TEST. Deze laatste bevinding geeft aan dat het uitschakelen van de pIC op dag 1 selectief de angst, maar niet de angst, reactie op de geur van het roofdier verminderde. Alles bij elkaar ondersteunen deze resultaten dat het hierboven beschreven experimentele protocol geschikt is voor de studie van aangeboren en aangeleerde defensieve reacties op roofzuchtige bedreigingen.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol biedt een innovatieve benadering om defensief gedrag te beoordelen dat wordt opgeroepen door aangeboren en aangeleerde aversieve stimuli. Een testkamer zonder een veilige schuilplaats (Figuur 1) en een halsband geïmpregneerd met huid-/vachtgeur van een eierstokjectomie van een vrouwelijke huiskat werden gebruikt om een sterke en aanhoudende dreigingstoestand bij ratten op te wekken die nuttig kan zijn om neurale circuits te onderzoeken die ten grondslag liggen aan adaptieve en onaangepaste verdedigingsreacties.

Het is algemeen bekend dat het vertonen van specifieke verdedigingsreacties afhangt van de kenmerken van zowel de dreigingsstimulus als de situatie/omgeving waarin het dier wordt aangetroffen21,33. Vermijding, risicobeoordeling en bevriezing maken deel uit van een enorm repertoire van afweerreacties van dieren die kunnen worden opgeroepen door dreigende stimuli 9,19. De selectie van de overheersende verdedigingsreactie hangt echter af van de omgevingsomstandigheden, zoals de afstand tot de dreiging33 of de aanwezigheid van een veilige plaats in de testkamer21,33. Wanneer ratten bijvoorbeeld in de arena worden geplaatst met een schuildoos, in de aanwezigheid van kattengeur, vertonen ze defensief gedrag zoals rekken / bijwonen houdingen, hoofd-uit-de-schuildoos en vermijding 6,24,25. Daarentegen worden bevriezingsgedrag, waakzaam scannen en rek-/aanwezigheidshoudingen sterk uitgelokt in situaties waarin ontsnappen niet mogelijk is en de afstand tot de dreiging niet al te kort is33,34.

Studies hebben aangetoond dat blootstelling aan een oncontroleerbare stressor een verscheidenheid aan gedragsgevolgen heeft die verschillen van die welke optreden wanneer de stressor beheersbaar is 35,36,37,38. Bijvoorbeeld, onontkoombare, maar niet ontkenbare, staartschok leidt tot grote verhogingen van serotonine in de dorsale raphe nucleus35 en angstachtig gedrag gemeten 24 uur na de aversieve ervaring36. Bovendien versterken oncontroleerbare stressoren de angstconditionering bij dieren 36,37 en mensen38. Onze aanvankelijke reden voor het ontwikkelen van het protocol was om ratten bloot te stellen aan een situatie waarin ze de aversieve stimulus niet kunnen beheersen, en daarom sterke en aanhoudende dreigingsreacties vertonen en verbeterd contextueel leren ontwikkelen na een enkele en korte blootstelling aan kattengeur.

In de experimentele opzet die hier wordt beschreven, riep de afwezigheid van een schuilplaats een sterke en aanhoudende defensieve toestand op die afwisselde tussen bevriezing (d.w.z. volledige immobiliteit behalve ademhaling28) en risicobeoordeling (d.w.z. waakzaam scannen en rek-/aanwezigheidshoudingen29), die meestal worden beschouwd als gedragsmanifestaties van respectievelijk angst en angstachtige toestanden bij knaagdieren (Figuur 3). Met name trad hetzelfde patroon van verdedigingsreacties 24 uur later op toen de ratten opnieuw werden blootgesteld aan de testcontext, wat aangeeft dat een enkele blootstelling van 10 minuten aan kattenvacht/huidgeur voldoende is om langdurig contextueel leren van bedreigingen te induceren, zoals eerder gerapporteerd 7,10,11,14,15,34,39 (Figuur 4).

Een kattenhalsband met een interne vilten voering werd gebruikt om geuren/geuren efficiënt te verzamelen en op te vangen en zo een betrouwbaar monster van de dreigingsstimulus te verkrijgen om een sterke defensieve reactie op te roepen. Onderzoekers hebben aversieve stimuli zoals kattenuitwerpselen, urine of trimethylthiazoline (TMT, een bestanddeel van vossenuitwerpselen) gebruikt in soortgelijk werk. Desalniettemin lijken deze stimuli minder voorspellend te zijn voor de onmiddellijke aanwezigheid van een roofdier, omdat ze minder goed in staat zijn om contextueel leren te induceren40,41. Volgens eerdere bevindingen 2,4,8,9,10,11,20,34,39 is kattengeur een betrouwbare aangeboren aversieve stimulus die aanhoudende verdedigingsreacties en contextueel bedreigingsgeheugen bij ratten kan veroorzaken. In de loop der jaren heeft dit soort ethologisch gedragsdiermodel steeds meer de interesse van onderzoekers gewekt om stress en stressgerelateerde stoornissen te bestuderen 13,14,15,16,17,23,42 zoals die geassocieerd met onaangepaste angstherinneringen zoals PTSS.

Dit protocol is bedoeld om te worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan experimentele technieken, waaronder bijvoorbeeld moleculaire en celbiologische benaderingen en elektrofysiologie bij wakkere en zich gedragende dieren, die de mogelijkheid bieden om open vragen te beantwoorden en ons begrip van adaptieve en onaangepaste dreigingsreacties te verbeteren. In deze studie hebben we het idee getest dat de pIC, een hersengebied dat betrokken is bij emotieverwerking, nodig is voor de expressie van defensief gedrag. Gedragsexperimenten werden gekoppeld aan c-Fos-immunohistochemie om patronen van neuronale activiteit in de pIC in kaart te brengen als reactie op kattengeur en intracerebrale infusies van de GABA-A-receptoragonist, muscimol, om de pIC omkeerbaar tot zwijgen te brengen en de betrokkenheid ervan bij aangeboren en aangeleerde dreigingsreacties op roofdiergeur te bepalen. Deze bevindingen toonden aan dat kattengeur een toename van de neuronale activiteit in de pIC opwekte (Figuur 5) en dat het uitschakelen van de pIC leidde tot een ernstig tekort aan contextueel dreigingsgeheugen (Figuur 6).

Hoewel het hier beschreven protocol technisch eenvoudig te implementeren en uit te voeren is, kunnen er enkele complicaties optreden. Er kan bijvoorbeeld kruisbesmetting met kattengeur optreden als de niet-gedragen halsband in contact komt met de gedragen kattenhalsband. Daarom moeten de halsbanden tijdens alle procedures apart worden gehouden en moeten de handschoenen worden vervangen nadat de gedragen halsband in de testkamer is geplaatst. Als de onderzoeker geur- en geurvrije omstandigheden wil uitvoeren met behulp van dezelfde testkamer, moeten de experimenten op verschillende dagen worden uitgevoerd. Voor deze experimenten kunnen twee identieke testkamers worden gebruikt34, en de ratten moeten in aparte kamers worden gehouden om sociale communicatie te vermijden43. De stress die wordt veroorzaakt door blootstelling aan nieuwe stimuli in onbekende omgevingen kan ook een probleem zijn. Daarom moeten de dieren ten minste drie dagen wennen aan de testomgeving en -procedures om de stress en afweerbaarheid die ratten in nieuwe situaties gewoonlijk vertonen, te verminderen. Bovendien moet de tijd die nodig is voor de gewenningsperiode langer zijn dan de testperiode. Als de test bijvoorbeeld 10 minuten duurt, moet 20 of 30 minuten worden toegewezen voor de gewenningsperiode.

Ten slotte moet defensief gedrag bij voorkeur worden geëvalueerd tijdens de donkere fase van de cyclus, wanneer ratten actief zijn. De ratten moeten onder een omgekeerde licht/donker-cyclus worden gehouden om de experimentele procedures te kunnen uitvoeren terwijl zowel de rat als de onderzoeker zich in hun actieve fase bevinden34. De verandering in de licht/donker-cyclus duurt niet langer dan 10 dagen om te herstellen, en op basis van ervaring reageren de meeste ratten onder deze aandoening adequaat op de kattengeur. Er zijn echter een paar onderzoeken die aantonen dat de Sprague-Dawley-ratten minder kwetsbaar zijn voor langdurige bedreigingsconditionering en angst dan Wistar-ratten44. Het is dus mogelijk dat het gebruik van Wistar-ratten in plaats van ratten van de Sprague-Dawley-stam robuustere resultaten zou kunnen opleveren.

Concluderend, kattengeur is een ethologisch relevante bedreigende stimulus die betrouwbare neuronale, endocriene en gedragsreacties bij ratten opwekt. De ontmoeting met kattengeur in een onontkoombare kamer leidt tot een robuuste en langdurige angst/angstreactie bij ratten, wat resulteert in snel en duurzaam leren van contextuele bedreigingen. Het hierboven beschreven protocol kan een nuttig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van angst en adaptieve en onaangepaste mechanismen voor het coderen van bedreigingsgeheugen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs van dit manuscript hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar voor Marcela Gonzalez voor het helpen met laboratoriumprocedures, Mabel Matamala voor het bijdragen aan het protocolontwerp en Miguel Rojas voor het helpen met illustratie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-3′ diaminobenzidine hydrochloride (DAB)Bio-RadColorimetrische blotting substraat; gebruikt met peroxidase-antilichaamconjugaat
Luchtdichte kunststof containercomercialGebruikt voor het bewaren van kattenhalsbanden
Kattenhalsbandcomercialafmetingen: breedte 1,5, dikte 0,5, lengte 30 cm
Kattengeruchdomestic catGestreppelde binnen-buiten vrouwelijke kat gevoerd met regulier commercieel kattenvoer.
Enrofloxacine 5%BayerAntibioticum (19mg/Kg i.p.). Gebruikt in het chirurgisch protocol.
EthanolSigma-Aldrich5% v/v voor het schoonmaken van de testbox
LeidingcanulesPlastic One26 gauge. Bestaat uit een draadgevormde cilindrische kunststof sokkel gevormd rond een stuk roestvrijstalen buis dat wordt geïmplanteerd in het specifieke doelgebied van de hersenen volgens stereotactische coördinaten.
Hamilton-spuitSigma-Aldrich1 uL. Gebruikt in het inactivatieprotocol
Waterstofperoxide 30%Merck MilliporeGebruikt in immunohistochemische procedure
InjectiecanulePlastic One33 gauge. Deze canule wordt in de leidingcanule gestoken om vloeistoffen in het specifieke doelgebied van de hersenen te doseren.
Ketamine (Imalgene)Rhodia MerieuxSedativum (100mg/Kg i.p.). Gebruikt in chirurgische en immunohistochemische protocollen
Ketoprofen 1%Rhodia MerieuxOntstekingsremmer (0,2mg/Kg i.p.). Gebruikt in het chirurgische protocol.
Mannelijke rattenUniversidad Catòlica de ChileSprague dawley-stam (270–290 g)
Mechaanse handtellerComercialGebruikt voor celtelling
MuscimolSigma-Aldrich0,5 ug/uL in het gelokaliseerde hersengebied
Normaal geitenserumLife TechnologiesGebruikt in immunohistochemische procedure
Occluder canulesPlastic OneGeplaatst in de leidingcanule om deze te verzegelen en de uitstroming van weefselvloeistof na injectie te voorkomen.
Paraformaldehyde poederSigma-AldrichGebruikt voor weefselfixatie
PBS 10x, pH 7.4Life TechnologiesGebruikt in immunohistochemische procedure
Primair antilichaamSigma, St LouisKonijnen polyklonaal F7799 gebruikt in immunohitochemische procedure
Rode gloeilamp (80 watt)CromptomGebruikt tijdens het gedragsprotocol
SchroevenPlastic OneGebruikt in het chirurgische protocol voor het verankeren van leidingcanules in de schedel
Secundair antilichaamJackson immunoresearchAnti-konijn IgG (H+L) gebruikt in immunohitochemische procedure
Steriele enkeldosiszoutoplossing 0,9%SalJet0,5 ug/uL in het gelokaliseerde hersengebied
NatriumaziedSigma-AldrichGebruikt in immunohistochemische procedure
SPSS voor WindowsIBMVersie 20.0. Software gebruikt voor statistische gegevensanalyse
Stereotaxis apparaatKopfGebruikt in het chirurgische protocol
Transparante rechthoekige Plexiglaskamergeassembleerd60 x 40 x 40 cm, L, B, H); transparante rechthoekige kamer van poly(methylmethacrylaat)
Triton X-100Merck MilliporeGebruikt in immunohistochemische procedure
Vectastain ABC Elite kitVector Laboratoriesavidine/biotine-gebaseerd peroxidasesysteem gebruikt voor de detectie van biotine-geconjugeerde secundaire antilichamen
VideocameraSonyGeef de voorkeur aan het gebruik van een nachtzichtcamera
Xylazin (Rompun)BayerSedativum (20mg/Kg i.p.). Gebruikt in chirurgische en immunohistochemische protocollen.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steimer, T. The biology of fear- and anxiety-related behaviors. Dialogues in Clinical Neuroscience. 4 (3), 231-249 (2002).
  2. Gross, C. T., Canteras, N. S. The many paths to fear. Nature Reviews. Neuroscience. 13 (9), 651-658 (2012).
  3. Harrison, L. A., Ahn, C., Adolphs, R. Exploring the structure of human defensive responses from judgments of threat scenarios. PLoS One. 10 (8), 0133682(2015).
  4. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  5. Blanchard, R. J., Griebel, G., Andrew Henrie, J., Blanchard, D. C. Differentiation of anxiolytic and panicolytic drugs by effects on rat and mouse defense test batteries. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 783-789 (1997).
  6. Dielenberg, R. A., McGregor, I. S. Defensive behavior in rats towards predatory odors: a review. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (7-8), 597-609 (2001).
  7. Muñoz-Abellan, C., Daviu, N., Rabasa, C., Nadal, R., Armario, A. Cat odor causes long-lasting contextual fear conditioning and increased pituitary-adrenal activation, without modifying anxiety. Hormones and Behavior. 56 (4), 465-471 (2009).
  8. Rodriguez, M., et al. Interoceptive insular cortex mediates both innate fear and contextual threat conditioning to predator odor. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 283(2020).
  9. Blanchard, R. J., Yang, M., Li, C. I., Gervacio, A., Blanchard, D. C. Cue and context conditioning of defensive behaviors to cat odor stimuli. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (7-8), 587-595 (2001).
  10. Takahashi, L. K., Chan, M. M., Pilar, M. L. Predator odor fear conditioning: current perspectives and new directions. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (7), 1218-1227 (2008).
  11. de Lima, M. A. X., Baldo, M. V. C., Canteras, N. S. Revealing a cortical circuit responsive to predatory threats and mediating contextual fear memory. Cerebral Cortex. 29 (7), 3074-3090 (2019).
  12. Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Defensive behaviors, fear and anxiety. Handbook of anxiety and Fear. Blanchard, R. J., Blanchard, D. C., Griebel, G., Nutt, D. J. , Elsevier Academic Press. Amsterdam. 63-76 (2008).
  13. Armario, A., Escorihuela, R. M., Nadal, R. Long-term neuroendocrine and behavioural effects of a single exposure to stress in adult animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (6), 1121-1135 (2008).
  14. Cohen, H., Matar, M. A., Joseph, Z. Animal models of posttraumatic stress. Preclinical models of neurologic and psychiatric disorders. Current Protocols in Neuroscience. 9, Chapter 9, Unit 9 45(2013).
  15. Liang, Z., King, J., Zhang, N. Neuroplasticity to a single-episode traumatic stress revealed by resting-state fMRI in awake rats. NeuroImage. 103, 485-491 (2014).
  16. Dengler, B. A., Hawksworth, S. A., Berardo, L., McDougall, I., Papanastassiou, A. M. Bilateral amygdala stimulation reduces avoidance behavior in a predator scent post-traumatic stress disorder model. Neurosurgical Focus. 45 (2), 16(2018).
  17. Ozbeyli, D., et al. Protective effects of vortioxetine in predator scent stress model of post-traumatic stress disorder in rats: role on neuroplasticity and apoptosis. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (4), 557-571 (2019).
  18. Graeff, F. G., Del-Ben, C. M. Neurobiology of panic disorder: From animal models to brain neuroimaging. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (7), 1326-1335 (2008).
  19. Blanchard, D. C., Griebelb, G., Pobbec, R., Blanchard, R. J. Risk assessment as an evolved threat detection and analysis process. Brain Research. 35 (4), 991-998 (2011).
  20. Apfelbach, R., Blanchard, C. D., Blanchard, R. J., Hayes, R. A., McGregor, I. S. The effects of predator odors in mammalian prey species: a review of field and laboratory studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (8), 1123-1144 (2005).
  21. Blanchard, D. C., Blanchard, R. J., Griebel, G. Defensive responses to predator threat in the rat and mouse. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8, Unit 8.19 (2005).
  22. Zoladz, P. R., Conrad, C. D., Fleshner, M., Diamond, D. M. Acute episodes of predator exposure in conjunction with chronic social instability as an animal model of post-traumatic stress disorder. Stress. 11 (4), 259-281 (2008).
  23. Shallcross, J., et al. The divergent effects of CDPPB and cannabidiol on fear extinction and anxiety in a predator scent stress model of PTSD in rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 91(2019).
  24. Dielenberg, R. A., Carrive, P., McGregor, I. S. The cardiovascular and behavioral response to cat odor in rats: unconditioned and conditioned effects. Brain Research. 897 (1), 228-237 (2001).
  25. Dielenberg, R. A., Leman, S., Carrive, P. Effect of dorsal periaqueductal gray lesions on cardiovascular and behavioral responses to cat odor exposure in rats. Behavioral Brain Research. 153 (2), 487-496 (2004).
  26. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
  27. Swanson, L. W. Brain maps: Structure of the rat brain. A laboratory guide with printed and electronic templates for data, models, and schematics. , Elsevier. (1998).
  28. Blanchard, R. J., Blanchard, D. C. Crouching as an index of fear. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 67 (3), 370-375 (1969).
  29. Choy, K. H. C., Yu, J., Hawkes, D., Mayorov, D. N. Analysis of vigilant scanning behavior in mice using two-point digital video tracking. Psychopharmacology. 221 (4), 649-657 (2012).
  30. Casanova, J. P., et al. A role for the interoceptive insular cortex in the consolidation of learned fear. Behavioral Brain Research. 296, 70-77 (2016).
  31. Casanova, J. P., Aguilar-Rivera, M., Rodriguez, M., Coleman, T. P., Torrealba, F. The activity of discrete sets of neurons in the posterior insula correlates with the behavioral expression and extinction of conditioned fear. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1906-1913 (2018).
  32. Contreras, M., Ceric, F., Torrealba, F. Inactivation of the interoceptive insula disrupts drug craving and malaise induced by lithium. Science. 318 (3850), 655-658 (2007).
  33. McNaughton, N., Corr, P. J. A two-dimensional neuropsychology of defense: fear/anxiety and defensive distance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 28 (3), 285-305 (2004).
  34. Blanchard, D. C., Canteras, N. S., Markham, C. M., Pentkowski, N. S., Blanchard, R. J. Lesions of structures showing FOS expression to cat presentation: effects on responsivity to a cat, cat odor and nonpredator threat. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (8), 1243-1253 (2005).
  35. Maswood, S., Barter, J. E., Watkins, L. R., Maier, S. F. Exposure to inescapable but not escapable shock increases extracellular levels of 5-HT in the dorsal raphe nucleus of the rat. Brain Research. 783 (1), 115-120 (1998).
  36. Maier, S. F., et al. The role of the amygdala and dorsal raphe nucleus in mediating the behavioral consequences of inescapable shock. Behavioral Neuroscience. 107 (2), 377(1993).
  37. Maier, S. F., Grahn, R. E., Watkins, L. R. 8-OH-DPAT microinjected in the region of the dorsal raphe nucleus blocks and reverses the enhancement of fear conditioning and interference with escape produced by exposure to inescapable shock. Behavioral Neuroscience. 109 (3), 404-412 (1995).
  38. Hartley, C. A., Gorun, A., Reddan, M. C., Ramirez, F., Phelps, E. A. Stressor controllability modulates fear extinction in humans. Neurobiology of Learning and Memory. 113, 149-156 (2014).
  39. Staples, L. G., Hunt, G. E., Cornish, J. L., McGregor, I. S. Neural activation during cat odor-induced conditioned fear and 'trial 2' fear in rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (8), 1265-1277 (2005).
  40. Blanchard, D. C., et al. Failure to produce conditioning with low-dose trimethylthiazoline or cat feces as unconditioned stimuli. Behavioral Neuroscience. 117 (2), 360-368 (2003).
  41. Rosen, J. B., Asok, A., Chakraborty, T. The smell of fear: innate threat of 2,5-dihydro-2,4,5-trimethylthiazoline, a single molecule component of a predator odor. Frontiers in Neuroscience. 9, 292(2015).
  42. Verbitsky, A., Dopfel, D., Zhang, N. Rodent models of post-traumatic stress disorder: behavioral assessment. Translational Psychiatry. 10 (1), 132(2020).
  43. Fendt, M., et al. Predator odor but not TMT induces 22-kHz ultrasonic vocalizations in rats that lead to defensive behaviors in conspecifics upon replay. Scientific Reports. 8, 11041(2018).
  44. Fragale, J. E., et al. Dysfunction in amygdala-prefrontal plasticity and extinction-resistant avoidance: A model for anxiety disorder vulnerability. Experimental Neurology. 275, 59-68 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Defensief gedragcontextuele dreigingsgeheugenroofdiergeurratgedraginteroceptieve cortexc Fos immunohistochemiemuscimol inactivatieangstconditionering
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen