Methodenartikel

Toepassing van passieve hoofdbeweging om gedefinieerde versnellingen te genereren bij de hoofden van knaagdieren

DOI:

10.3791/63100

⸱

21 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation for Motor Functions, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 2Department of Assistive Technology, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 3Department of Metabolism and Endocrinology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Department of Rehabilitation Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 5Department of Clinical Research, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een op maat ontworpen ''passieve hoofdbeweging'' systeem, dat mechanische versnellingen reproduceert op de hoofden van knaagdieren die worden gegenereerd tijdens hun loopband die met gematigde snelheden draait. Het maakt het mogelijk om mechanische factoren / elementen te ontleden van de gunstige effecten van lichaamsbeweging.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oefening wordt algemeen erkend als effectief voor verschillende ziekten en fysieke aandoeningen, waaronder die met betrekking tot hersendisfunctie. Moleculaire mechanismen achter de gunstige effecten van lichaamsbeweging zijn echter slecht begrepen. Veel fysieke trainingen, met name die geclassificeerd als aërobe oefeningen zoals joggen en wandelen, produceren impulsieve krachten op het moment van voetcontact met de grond. Daarom werd gespeculeerd dat mechanische impact betrokken zou kunnen zijn bij hoe lichaamsbeweging bijdraagt aan organismale homeostase. Voor het testen van deze hypothese op de hersenen werd een op maat ontworpen ''passieve hoofdbeweging'' (hierna PHM genoemd) systeem ontwikkeld dat verticale versnellingen kan genereren met gecontroleerde en gedefinieerde groottes en modi en mechanische stimulatie kan reproduceren die kan worden toegepast op de hoofden van knaagdieren tijdens loopband die met gematigde snelheden draait, een typische interventie om de effecten van oefening bij dieren te testen. Door dit systeem te gebruiken, werd aangetoond dat PHM de serotonine (5-hydroxytryptamine, hierna 5-HT genoemd) receptor subtype 2A (5-HT2A) signalering in de prefrontale cortex (PFC) neuronen van muizen recapituuleert. Dit werk biedt gedetailleerde protocollen voor het toepassen van PHM en het meten van de resulterende mechanische versnellingen bij knaagdieren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oefening is gunstig voor de behandeling of preventie van verschillende fysieke aandoeningen, waaronder levensstijlziekten zoals diabetes mellitus en essentiële hypertensie1. In verband hiermee is ook bewijs verzameld met betrekking tot de positieve effecten van lichaamsbeweging op hersenfuncties2. Moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de voordelen van lichaamsbeweging voor de hersenen blijven echter voornamelijk niet opgelost. De meeste fysieke activiteiten en trainingen genereren mechanische versnellingen aan het hoofd, althans tot op zekere hoogte. Terwijl verschillende fysiologische verschijnselen mechanisch worden gereguleerd, is het belang van mechanische belasting in de meeste gevallen gedocumenteerd in het bewegingsapparaat 3,4,5. Hoewel de hersenen ook worden blootgesteld aan mechanische krachten tijdens fysieke activiteiten, met name zogenaamde impactoefeningen, is mechanische regulatie van fysiologische hersenfunctie zelden bestudeerd. Omdat het genereren van mechanische versnellingen aan het hoofd relatief gebruikelijk is voor fysieke trainingen, is er gespeculeerd dat mechanische regulatie betrokken kan zijn bij de voordelen van lichaamsbeweging voor hersenfuncties.

5-HT2A receptor signalering is essentieel bij het reguleren van emoties en gedrag onder verschillende biochemische signalen die functioneren in het zenuwstelsel. Het is betrokken bij meerdere psychiatrische ziekten 6,7,8, waarvan is bewezen dat lichaamsbeweging therapeutisch effectief is. 5-HT2A-receptor is een subtype van de 5-HT2-receptor die behoort tot de serotoninefamilie en ook een lid is van de G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) -familie, waarvan de signalering wordt gemoduleerd door de internalisatie, hetzij ligandafhankelijk of -onafhankelijk9. Hoofdtrekkingen zijn een kenmerkend gedrag van knaagdieren, waarvan de hoeveelheid (frequentie) expliciet de intensiteit van 5-HT 2A-receptorsignalering in hun prefrontale cortex (PFC) neuronenvertegenwoordigt 10,11. Gebruikmakend van de strikte specificiteit van deze hallucinogene respons op toegediende 5-HT (head-twitch response, hierna HTR genoemd; zie Aanvullende film 1), werd de hierboven genoemde hypothese over mechanische implicaties in inspanningseffecten op hersenfuncties getest. Daarom analyseerden en vergeleken we de HTR van muizen die werden onderworpen aan gedwongen oefeningen (loopbandlopen) of mechanische interventie (PHM) die oefeningen nabootsten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities. 8-9 weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gebruikt om versnellingen aan het hoofd te meten tijdens het lopen op de loopband en PHM. 9-10 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt voor gedragstesten en histologische analyses van de PFC. De dieren werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel).

1. Meting van de grootte van versnellingen langs x-, y- en z-assen tijdens het lopen van de loopband

  1. Verdoof de rat met inhalatie van 1,5% isofluraan.
    OPMERKING: De ratten werden gebruikt na ten minste 1 week wennen aan de laboratoriumomgeving. Zorg ervoor dat de rat niet reageert op een achterste teenknijpen.
  2. Bevestig de versnellingsmeter (zie Materiaaltabel) bovenop de kop van de rat met behulp van chirurgische tape.
  3. Plaats de rat na volledig herstel van de anesthesie in de loopbandmachine (zie Materiaaltabel) en stel de loopband in op een gematigde snelheid (20 m/min)12 (figuur 1A).
    OPMERKING: Het duurde minstens 20 minuten om het volledige herstel van de rat uit de anesthesie na de beëindiging van de isofluraaninhalatie te bevestigen en het loopbandexperiment te starten. Zorg ervoor dat de rat reageert op een knijpbeweging van de achterste teen en kan lopen of rennen zonder schijnbaar wankelen.
  4. Meet de omvang van verticale versnellingen tijdens het lopen van de loopband met behulp van de toepassingssoftware volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Extraheer 10 seriële golven en bereken individueel de gemiddelde versnellingen langs de 3-dimensionale assen (x-, y- en z-as, figuur 1B). Piekgrootheden werden gekwantificeerd door stepping-gesynchroniseerde golven (~ 2 Hz frequentie) te definiëren als loopband lopende versnellingen (figuur 1C). Ratten werden gebruikt voor deze studie omdat hun grotere lichaamsgrootte geschikt was voor het betrouwbaar meten van de verticale versnelling aan het hoofd, wat niet mogelijk was bij muizen. Muizen werden echter gebruikt voor verdere studies vanwege het gemak en de betrouwbaarheid met betrekking tot de kwantitatieve analyse van head-twitch response.

2. Aanpassing van het PHM-systeem en toepassing van PHM op muizen

  1. Stel de amplitude van de oscillatie van het platform en de rotatiesnelheid van de propellervormige nok vooraf in het PHM-systeem in (figuur 1D), zodat de grootte en frequentie van verticale versnelling overeenkomen met de waarden die zijn verkregen in stap 1.4.
    OPMERKING: Het PHM-systeem bestaat uit een metalen raamwerk en een houten platform. Het motortoerental kan worden gewijzigd en geregeld door de draaiknop aan te passen die is aangesloten op de ingebouwde driver (zie Materiaaltabel). De wijzerplaatschaal van 600 komt overeen met 2 Hz, figuur 1E. De propellervormige nok heeft vier bladen met een instaphoogte van 5 mm (figuur 1F).
  2. Verdoof de muis via inademing van 1,2% isofluraan.
    OPMERKING: Muizen werden gebruikt na ten minste 1 week wennen aan de laboratoriumomgevingen. Zorg ervoor dat de muis niet reageert op een knijpbeweging van de achterste teen.
  3. Plaats de muis in een buikligging met het hoofd en de rest van het lichaam op respectievelijk de oscilleerbare en statische platforms.
    OPMERKING: Houd de muis verdoofd (1,2% isofluraan).
  4. Schakel de motor in om het platform verticaal te oscilleren en pas PHM toe op de muis.
    OPMERKING: Het motortoerental is aangepast om het platform op 2 Hz te oscilleren (zie stap 2.1). Verdoof en plaats de bedieningsmuis eveneens op het PHM-platform, maar laat de motor uit.

3. Rennen van de muis op de loopband

  1. Plaats de muis op de loopbandmachine en stel de loopband in op een gematigde snelheid (10 m/min)13.

4. Kwantificering van de hoofdtrekkingsrespons van muizen (HTR)

  1. Stel de videocamera (framesnelheid: 24 fps) in om de hele ruimte in de transparante plastic behuizing vast te leggen.
    OPMERKING: De plastic kooi werd gebruikt om de muis in het veld van video-opname te houden.
  2. Intraperitoneale toediening van 5-hydroxytryptofaan (5-HTP) (100 mg/kg) (zie Tabel van materialen), de voorloper van 5-HT, aan een muis.
  3. Plaats de muis in de transparante kooi en begin met opnemen gedurende 30 minuten.
  4. Bekijk de opgenomen video (1/2x of 1/3x snelheid) en tel het hoofd dat trilt handmatig.
    OPMERKING: De analisten waren niet blind voor de experimentele procedure. Karakteristieke "tic-achtige" snelle beweging van de muis (zie aanvullende film 1) werd geteld als hoofdtrekkingen, die zelden voorkomen onder normale broedomgevingen.

5. Immunohistochemische analyse van PFC bij muizen

  1. Zodra de HTR-tests zijn voltooid, verdooft u de muis door het mengsel van midazolam (4,0 mg / kg), butorfanol (4,0 mg / kg) en medetomidine (0,3 mg / kg) toe te dienen, perfuseren met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en vervolgens de hersenen wegsnijden na eerder gepubliceerde rapporten14,15.
  2. Post-fix de hersenen in 4% PFA in PBS voor een extra 24 uur bij 4 ° C, en bewaar in 30% sucrose / PBS totdat ze zinken. Vries de vaste optimale snijtemperatuurverbinding (OCT-verbinding, zie Materiaaltabel) in.
  3. Haal de cryo-secties van het muizenbrein uit de diadoos (zie Materiaaltabel). Laat de dia's op schone doekjes op kamertemperatuur totdat de monsters volledig zijn uitgedroogd.
    OPMERKING: Twintig micrometer dikke sagittale secties (lateraal +0,5-1,5 mm) werden bereid uit bevroren monsters ingebed in OCT-verbinding met behulp van een cryostaat (zie Tabel van materialen).
  4. Gebruik een vloeistofblokkerpen (zie Materiaaltabel) om een cirkel rond het cryo-gesegmenteerde weefsel op de dia te tekenen om het verspreidingsgebied van de oplossing te beperken (0,1% Tween-20 in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS-T).
  5. Plaats vochtige doekjes op de bodem van een lade met de dia's om een vochtige omgeving te creëren.
  6. Na permeabilisatie met TBS-T, blok met 4% ezelserum (zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  7. Spoel de dia's eenmaal door 5 minuten onderdompeling in TBS-T.
  8. Breng 100 μL goed verdund primair antilichaam en DAPI (zie Materiaaltabel) mix aan op elke dia, dek de lade af om te voorkomen dat het monster droogt en incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
  9. Spoel driemaal met TBS-T (elk 5 minuten incubatie).
  10. Breng 100 μL aan op de juiste manier verdunde soort-gematchte fluorescerende secundaire antilichaam (geconjugeerd met Alexa Fluor 488, 568 of 645) (zie tabel met materialen) op elke dia en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  11. Spoel driemaal met TBS-T (elk 5 minuten incubatie).
  12. Monteer de dia's met montagemedium (zie Materiaaltabel). Bedek de dia's met coverslips.
  13. Bekijk het monster onder een fluorescentiemicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De piekhoogte van de verticale versnellingen aan de koppen van de ratten tijdens hun loopband met een gematigde snelheid (20 m/min) was ongeveer 1,0 × g (figuur 1C). Het PHM-systeem (figuur 1D) is opgezet om verticale versnellingspieken van 1,0 × g aan de hoofden van de knaagdieren te genereren.

PHM-toepassing (2 Hz, 30 min/dag gedurende 7 dagen) op muizen verzwakte hun HTR aanzienlijk in vergelijking met de controle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het ontwikkelde PHM-applicatiesysteem hebben we aangetoond dat 5-HT-signalering in hun PFC-neuronen mechanisch wordt gereguleerd. Vanwege de complexiteit van de bewegingseffecten is het moeilijk geweest om de gevolgen van lichaamsbeweging in het kader van gezondheidsbevordering precies te ontleden. De focus ligt op mechanische aspecten om de betrokkenheid of bijdrage van metabole gebeurtenissen die kunnen optreden bij of later aan het uitoefenen van activiteiten, zoals energieverbruik, uit te sluiten. De h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen concurrerend belang is verbonden aan het werk dat in dit artikel wordt beschreven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksfonds van het Japanse Ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn; Subsidies-in-Aid for Scientific Research van de Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); MEXT-ondersteund programma voor de Strategic Research Foundation aan particuliere universiteiten, 2015-2019 van het Japanse ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (S1511017); de Naito Science &Engineering Foundation. Dit onderzoek ontving ook financiering van de Alliance for Regenerative Rehabilitation Research &Training (AR3T), die wordt ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), Het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Beroerte (NINDS) en het Nationaal Instituut voor Biomedische Beeldvorming en Bio-engineering (NIBIB) van de National Institutes of Health onder awardnummer P2CHD086843.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-hydroxytryptophan (5-HTP)Sigma-AldrichH9772Serotonine (5-HT) precursor
Borstelloze motordriverOriental motorBMUD30-A2Toerentalverandering ingebouwde motordriver
C57BL/6 muizenOriental yeast companyC57BL/6JMuizen gebruikt in dit onderzoek
CryostatLeicaCM33050SMicrotoom om bevroren monsters te snijden
DC MotorOriental motorBLM230-GFV2Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568InvitrogenA-11057Secundaire antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571Secundaire antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Secundaire antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
Donkey serumSigma-AldrichS30-100MLBlokker van niet-specifieke binding van antilichamen bij immunohistochemische kleuring
FluorescentiemicroscoopKeyenceBZ-9000Fluorescentiemicroscoop
Geast polyklonaal anti-5-HT2A receptorSanta Cruz Biotechnologysc-15073Primair antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
IsofluraanPfizerv002139Inhalatieanestheticum
KimWipeNIPPON PAPER CRECIAS-200Papierdoek voor het schoonmaken van oppervlakken, onderdelen, instrumenten in het laboratorium
Liquid BlockerDaido SangyoPAP-SMarkering om het diaoppervlak waterafstotend te maken
Mouse monoklonaal anti-NeuN (clone A60)EMD Millipore (Merck)MAB377Primair antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
NinjaScan-LightSwitchscienceSSCI-023641Accelerometer om versnellingen te meten
OCT compoundSakura Finetek45833Inbeddingsmiddel voor het bereiden van bevroren weefselsecties
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934Bevestigingsmedium om bloei te voorkomen
Rabbit polyklonaal anti-c-FosSanta Cruz Biotechnologysc-52Primair antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
Slide boxAS ONE03-448-1Ondoorzichtige doos om dia's op te bergen
Spike2Cambridge electronic design limited (CED)N/AToepassingssoftware gebruikt om versnelling te analyseren
Sprague-Dawley rattenJapan SLCSlc:SDRatten gebruikt in dit onderzoek
LoopbandmachineMuromachiMK-680Systeem gebruikt in experimenten met gedwongen hardlopen van ratten en muizen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
  2. Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).
  3. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  4. Sakitani, N., et al. Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes. Journal of Visualized Experiments. (151), e59475(2019).
  5. Miyazaki, T., et al. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Scientific Advances. 5 (9), (2019).
  6. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).
  7. Canli, T., Lesch, K. -P. Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).
  8. Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders. Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).
  9. Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).
  10. Canal, C. E., Morgan, D. Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model. Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).
  11. Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement. Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).
  12. Kim, S. -E., et al. Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus. Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).
  13. Li, H., et al. Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress. Brain Research. 1531, 1-8 (2013).
  14. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  15. Ryu, Y., et al. Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons. iScience. 23 (2), 100874(2020).
  16. Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice. FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).
  17. Wang, J., et al. Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes. Experimental Neurology. 330, 113325(2020).
  18. Pacák, K. Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Physiological Research. 49, 11-17 (2000).
  19. Okamoto, M., Soya, H. Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis. The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Passive Head MotionVertical AccelerationTreadmill RunningMechanical StimulationPrefrontal Cortex5 HT2A ReceptorHead Twitch ResponseImmunostaining ProtocolFluorescence MicroscopySerotonin Signaling

Gerelateerde artikelen