Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63092

⸱

28 oktober 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In dit artikel

Samenvatting

Gedetailleerd protocol en drie Python-scripts zijn voorzien voor het bedienen van een open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem om semi-geautomatiseerde eiwitmonstervoorbereiding uit te voeren voor massaspectrometrie-experimenten, met betrekking tot wasmiddelverwijdering, eiwitvertering en peptide-ontzoutingsstappen.

Samenvatting

Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics-experimenten vereisen meerdere monstervoorbereidingsstappen, waaronder enzymatische eiwitvertering en -opruiming, die aanzienlijke persoonsuren bankarbeid kunnen kosten en een bron van batch-to-batch variabiliteit kunnen vormen. Laboratoriumautomatisering met pipetteerrobots kan handmatig werk verminderen, de doorvoer maximaliseren en de reproduceerbaarheid van onderzoek vergroten. Toch maken de hoge startprijzen van standaard automatiseringsstations ze onbetaalbaar voor veel academische laboratoria. Dit artikel beschrijft een proteomics monstervoorbereidingsworkflow met behulp van een betaalbaar, open-source automatiseringssysteem (The Opentrons OT-2), inclusief instructies voor het instellen van semi-geautomatiseerde eiwitreductie, alkylering, spijsvertering en opruimstappen; evenals bijbehorende open-source Python-scripts om het OT-2-systeem te programmeren via de application programming interface.

Inleiding

Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel om de overvloed aan vele eiwitten in biologische monsters tegelijkertijd te meten. Proteomics-experimenten met bioinformatica-analyse worden routinematig gebruikt om biomarkers te identificeren en geassocieerde biologische complexen en paden te ontdekken die ten grondslag liggen aan pathologische mechanismen. Met zijn hoge analytspecificiteit en potentiële kwantitatieve nauwkeurigheid heeft shotgun proteomics ook een uitstekend potentieel om te worden overgenomen door onderzoeksfaciliteiten en diagnostische laboratoria voor klinische monsteranalyse zonder de noodzaak om te vertrouwen op antilichamen1,2.

Om eiwitmonsters voor te bereiden voor shotgun proteomics-analyse, moeten eiwitten geëxtraheerd uit biologische monsters (bijv. Cellen en weefsels) meestal eerst worden verwerkt met behulp van lange protocollen, waaronder het meten van de eiwitconcentratie van het monster, eiwitreductie en alkylering, en enzymatische spijsvertering tot peptiden. Bovendien vereisen eiwitten die worden geëxtraheerd in gewone lysisbuffers die detergentia bevatten, vaak extra stappen van bufferuitwisseling of verwijdering van detergentia vóór de analyse, omdat detergent de trypsinevertering kan verstoren en de prestaties van downstream vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) -analyse aanzienlijk kan verslechteren3. Peptiden worden meestal verder ontzout, gedroogd en gereconstitueerd in LC-MS / MS-compatibele oplosmiddelen na enzymatische spijsvertering. Deze eiwitbiochemische procedures kunnen arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Zo blijven ze de doorvoer van proteomics-workflows beperken en dragen ze bij aan de variabiliteit van de verkregen gegevens4,5. Menselijke fouten en vooroordelen zijn erkend als cruciale factoren die van invloed zijn op de variantie en reproduceerbaarheid van gegevens6,7. Om menselijke fouten in de monstervoorbereidingsworkflows voor massaspectrometrie tot een minimum te beperken, zijn geautomatiseerde pipetteerrobotsystemen gebruikt om de doorvoer en reproduceerbaarheid van eiwitidentificatie en kwantificering van shotgun-proteomics en gerichte massaspectrometrie-analyse te verbeteren, waar dergelijke vooruitgang is geprezen als instrumenteel voor het voortzetten van de drang naar wijdverspreide acceptatie van proteomics-technologieën in kritisch onderzoek en klinische omgevingen8, 9,10,11,12,13. De meeste bestaande protocollen maken echter gebruik van robotachtige vloeistofbehandelingsplatforms die aanzienlijke investeringen en training vereisen, waardoor hun nut in veel laboratoria in de academische omgeving of anderszins met een beperkt budget wordt beperkt.

Dit artikel beschrijft een protocol dat gebruik maakt van een goedkoop, open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem, de OT-2, om een typische shotgun proteomics monstervoorbereidingsworkflow semi-automatiseren. De OT-2 heeft lagere kosten dan veel andere robotachtige vloeistofbehandelingssystemen en kost op het moment van schrijven ongeveer $ 5.000 Amerikaanse dollars. Wanneer rekening wordt gehouden met de prijzen van verschillende modules en labware, zijn de totale kosten voor het opzetten van experimenten in dit protocol op het moment van schrijven ongeveer $ 10.000, waardoor het betaalbaarder is voor een aanzienlijk bredere set laboratoria dan duurdere opties. De OT-2 is compatibel met open-source programmeren via Python-scripts en biedt grote flexibiliteit in door de gebruiker gedefinieerd DIY-protocolontwerp. Met behulp van drie in eigen huis ontwikkelde scripts, dekken de onderstaande protocollen het uitvoeren van een typische shotgun proteomics monstervoorbereidingsworkflow op het OT-2-station met een archetypische eiwitstandaard (runderserumalbumine; BSA) en een complex eiwitmonster van een normaal menselijk hartlysaat (figuur 1). De procedures voor de verwerking van (1) een BSA-monster en (2) een complex cardiaal lysaatmonster worden beschreven in respectievelijk protocolsecties 1, 2, 5, 6 en 3, 4, 5, 6. Sera-Mag carboxylaat-gemodificeerde magnetische kralen worden gebruikt in eenpotige vaste-fase-verbeterde monstervoorbereiding (SP3) om detergenten en zouten in de eiwit- en peptidemonsters te verwijderen. Tryptische digesten van runderserumalbumine en menselijke harteiwitten worden verder gereinigd door SP3-kralen en ingediend voor LC-MS /MS-analyse. Massaspectra worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de MaxQuant-software voor peptide- en eiwitidentificatie. Representatieve resultaten die door ons worden uitgevoerd, tonen aan dat het protocol uitstekende technische variatiecoëfficiënten (CV) bereikt, terwijl het banktijd bespaart en niet inferieur is aan de handvertering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De ontwikkelde Python scripts zijn gedeponeerd op GitHub op: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Een kopie van de scripts wordt gegeven in Aanvullend Bestand 1. Raadpleeg de GitHub-repository voor de nieuwste versies.

1. Experimentele preparaten

  1. Controleer de vereiste hardware voordat u het protocol start.
    OPMERKING: De volgende hardwarecomponenten zijn vereist: OT-2 pipetten, pipetpunten, 4-in-1 buisrekset, aluminium blokkenset, magnetische module, temperatuurmodule, 96-well 2 ml diepe putplaten (zie Materiaaltabel).

2. Monsterpreparaat voor massaspectrometrie (MS) met een runderserumalbumine (BSA) met één eiwit

  1. Open het NoSP3_digestion.py script in een teksteditor en geef de experimentspecifieke variabelen zo nodig op in de sectie ALLEEN HIER AANPASSEN.
    OPMERKING: De experimentspecifieke variabelen omvatten het aantal monsters en repliceren; de monsterconcentratie; het volume van de reagentia dithiothreitol - DTT, jodoacetamide - IAZ en trypsine; de DTT- en IAA-incubatietijd en de starttip voor pipet P20/P50 en P300).
    1. Open de Opentrons App en upload het script naar het tabblad PROTOCOL in de Opentrons App.
      OPMERKING: De Opentrons-app kan worden gedownload van Reference14 naar een lokale computer. Op het moment van schrijven is de Opentrons P50 elektronische pipet niet beschikbaar voor aankoop in de Opentrons-winkel. Het is vervangen door de P20 eenkanaals elektronische pipet die compatibel is met de volumes die in het protocol zijn gespecificeerd. In het script zijn aantekeningen en instructies gemaakt om de P50 pipet te vervangen door de P20 pipet. Gebruikers moeten mogelijk de compatibiliteit van de betreffende pipet met dit protocol testen en verifiëren volgens de Instructies van de Opentrons API.
  2. Open het tabblad ROBOT en voer robotdekkalibratie Calibrate Deck uit in het tabblad ROBOT volgens de stapsgewijze instructies op het scherm in de Opentrons-app.
    OPMERKING: Deze stap is alleen vereist als deze niet eerder is geïmplementeerd of als de robot onlangs is getransloceerd.
  3. Klik op de knop PIPETTEN BEHEREN om de kalibratie van de tiplengte uit te voeren, gevolgd door pipetverschuivingskalibratie om de standaardpositie van tip en pipetcombinatie te kalibreren.
    OPMERKING: Deze stap is vereist als een pipet voor de eerste keer wordt gebruikt.
  4. Plaats de vereiste labware en pipetten op de overeenkomstige locatie in het OT-2-deck dat is opgegeven in het Python-script (afbeelding 2).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de temperatuurmodule is aangesloten en ingeschakeld en dat het aluminium blok bovenop de temperatuurmodule is geplaatst.
  5. Open het tabblad CALIBRATE en voer kalibratie uit voor de combinatie van labware en pipetten die vereist is in dit python-script.
    OPMERKING: De Opentrons-app registreert de kalibratieparameters, wat niet nodig is voor toekomstige toepassingen met dezelfde labware en pipetten.
  6. Bereid 5 ml ammoniumbicarbonaat (ABC) (pH ~ 8,0) oplossing door 39,53 mg ABC op te lossen in water van massaspectrometriekwaliteit tot een totaal volume van 5 ml in een conische buis van 15 ml. Plaats de ammoniumbicarbonaatbuffer in de A1-put van het 4-in-1 buizenrek met de bovenkant van de buishouder van 15 ml + 50 ml.
  7. Bereid 1 ml bovien serumalbumine (BSA) eiwit in een 2,0 ml eiwit laagbindende buis (zie Tabel met materialen). Plaats het monster in de A1-put van het 4-in-1 buizenrek met 2 ml buishouderblad.
  8. Plaats handmatig 2,0 ml eiwit laagbindende buizen in de putten van A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, enz. in het aluminium blok bovenop de temperatuurmodule.
    OPMERKING: De robotpipet geeft standaard monsters af in de verticale volgorde vanaf A1 (eerste monster) tot het laatste monster. Horizontale dosering kan worden gespecificeerd. Raadpleeg 15 voor meer informatie. Het totale aantal buizen dat moet worden voorbereid, moet gelijk zijn aan het totale aantal monsters (d.w.z. het aantal biologische monsters vermenigvuldigd met het aantal technische replicaties per monster).
  9. Bereid 1 ml van 60 mM DTT door 9,26 mg DTT-vaste stoffen op te lossen in water van massaspectrometriekwaliteit tot een totaal volume van 1 ml. Plaats de DTT in de A6 put van het 4-in-1 buizenrek met de 2 ml buishouder bovenkant.
    LET OP: DTT is schadelijk voor menselijke ogen, huid en het ademhalingssysteem. Draag PBM's en behandel het onder een chemische kap. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad van de fabrikant voor de juiste procedures.
  10. Observeer terwijl de robot een geschikt volume ABC-buffer overbrengt naar de monsterbuizen in het aluminium blok.
    OPMERKING: Het totale volume ABC en eiwitmengsel in elke buis is 100 μL en het volume ABC-buffer wordt berekend in het script (V = 100 μL minus het volume van 100 μg eiwitmonster).
  11. Zorg ervoor dat de robot 100 μg BSA-eiwit overbrengt naar elke buis met ABC-buffer.
    OPMERKING: Een typisch experiment kan tot 100 μg eiwitten gebruiken voor eiwitvertering, d.w.z. 50 μL van 2,0 μg / μL voor dit BSA-monster.
  12. Controleer handmatig of het robotprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat DTT is geladen in A6 van het 2 ml buizenrek in sleuf 4 voordat het protocol wordt hervat. Zorg ervoor dat een DTT-buis in de A6-put is geplaatst en open de dop. Klik op de knop Hervatten in de Opentrons-app om door te gaan. Zorg ervoor dat de robot 10 μL DTT-oplossing overbrengt naar elke monsterput, gevolgd door vijf mengrondes.
  13. Controleer of het robotprogramma is onderbroken en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat u doppen op monsterbuizen sluit. Sluit handmatig de doppen van de buizen en klik op Hervatten om door te gaan. Wacht tot de temperatuurmodule van de robot het aluminiumblok begint te verwarmen totdat de temperatuur 55 °C bereikt, gevolgd door een incubatie van 5 minuten om monsters tot 55 °C te laten komen.
    OPMERKING: De robot houdt de temperatuur gedurende 30 minuten op 55 °C om eiwitreductie door DTT tijdens de incubatie mogelijk te maken.
  14. Bereid tijdens de 30 minuten DTT-incubatie 1 ml 187,5 mM jodoacetamide (IAZ) voor door 34,68 mg IAZ in de ABC-buffer op te lossen tot een totaal volume van 1 ml. Wikkel de IAA-oplossing handmatig in met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
    LET OP: IAZ kan ernstige oog- en ademhalingsirritatie veroorzaken. Behandel het onder een chemische kap met de juiste PBM's.
  15. Zorg ervoor dat de temperatuurmodule van de robot afkoelt na het voltooien van de DTT-incubatiestap van 30 minuten.
    OPMERKING: Nadat de temperatuur van de module 22 °C heeft bereikt, handhaaft de module de temperatuur gedurende 5 minuten om de monsters volledig te laten afkoelen.
  16. Maak de monsterbuizen los wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en geef het waarschuwingsbericht weer: Zorg ervoor dat u doppen op monsterbuizen opent. Klik op Hervatten om door te gaan.
  17. Controleer handmatig of het programma van de robot is gepauzeerd met een waarschuwingsbericht: Zorg ervoor dat IAA is geladen in B6 van het buizenrek van 2 ml in sleuf 4 voordat u het protocol hervat. Controleer de racklocatie van de IAA-buis en open de buisdop. Klik op Hervatten om door te gaan. Zorg ervoor dat de robot 10 μL IAZ overbrengt naar elke monsterbuis, gevolgd door vijf mengrondes.
  18. Sluit de monsterbuizen af wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en geef het bericht weer: Sluit doppen op monsterbuizen en bedek monsterbuizen met folie. Bedek het hele aluminium blok met een schoon stuk folie. Klik op Hervatten om door te gaan. Wacht tot de monsters zijn geïncubeerd bij 22 °C gedurende 30 minuten. Zorg ervoor dat de temperatuurmodule van de robot wordt gedeactiveerd na voltooiing van de IAA-incubatie.
  19. Bereid een mengsel van trypsineoplossing tijdens IAZ-incubatie (stap 2.19) in de eindconcentratie van 0,2 μg/μL: los 20 μg massaspectrometrie/sequencing-grade trypsine op in 100 μL water van MS-kwaliteit.
  20. Plaats de trypsine-oplossing in de C6-put van het buizenrek van 2 ml met de buisdop open wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en de waarschuwingsboodschap wordt weergegeven: Zorg ervoor dat trypsine is geladen in C6 van het buizenrek van 2 ml in sleuf 4 voordat het protocol wordt hervat. Klik op Hervatten om door te gaan.
  21. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd en het waarschuwingsbericht wordt weergegeven: Open doppen op monsterbuizen op de temperatuurmodule. Maak de monsterbuizen los en klik op Hervatten om door te gaan. Sta erbij terwijl de robot 10 μL trypsine overbrengt naar elke monsterbuis, gevolgd door vijf mengrondes.
  22. Wikkel de deksels van de monsterbuis met paraffinefolie, breng alle monsters over naar een temperatuurgecontroleerde mixer en incubeer bij 37 °C gedurende 16-20 uur met schudden bij 600 tpm.
    OPMERKING: De trypsinevergisting kan ook rechtstreeks op de temperatuurmodule bij 37 °C worden uitgevoerd.

3. Peptide clean-up met behulp van SP3 paramagnetische kralen

  1. De volgende dag na de nachtelijke trypsinevertering draait u de monsters kort met behulp van een benchtop microcentrifuge (≤ 2.000 x g) (zie Tabel met materialen) en plaatst u de monsters op een magnetisch buizenrek. Laat de monsters 2 min staan.
    1. Breng het supernatant voorzichtig met een pipet over in een nieuwe set eiwitarme microcentrifugebuizen. Bewaar de monsters in de koelkast en ga verder met stap 3.2-3.9.
      OPMERKING: Bewaar de monsters voor langdurige opslag bij -80 °C.
  2. Open het SP3_peptide_cleanup.py Python-script in een teksteditor en geef indien nodig op in de sectie ALLEEN HIER AANPASSEN.
    OPMERKING: De experimentspecifieke variabelen omvatten het aantal monsters en replicaties, het volume van de over te dragen peptiden, het volume van reagentia (kralen, acetonitril, DMSO), de starttip voor P20/P50- en P300-pipetten en goed beginnend in de deep-well plaat op de magnetische module. Elk BSA-digestiemonster bevat ongeveer 120 μL verteringsvolume, dat zal worden gealiquoteerd in twee technische replicaties met 55 μL in elke replicatie. Als u slechts de helft van de digest wilt opschonen, wijzigt u de replicatienummervariabele in 1.
  3. Upload het script naar het tabblad PROTOCOL in de Opentrons-app .
  4. Plaats de benodigde labware en pipetten op de overeenkomstige locatie in het OT-2-deck dat is opgegeven in het Python-script (figuur 3). Zorg ervoor dat de magnetische module is ingeschakeld en verbonden met de robot. Plaats een nieuwe 2 ml 96-well diepe putplaat (zie tabel met materialen) op de bovenkant van de magnetische module.
  5. Open het tabblad CALIBRATE en voer kalibratie uit voor de combinatie van labware en pipetten die vereist is in dit Python-script.
    OPMERKING: Kalibratie voor dezelfde labware- en pipetcombinaties hoeft slechts één keer te worden uitgevoerd en de Opentrons-app registreert de kalibratieparameters.
  6. Plaats de verteerde monsters (supernatant verzameld bij stap 3.1) in het buizenrek van 2,0 ml in de verticale volgorde in putjes A1, B1....
  7. Bereid 15 ml LC-MS/MS-compatibele acetonitril voor in een conische buis van 50 ml en plaats de buis in de put A3 in het 4-in-1 buizenrek met de bovenkant van de buishouder van 15 ml + 50 ml.
  8. Bereid 5 ml 2% DMSO voor door 100 μL DMSO met 4,9 ml massaspectrometrie-waardig water toe te voegen in een conische buis van 15 ml. Plaats de buis in de put A1 in het buizenrek van 15 ml + 50 ml.
  9. Label een lege conische buis van 50 ml als afval en plaats deze in de put B3 in het buizenrek van 15 ml + 50 ml.
  10. Bereid de SP3-kralen voor volgens Reference16.
    1. Bereid een geschikte hoeveelheid gemengde kralen in een microcentrifugebuis van 2,0 ml.
      OPMERKING: Elke peptide-opruimreactie vereist 10 μL gemengde kralen. Bereid bijvoorbeeld minimaal 40 μL gemengde kralen voor vier opruimreacties.
    2. Laat het kralenmengsel 2 min op de magnetische standaard staan. Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet en meet het volume van het supernatant met een pipet.
    3. Bereken het resterende volume kralen en voeg 5-10 keer het water van massaspectrometriekwaliteit toe (bijv. 100-200 μL water voor 20 μL kralen) en vortex (snelheid 10) gedurende 10 s. Zet de kralen 2 min op de magnetische standaard.
    4. Herhaal de stappen voor het wassen van water voor een totaal van drie wasbeurten.
    5. Resuspend de laatste kralen in water van MS-kwaliteit tot een eindconcentratie van 50 μg/μL. Plaats de gewassen magnetische kralen in de put A6 in het buizenrek van 2,0 ml.
      OPMERKING: De kralen worden aanbevolen om te resuspenderen in een concentratie van 10 μg/μL16. In de huidige optimalisatie-inspanning werd de uiteindelijke concentratie gewijzigd tot 50 μg / μL om het totale volume van het kraal-peptide-acetonitrilmengsel te minimaliseren.
  11. Zorg ervoor dat de robot 55 μL van de verteerde monsters overbrengt naar de putten in de deep-well platen op de magnetische module.
  12. Controleer of het robotprotocol is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat voorbereide kralen zijn geladen in A6 van het buizenrek van 2 ml in sleuf 4 voordat u het protocol hervat. Vortex de kralen, en draai dan kort voor 5 s op een mini benchtop centrifuge en plaats de kralen in de A6 put van het 2 ml buizenrek met de dop open. Sta erbij terwijl de robot de kralen 10 keer gedurende vijf rondes mengt door op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: De robot brengt 10 μL kralen over naar elk verteerd monster in de deep-well platen, gevolgd door vijf keer mengen.
  13. Zorg ervoor dat de robot 1.292 μL acetonitril naar elke put overbrengt en onmiddellijk 10 keer mengt door op en neer te pipetteren om het binden van peptiden en kralen te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Elke overdracht wordt voltooid over meerdere rondes omdat de P300-pipet slechts tot 300 μL per keer kan overbrengen.
  14. Zorg ervoor dat de robot alle monsters vijf keer mengt door op en neer te pipetteren in de diepputplaat.
  15. Wacht tot de magnetische module is ingeschakeld en monsters gedurende 2 minuten op de module zijn geïncubeerd.
  16. Sta erbij terwijl de pipetteeraspiratie en afgiftesnelheden zijn ingesteld op vertraging bij 25 μL/s ten opzichte van de standaardwaarde van 150 μL/s.
    OPMERKING: De robot verwijdert het supernatant langzaam uit elke put en gooit het in de afvalbuis terwijl de magnetische module is ingeschakeld.
  17. Wacht tot de pipetteeraspiratie en afgiftesnelheden zijn teruggezet naar de standaardinstelling. Merk op dat de magnetische module wordt uitgeschakeld.
  18. Controleer of het programma van de robot is onderbroken en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat de ACN-buisdop is uitgeschakeld. Maak de acetonitrilbuis handmatig los en plaats deze terug naar het buizenrek. Klik op Hervatten om door te gaan. Zorg ervoor dat de robot 1 ml acetonitril overbrengt om elk monster te wassen en onmiddellijk 10 keer mengt.
  19. Zorg ervoor dat de robot alle monsters 10 keer mengt om de monsters te wassen.
  20. Sta erbij terwijl de magnetische module is ingeschakeld en incubeer de monsters gedurende 2 minuten.
  21. Wacht tot de robot de pipetteeraspiratiesnelheid verandert om het supernatant langzaam en langzaam te verwijderen en in de afvalbuis te doseren.
  22. Observeer terwijl de robot de monsters op de magnetische module gedurende 60 s incubeert om resterende acetonitril te laten verdampen, en wijzig vervolgens de pipetterende aspiratiesnelheden terug naar standaard. Merk op dat de magnetische module wordt losgekoppeld.
  23. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd en het bericht: Vortex DMSO opnieuw en open doppen weergeeft. Vortex de 2% DMSO handmatig gedurende 10 s en plaats deze terug in de A1-put in het buizenrek van 15 ml-50 ml. Klik op Hervatten om door te gaan.
  24. Zorg ervoor dat de robot 80 μL van 2% DMSO overbrengt naar elke put en onmiddellijk 10 keer mengt.
  25. Zorg ervoor dat de robot alle monsters 10 keer mengt voor nog eens vijf rondes.
  26. Sta erbij terwijl de magnetische module is ingeschakeld en incubeer de monsters gedurende 2 minuten.
  27. Observeer terwijl de robot de pipetaspiratiesnelheid verandert in langzaam (25 μL / s) en langzaam het supernatant overbrengt naar lege putten in de diepe putplaat.
  28. Wacht tot de robot monsters op de magnetische module gedurende 2 minuten incubeert om resterende kralen in de monsters te verwijderen.
  29. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Plaats nieuwe buizen van 2 ml in het buizenrek van 2 ml en zorg ervoor dat het aantal buizen overeenkomt met het totale aantal monsters.
  30. Plaats de eerste microcentrifugebuis van 2 ml in de put direct na het laatste BSA-digesteermonster. Klik op Hervatten om door te gaan.
    OPMERKING: De zes BSA-digestmonsters die in dit protocol zijn getest, bevinden zich bijvoorbeeld in de putten A1, B1, C1, D1, A2 en B2. Daarom wordt de nieuwe set buizen van 2,0 ml in de putten B3, C3, D3, ... enzovoort.
  31. Observeer terwijl de robot 88 μL monsters van de putten in de diepe putplaat overbrengt naar de nieuwe set buizen van 2,0 ml.
    OPMERKING: Het overgedragen volume (1,1 x 80 μL) in het protocol is geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat het volledige volume van het monster in pipetpunten wordt aangezogen.
  32. Ga erbij staan terwijl de robot de pipetaspiratiesnelheid wijzigt naar standaard en de magnetische module uitschakelt.
  33. Droog de gereinigde peptiden handmatig in een vacuümverdamper (zie Materiaaltabel) en ga naar rubriek 5 of bewaar gedroogde monsters bij -20 °C.

4. MS-monstervoorbereiding met eiwitlysaat van het menselijk hart (5 mg/ml) met SP3 paramagnetische kralen

  1. Open het SP3_digestion.py Python-script en geef waarden van variabelen op in de sectie ALLEEN AANPASSEN.
    OPMERKING: De variabelen omvatten het aantal monsters en repliceren, de monsterconcentratie, het volume van reagentia (DTT, IAZ, trypsine, kralen, 100% en 80% ethanol), DTT- en IAA-incubatietijd, starttip voor pipetten P20/P50 en P300 en goed beginnend in de deep-well plaat op de magnetische module.
  2. Volg de stappen 2.2-2.23 in rubriek 2 voor ms-monstervoorbereiding met een enkel eiwit runderserumalbumine voor DTT- en IAZ-incubatie. Raadpleeg figuur 1 voor de opstelling van het robotdek in die stappen.
  3. Bereid een verse SP3-kralenmix (20 μL-kralen per reinigingsreactie) voor eiwitreiniging (zoals gespecificeerd in stap 3.10) tijdens de DTT- en IAA-incubatiestappen (stappen 2.15 en 2.19). Plaats de kralen in de D6-put op het buizenrek van 2 ml.
  4. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd met het bericht: Open buisdoppen. Maak de monsterbuizen in het aluminium blok bovenop de temperatuurmodule handmatig los en klik op Hervatten om door te gaan.
  5. Zorg ervoor dat de robot alle monsters van buizen van 2,0 ml overbrengt naar een nieuwe diepe putplaat bovenop de magnetische module.
  6. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat voorbereide kralen zijn geladen in D6 van het buizenrek van 2 ml in sleuf 4 voordat het protocol wordt hervat. Open de dop van de kralenbuis en klik op Hervatten om door te gaan.
  7. Observeer terwijl de robot 20 μL kralen overbrengt naar elke put in de diepe putplaat met vijf rondes mengen van de kralen en vijf mengrondes van het monster-kralenmengsel.
  8. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat 100 procent ethanol is geladen in A3 van het buizenrek van 15 ml-50 ml in sleuf 5 voordat het protocol wordt hervat. Bereid 10-20 ml 100% ethanol (d.w.z. 200 proof ethanol, zie tabel met materialen) in een conische buis van 50 ml en plaats deze in de A3-put van het rek. Klik op Hervatten om door te gaan.
  9. Sta erbij terwijl de robot 140 μL 100% ethanol overbrengt naar elke put in de plaat, onmiddellijk gevolgd door 10 mengrondes om de binding van peptiden aan de kralen te vergemakkelijken.
  10. Zorg ervoor dat de robot elk monster mengt door elke ronde 10 keer op en neer te pipetteren voor een totaal van vijf mengrondes.
  11. Sta erbij terwijl de magnetische module is ingeschakeld en incubeer de monsters op de module gedurende 2 minuten.
  12. Observeer terwijl de robot de pipetteersnelheid verandert in langzaam (25 μL / s) en het supernatant uit elke put zuigt en in de afvalbuis doseert.
  13. Wacht tot de robot de pipetteersnelheid weer op de standaardsnelheid zet en de magnetische module uitschakelt.
  14. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat 80 procent ethanol is geladen in A4 van het buizenrek van 15 ml-50 ml in sleuf 5 voordat het protocol wordt hervat. Bereid handmatig 20 ml 80% ethanol door 4 ml water van MS-kwaliteit te mengen met 16 ml 100% ethanol (d.w.z. 200 proof). Plaats de 80% ethanol in de A4 put in het buizenrek. Klik op Hervatten om door te gaan. Zorg ervoor dat de robot 1 ml 80% ethanol overbrengt naar elke put en onmiddellijk 10 keer mengt.
  15. Observeer terwijl de robot de pipetteersnelheid verandert in langzaam (25 μL / s), zuigt het supernatant uit elke put en doseert in de afvalbuis. Wacht tot de robot de pipetteersnelheid weer op de standaardsnelheid zet en de magnetische module uitschakelt.
  16. Open de dop van de ABC-oplossing wanneer het programma van de robot is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Open dop op ABC-buis. Klik op Hervatten om door te gaan. Sta erbij terwijl de robot de magnetische module uitschakelt, 250 μL ABC naar elke put overbrengt en onmiddellijk 10 keer mengt.
    OPMERKING: Deze stap is om de monsters te wassen met ABC.
  17. Zorg ervoor dat de robot de magnetische module inschakelt en gedurende 2 minuten monsters op de module incubeert.
  18. Observeer terwijl de robot de pipetteersnelheid verandert in langzaam (25 μL / s) en het supernatant van elke put naar de afvalbuis overbrengt. Wacht tot de robot 100 μL ABC-buffer naar elke put overbrengt en onmiddellijk 10 keer mengt.
  19. Controleer of het programma van de robot is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven: Zorg ervoor dat nieuwe opvangbuizen in een aluminiumblok van 2,0 ml zijn geplaatst voordat het protocol wordt hervat. Plaats een nieuwe set microcentrifugebuizen met lage eiwitretentie in het aluminium blok onmiddellijk na de laatste monsterbuis in eerste instantie in het blok. Klik op Hervatten om door te gaan. Sta erbij terwijl de robot elk monster in ABC-buffer overbrengt naar de nieuwe buizen van 2,0 ml.
    OPMERKING: Onderzoek de putten en breng indien nodig handmatig het resterende monster over naar de buizen.
  20. Bereid een geschikte hoeveelheid ms-grade trypsine (10 μl per monster) door 20 μg ms-grade trypsine op te lossen in water van MS-kwaliteit tot een eindconcentratie van 0,2 μg/μl wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en de boodschap wordt weergegeven: Zorg ervoor dat trypsine (0,2 μg/μl) is geladen in C6 van het buizenrek van 2 ml in sleuf 4 voordat het protocol wordt hervat. Zorg ervoor dat de robot 10 μL trypsine overbrengt naar elke monsterbuis, gevolgd door vijf mengrondes.
  21. Wikkel de deksels van de monsterbuis met paraffinefolie, breng alle monsters over naar een temperatuurgecontroleerde mixer en incubeer bij 37 °C gedurende 16-20 uur met 1.000 tpm schudden.
    OPMERKING: Het uitvoeren van de spijsvertering met 1.000 rpm schudden wordt aanbevolen om de neerslag van kralen tijdens de nachtelijke incubatie te minimaliseren.

5. Peptide clean-up met SP3 paramagnetische kralen

  1. Volg stapsgewijze instructies in stap 2, Peptide-opschoning met SP3 paramagnetische kralen.

6. Vloeistofchromatografie en massaspectrometrie

  1. Resuspend de BSA (stappen 2-3) en hartlysaat (stap 4) peptiden in 0,1% mierenzuur door toevoeging van 1 ml LC-MS grade 99% mierenzuur in MS water aan een totaal volume van 1 L.
    LET OP: Mierenzuur is een sterk zuur. Het is zeer corrosief voor de ogen, huid en luchtwegen. Behandel met zorg onder een chemische kap met PBM's.
  2. Kwantificeer de post-digest peptideconcentratie met behulp van een kwantitatieve peptide assay kit17 en injecteer 0,5 μg BSA digest en 1,5 μg hart digest voor LC-MS / MS analyse.
  3. Stel het vloeistofchromatografieprogramma voor LC-MS/MS-analyse in.
    OPMERKING: In een typische opstelling kunnen peptide digests worden geladen op een omgekeerde fase C18 kolom (3 μm deeltje; 100 Å porie; 75 μm x 150 mm; zie Tabel van materialen) met behulp van de parameters in aanvullend bestand 2.
  4. Verkrijg shotgun proteomics-gegevens met behulp van een massaspectrometer (zie Tabel met materialen) met behulp van de parameters in aanvullend bestand 3.
  5. Zoek in de eiwitdatabase naar eiwitidentificatie.
    1. Download en installeer de vereiste software, MaxQuant.
      OPMERKING: MaxQuant-software (v.1.6.10.43) werd hier gebruikt voor de volgende stappen (zie Tabel met materialen).
    2. Download de samengestelde humane proteoomdatabase uit een hoogwaardige eiwitsequentiedatabase (UniProt/SwissProt) (zie Materials Table of Materials). Klik op de knop Downloaden en kies FASTA (canonical).
      OPMERKING: Download optioneel FASTA (niet-canoniek) om eiwitisovormen van elk gen in de database op te nemen, indien gewenst.
    3. Geef in de MaxQuant-software-interface het FASTA-bestand op dat als eiwitdatabase moet worden gebruikt door naar het deelvenster Globale parameters te navigeren en op het tabblad Sequenties te klikken; klik vervolgens op de knop Toevoegen om het bestandspad naar het FASTA-bestand op te geven.
    4. Geef in de MaxQuant-software-interface de verkregen onbewerkte massaspectrumbestanden op die moeten worden geanalyseerd door naar het paneel Onbewerkte gegevens te gaan en op de knop Laden te klikken en de onbewerkte bestanden te selecteren.
    5. Stel zoekparameters in zoals weergegeven in tabel 1. Schakel indien nodig labelvrije kwantificering (LFQ) in.
    6. Wacht tot de zoekopdracht is voltooid en zoek het aantal peptidespectrumovereenkomsten (PSM's) dat de FDR 1%-drempels overschrijdt in het msms.txt bestand in de map /combined/txt.
      OPMERKING: In de vergelijkingen die hier zijn uitgevoerd voor de sectie representatieve resultaten, werden PSM's die aan meerdere eiwitten waren toegewezen, uitgefilterd en PSM's die waren toegewezen aan één uniek eiwit werden behouden om het aantal PSM's, peptiden en eiwitten te tellen (figuur 4 en figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier worden drie Python-scripts geleverd die compatibel zijn met de OT-2-robot en die monstervoorbereiding uitvoeren voor massaspectrometrieproteomics met een standaard runderserumalbumine met één eiwit (technische replicaties n = 5 digesties) en een wasmiddelbevattend menselijk hartlysaatmonster (n = 5 digesties). Elk digestproduct is verdeeld in twee peptide-opruimreacties. Het aantal geïdentificeerde peptidespectrummatches (PSM's), peptiden en eiwitten in elke run van de BSA- en hartmonsters wordt weergegeven in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen binnen het protocol
Voor de beste prestaties moeten Opentrons-geverifieerde labware, modules en verbruiksartikelen worden gebruikt die compatibel zijn met OT-2. Aangepaste labware kan worden gemaakt volgens de instructies van Opentrons op Reference14. Zorg ervoor dat u het OT-2-dek, de pipetten en de labware kalibreert wanneer u het voor de eerste keer gebruikt. Het is ook van cruciaal belang om de richtlijnen van de fabrikant van SP3-kralen te volgen om kralen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-awards F32-HL149191 aan YH; R00-HL144829 naar EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 naar MPL. Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3 zijn gemaakt met behulp van een webgebaseerde wetenschappelijke illustratietool, BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
300 µL pipette tipsOpentrons
4-in-1 tube rack setOpentronsElk set bevat 2 basisstandaards en 4 buisjeshouders voor 1,5 mL, 2 mL, 15 mL + 50 mL, 15 mL en 50 mL. We gebruiken de 2 mL en 15 mL + 50 mL houders in deze studie.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC ColumnThermo Scientific#1645683 μm deeltjes; 100 Å poriën; 75 μm x 150 mm
Acetonitrile LC-MS gradeVWR#JT9829
Aluminium blokstelOpentronsDit blokstel bevat 3 houders die compatibel zijn met 96-well, 2,0 mL buisjes en een PCR-strip om te gebruiken met de OT-2 temperatuurmodule. We gebruiken de 2,0 mL buisjeshouder in dit manuscript.
Ammonium BicarbonaatSigma-Aldrich# A6141
Bovine Serum Albumine Standaard, 2 mg/mLThermo Scientific#23210
Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS gradeThermo Scientific#85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray HPLC ColumnsThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Ethanol Proof 195-200Fisher#04-355-720
Formic Acid LC-MS gradeThermo Scientific#85178
Human hart lysaatNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacetamideSigma-Aldrich#I1149
Magnetische buisjeshouderThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini CentrifugeThermo Scientific#75004061benchtop mini centrifuge voor snel draaien
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V BodemOpentrons
OT-2 magnetische moduleOpentronsGEN1
OT-2 P300 enkele kanaal pipetOpentronsGEN1
OT-2 P50 enkele kanaal pipetOpentronsGEN1
OT-2 robot pipetrobotOpentronsOT-2
OT-2 temperatuurmoduleOpentronsGEN1
Pierce Kwantitatieve Colorimetrische Peptid AssayThermo Scientific#23275
Protein LoBind buisjes 2,0 mLEppendorf#022431102
Protein Sequence DatabaseUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20reviewed:yes
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Gemodificeerde Magnetische Deeltjes, HydrofoobCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Gemodificeerde Magnetische Deeltjes, HydrofielCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo ScientificVacuum evaporator
Thermo Q Exactive HF MassaspectrometerThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsine MS GradeThermo Scientific#90057
Water LC-MS gradeVWR#BDH83645.400
```

Referenties

  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
  3. Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
  4. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  5. Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
  6. Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
  7. Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
  8. van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
  9. Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).
  10. Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  11. Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
  12. Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Monsterpreparatielabautomatiseringopen-source robotproteïnedigestiemassaspectrometrievloeistofbehandelsysteemPython-automatiseringsscriptsproteïnereductiepeptidezuivering
Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.