Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot

Summary

Gedetailleerd protocol en drie Python-scripts zijn voorzien voor het bedienen van een open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem om semi-geautomatiseerde eiwitmonstervoorbereiding uit te voeren voor massaspectrometrie-experimenten, met betrekking tot wasmiddelverwijdering, eiwitvertering en peptide-ontzoutingsstappen.

Abstract

Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics-experimenten vereisen meerdere monstervoorbereidingsstappen, waaronder enzymatische eiwitvertering en -opruiming, die aanzienlijke persoonsuren bankarbeid kunnen kosten en een bron van batch-to-batch variabiliteit kunnen vormen. Laboratoriumautomatisering met pipetteerrobots kan handmatig werk verminderen, de doorvoer maximaliseren en de reproduceerbaarheid van onderzoek vergroten. Toch maken de hoge startprijzen van standaard automatiseringsstations ze onbetaalbaar voor veel academische laboratoria. Dit artikel beschrijft een proteomics monstervoorbereidingsworkflow met behulp van een betaalbaar, open-source automatiseringssysteem (The Opentrons OT-2), inclusief instructies voor het instellen van semi-geautomatiseerde eiwitreductie, alkylering, spijsvertering en opruimstappen; evenals bijbehorende open-source Python-scripts om het OT-2-systeem te programmeren via de application programming interface.

Introduction

Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel om de overvloed aan vele eiwitten in biologische monsters tegelijkertijd te meten. Proteomics-experimenten met bioinformatica-analyse worden routinematig gebruikt om biomarkers te identificeren en geassocieerde biologische complexen en paden te ontdekken die ten grondslag liggen aan pathologische mechanismen. Met zijn hoge analytspecificiteit en potentiële kwantitatieve nauwkeurigheid heeft shotgun proteomics ook een uitstekend potentieel om te worden overgenomen door onderzoeksfaciliteiten en diagnostische laboratoria voor klinische monsteranalyse zonder de noodzaak om te vertrouwen op

Protocol

De ontwikkelde Python scripts zijn gedeponeerd op GitHub op: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Een kopie van de scripts wordt gegeven in Aanvullend Bestand 1. Raadpleeg de GitHub-repository voor de nieuwste versies.

1. Experimentele preparaten

1. Controleer de vereiste hardware voordat u het protocol start.
   OPMERKING: De volgende hardwarecomponenten zijn vereist: OT-2 pipetten, pipetpunten, 4-in-1 buisrekset, aluminium blokkenset, magnetische module, temperatuurmodule, 96-well 2 ml diepe putplaten (zie Materiaaltabel).

Results

Hier worden drie Python-scripts geleverd die compatibel zijn met de OT-2-robot en die monstervoorbereiding uitvoeren voor massaspectrometrieproteomics met een standaard runderserumalbumine met één eiwit (technische replicaties n = 5 digesties) en een wasmiddelbevattend menselijk hartlysaatmonster (n = 5 digesties). Elk digestproduct is verdeeld in twee peptide-opruimreacties. Het aantal geïdentificeerde peptidespectrummatches (PSM's), peptiden en eiwitten in elke run van de BSA- en hartmonsters wordt weergegeven in

Discussion

Kritieke stappen binnen het protocol
Voor de beste prestaties moeten Opentrons-geverifieerde labware, modules en verbruiksartikelen worden gebruikt die compatibel zijn met OT-2. Aangepaste labware kan worden gemaakt volgens de instructies van Opentrons op ^Reference14. Zorg ervoor dat u het OT-2-dek, de pipetten en de labware kalibreert wanneer u het voor de eerste keer gebruikt. Het is ook van cruciaal belang om de richtlijnen van de fabrikant van SP3-kralen te volgen om kralen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 µL pipette tips	Opentrons
4-in-1 tube rack set	Opentrons		Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column	Thermo Scientific	#164568	3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm
Acetonitrile LC-MS grade	VWR	#JT9829
Aluminum block set	Opentrons		This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.
Ammonium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	# A6141
Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL	Thermo Scientific	#23210
Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade	Thermo Scientific	#85190
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	#D5545
EASY-Spray HPLC Columns	Thermo Scientific	#ES800A
EasynLC 1200 Nano LC	Thermo Scientific	#LC140
Ethanol Proof 195-200	Fisher	#04-355-720
Formic Acid LC-MS grade	Thermo Scientific	#85178
Human heart lysate	Novus Biologicals	NB820-59217
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	#I1149
Magnetic tube rack	Thermo Scientific	#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43			Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini Centrifuge	Thermo Scientific	#75004061	benchtop mini centrifuge for quick spin
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom	Opentrons
OT-2 magnetic module	Opentrons		GEN1
OT-2 P300 single channel pipette	Opentrons		GEN1
OT-2 P50 single channel pipette	Opentrons		GEN1
OT-2 robot pipetting robot	Opentrons	OT-2
OT-2 temperature module	Opentrons		GEN1
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific	#23275
Protein LoBind tubes 2.0 mL	Eppendorf	#022431102
Protein Sequence Database	UniProt/SwissProt		https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic	Cytiva	#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic	Cytiva	#45152105050250
SpeedVac	Thermo Scientific		Vacuum evaporator
Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer	Thermo Scientific	#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsin MS Grade	Thermo Scientific	#90057
Water LC-MS grade	VWR	#BDH83645.400