De fabricage en werking van een continu flow, micro-elektroporatiesysteem met permeabilisatiedetectie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de microfabricagetechnieken die nodig zijn om een lab-on-a-chip, microfluïdisch elektroporatieapparaat te bouwen. De experimentele opstelling voert gecontroleerde transfecties op één celniveau uit in een continue stroom en kan worden uitgebreid naar hogere doorvoersnelheden met populatiegebaseerde controle. Er wordt een analyse verstrekt die de mogelijkheid toont om de mate van celmembraanpermeabilisatie in realtime elektrisch te bewaken.

Samenvatting

Huidige therapeutische innovaties, zoals CAR-T-celtherapie, zijn sterk afhankelijk van viraal gemedieerde genafgifte. Hoewel efficiënt, gaat deze techniek gepaard met hoge productiekosten, wat heeft geleid tot een interesse in het gebruik van alternatieve methoden voor genafgifte. Elektroporatie is een elektrofysische, niet-virale benadering voor de intracellulaire afgifte van genen en andere exogene materialen. Bij het aanbrengen van een elektrisch veld maakt het celmembraan tijdelijk moleculaire afgifte in de cel mogelijk. Meestal wordt elektroporatie uitgevoerd op de macroschaal om grote aantallen cellen te verwerken. Deze aanpak vereist echter uitgebreide empirische protocolontwikkeling, wat kostbaar is bij het werken met primaire en moeilijk te transfecteren celtypen. Langdurige protocolontwikkeling, in combinatie met de vereiste van grote spanningen om voldoende elektrische veldsterkten te bereiken om de cellen te permeabiliseren, heeft geleid tot de ontwikkeling van elektroporatie-apparaten op microschaal. Deze micro-elektroporatie-apparaten worden vervaardigd met behulp van gangbare microfabricagetechnieken en zorgen voor een grotere experimentele controle met het potentieel om hoge doorvoermogelijkheden te behouden. Dit werk bouwt voort op een microfluïdische elektroporatietechnologie die in staat is om het niveau van celmembraanpermeabilisatie op eencellig niveau onder continue stroom te detecteren. Deze technologie was echter beperkt tot 4 cellen die per seconde werden verwerkt, en daarom wordt hier een nieuwe aanpak voor het verhogen van de systeemdoorvoer voorgesteld en gepresenteerd. Deze nieuwe techniek, aangeduid als celpopulatie-gebaseerde feedbackcontrole, beschouwt de celpermeabilisatierespons op een verscheidenheid aan elektroporatiepulserende omstandigheden en bepaalt de meest geschikte elektroporatiepulsomstandigheden voor het celtype dat wordt getest. Vervolgens wordt een modus met een hogere doorvoer gebruikt, waarbij deze 'optimale' puls wordt toegepast op de celsuspensie tijdens het transport. De stappen voor het fabriceren van het apparaat, het opzetten en uitvoeren van de microfluïdische experimenten en het analyseren van de resultaten worden in detail gepresenteerd. Ten slotte wordt deze micro-elektroporatietechnologie gedemonstreerd door een DNA-plasmide af te leveren dat codeert voor groen fluorescerend eiwit (GFP) in HEK293-cellen.

Inleiding

Huidige therapeutische innovaties in biomedisch onderzoek, zoals CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) celtherapie en genetische bewerking met behulp van CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, zijn sterk afhankelijk van het vermogen om exogene stof zowel succesvol als efficiënt in de intracellulaire ruimte af te leveren¹. In CAR-T-therapie is de gouden standaard om de genafgiftestap uit te voeren in de productie van celtherapie het gebruik van virale vectoren². Hoewel viraal-gemedieerde genafgifte een efficiënte leveringsmodaliteit is, heeft het ook verschillende nadelen. Deze omvatten productiekosten, cytotoxiciteit, immunogeniciteit, mutagenese/tumorigenesepotentieel en groottebeperkingen op het te leveren gen(en)³. Deze beperkingen hebben geleid tot het onderzoek en de ontwikkeling van alternatieve, niet-virale toedieningstechnologieën.

Elektroporatie, een alternatief voor virale gemedieerde genafgifte, vertrouwt op de toepassing van een optimale elektrische pulsgolfvorm om DNA-, RNA- en eiwittransfecties van cellen uit te voeren. Na de toepassing van een extern elektrisch veld wordt het celmembraan kortstondig aangetast, waardoor de cel gevoelig wordt voor de intracellulaire afgifte van anders ondoordringbare exogene materialen⁴. In vergelijking met virale gemedieerde toediening is elektroporatie voordelig omdat het over het algemeen veilig is, gemakkelijk te bedienen en lage bedrijfskosten heeft. Elektroporatie kan zowel kleine als grote moleculaire lading leveren en kan efficiënt zijn in het transfecteren van cellen, ongeacht afstamming⁵. Om gewenste resultaten na elektroporatie te bereiken, d.w.z. een goede levensvatbaarheid en een goede elektrotransfectie-efficiëntie, moeten verschillende experimentele parameters worden geco-geoptimaliseerd. Deze omvatten celtype⁶, celdichtheid, molecuulconcentratie⁷, elektroporatiebuffereigenschappen (bijv. Moleculaire samenstelling, geleidbaarheid en osmolariteit)⁸, elektrodegrootte/geometrie⁹ en elektrische pulsgolfvorm (vorm, polariteit, aantal pulsen)¹⁰ (zie figuur 1 voor een illustratie). Hoewel elk van deze parameters een significant effect kan hebben op de uitkomsten van elektroporatie-experimenten, is de pulsgolfvorm vooral in detail bestudeerd, omdat de elektrische energie van de toegepaste puls (en) de wortel is van de intrinsieke afweging tussen de resulterende cel levensvatbaarheid en elektrotransfectie-efficiëntie⁸.

Typisch worden elektroporatie-experimenten uitgevoerd op macroschaal, waarbij cellen worden opgehangen in 100s microliter buffer tussen een set grote, parallelle plaatelektroden in een elektroporatiecuvet. De elektroden worden meestal vervaardigd uit aluminium met een elektrodeafstand van 1-4 mm. Zodra de cellen handmatig via de pipet zijn geladen, wordt de cuvette elektrisch verbonden met een omvangrijke, elektrische pulsgenerator waar de gebruiker de pulsgolfvormparameters kan instellen en toepassen om de celsuspensie te elektropoteren. Hoewel macroschaal of bulkelektroporatie celdichtheden > 10⁶ cellen / ml kan verwerken, kan deze functie verspillend zijn bij het optimaliseren van de instellingen voor de elektrische pulsgolfvorm. Dit is met name van belang bij het elektropoderen van primaire celtypen waarbij de celpopulatieaantallen beperkt kunnen zijn. Bovendien moet de pulsgenerator vanwege de grote afstand tussen de elektroden grote spanningen kunnen leveren om elektrische veldsterktes te bereiken >1kV / cm¹¹. Deze hoge spanningen veroorzaken resistieve vermogensdissipatie door de elektrolytenbuffer, wat resulteert in Joule-verwarming, wat schadelijk kan zijn voor de resulterende levensvatbaarheid van de cel¹². Ten slotte zal het uitvoeren van elektroporatie op een dichte suspensie van cellen consequent worden belast met een aangeboren variabiliteit in de resulterende elektrotransfectie-efficiëntie en cel levensvatbaarheid. Elke cel in suspensie kan een andere elektrische veldsterkte ervaren als gevolg van de omliggende cellen. Afhankelijk van of de ervaren elektrische veldsterkte wordt verhoogd of verlaagd, kan de resulterende levensvatbaarheid van de cel of de efficiëntie van elektrotransfectie elk negatief worden beïnvloed¹¹. Deze nadelen van elektroporatie op macroschaal hebben geleid tot het nastreven en ontwikkelen van alternatieve technologieën die op microschaal werken en een betere controle op het niveau van één cel mogelijk maken.

Het gebied van BioMEMS, of biomedische micro-elektromechanische systemen, komt voort uit de technologische vooruitgang in de micro-elektronica-industrie. In het bijzonder het gebruik van microfabricageprocessen om micro-apparaten te ontwikkelen voor de vooruitgang van biomedisch onderzoek. Deze ontwikkelingen omvatten de ontwikkeling van micro-elektrode-arrays voor in vivo elektrische monitoring¹³, capacitieve micro-elektroden voor in situ elektroporatie¹⁴, geminiaturiseerde organ-on-a-chip-apparaten¹⁵, microfluïdische point-of-care diagnostiek¹⁶, biosensoren¹⁷ en medicijnafgiftesystemen¹⁸, inclusief nano- en micro-elektroporatieapparaten 19,20,21 . Vanwege de mogelijkheid om apparaten te ontwerpen en te produceren op dezelfde schaal als biologische cellen, zijn nano- en micro-elektroporatietechnologieën voordelig in vergelijking met hun tegenhanger op macroschaal^22,23. Deze elektroporatie-apparaten elimineren de vereiste van hoogspanningspulstoepassingen, omdat elektrodesets met afstanden van 10s tot 100s van micrometers meestal zijn geïntegreerd. Deze functie vermindert de stroom door de elektrolyt drastisch, wat op zijn beurt de accumulatie van toxische elektrolyseproducten en de effecten van Joule-verwarming in deze systemen vermindert. De kanalen op microschaal zorgen er ook voor dat een veel uniformer elektrisch veld betrouwbaar wordt toegepast op de cellen tijdens de pulstoepassing, wat resulteert in consistentere resultaten²⁴. Daarnaast is het ook gebruikelijk dat micro-elektroporatie-apparaten worden geïntegreerd in een microfluïdisch platform dat zich leent voor toekomstige integratie in een volledig geautomatiseerde technologie, een zeer wenselijke mogelijkheid in de productie van celtherapie²⁵. Ten slotte maakt elektroporatie op microschaal de elektrische ondervraging van elektroporatiegebeurtenissen mogelijk. De mate van celmembraanpermeabilisatie kan bijvoorbeeld in realtime worden bewaakt op een enkel celniveau^26,27. Het doel van deze methode is om de microfabricage, systeemwerking en analyse te beschrijven van een microfluïdisch, eencellig micro-elektroporatieapparaat dat in staat is om de mate van celmembraanpermeabilisatie te meten voor het optimaliseren van elektroporatieprotocollen, maar toch de doorvoer te verhogen ten opzichte van de vorige state-of-the-art.

Het uitvoeren van elektroporatie op eencellig niveau is niet langer een nieuwe techniek, zoals het voor het eerst werd aangetoond door Rubinsky et al. in 2001 met de ontwikkeling van een statische celelektroporatietechnologie²⁸. Hun micro-apparaat was innovatief omdat ze de eersten waren die het vermogen demonstreerden om het geval van elektroporatie elektrisch te volgen. Dit heeft verder geleid tot de ontwikkeling van statische, eencellige elektroporatietechnologieën die in staat zijn om de mate van celmembraanpermeabilisatie op een parallelle manier elektrisch te detecteren om de doorvoer van de apparaten te verhogen. Maar zelfs met parallellisatie en batchverwerking missen deze apparaten ernstig het totale aantal cellen dat ze per tijdseenheid^{kunnen verwerken 29,30}. Deze beperking heeft geleid tot de ontwikkeling van doorstroomapparaten die in staat zijn om micro-elektroporatie op eencellig niveau uit te voeren met een veel grotere doorvoer³¹. Deze apparaatovergang, van statische naar doorstroomomgeving, beperkt de mogelijkheid om de mate van celmembraanpermeabilisatie elektrisch te bewaken na de toepassing van de elektroporatiepuls. De methode die in dit werk wordt beschreven, overbrugt de kloof tussen deze twee technologieën, een micro-elektroporatietechnologie die in staat is om de mate van celmembraanpermeabilisatie van individuele cellen elektrisch te detecteren, pulseren en bewaken, op een continue stroom, seriële manier.

Deze technologie werd onlangs beschreven in Zheng et al. In dat werk werden de mogelijkheden van deze technologie geïntroduceerd met de voltooiing van een parametrische studie, waarbij zowel de amplitude als de duur van de elektroporatiepuls werden gevarieerd en het daaropvolgende elektrische signaal, indicatief voor celmembraanpermeabilisatie, werd onderzocht³². De resultaten toonden aan dat een toename van de intensiteit van de elektroporatiepuls (d.w.z. toename van het toegepaste elektrische veld of toename van de pulsduur) een toename van de gemeten celmembraanpermeabilisatie veroorzaakte. Om het systeem verder te valideren, werd een gemeenschappelijke fluorescerende indicator van succesvolle elektroporatie, propidiumjodide³³, toegevoegd aan de celsuspensie en werd een fluorescentiebeeld vastgelegd onmiddellijk na het aanbrengen van de elektrische puls. Het optische signaal, d.w.z. de fluorescentie-intensiteit van propidiumjodide in de cel, was sterk gecorreleerd met de elektrische meting van de mate van celmembraanpermeabilisatie, waardoor de betrouwbaarheid van deze elektrische meting werd geverifieerd. Dit werk hield echter alleen rekening met de levering van het kleine molecuul propidiumjodide, dat weinig tot geen vertaalbare betekenis heeft.

In dit werk wordt een nieuwe toepassing van deze technologie geïntroduceerd om de doorvoer van het systeem te verbeteren, terwijl een biologisch actieve plasmide-DNA (pDNA) -vector wordt afgeleverd en de elektrotransfectie-efficiëntie van cellen die opnieuw worden geplateerd en gekweekt na elektroporatie wordt beoordeeld. Hoewel het vorige werk beter presteert dan bestaande micro-elektroporatietechnologieën die in staat zijn om elektrisch de gebeurtenis van elektroporatie te meten, vereist de huidige toestand van het apparaat nog steeds lange celtransittijden tussen de elektrodenset (~ 250 ms) om de celdetectie, pulstoepassing en de celmembraanpermeabilisatiemeting uit te voeren. Met een enkel kanaal beperkt dit de doorvoer tot 4 cellen/s. Om deze beperking te bestrijden, wordt een nieuw concept van op celpopulatie gebaseerde feedbackgestuurde elektroporatie geïntroduceerd om pDNA-elektrotransfectie uit te voeren. Door gebruik te maken van een hypofysiologische geleidbaarheid elektroporatiebuffer, maakt dit systeem de elektrische ondervraging van afzonderlijke cellen mogelijk in een groot aantal elektroporatiepulstoepassingen. Op basis van de elektrische respons wordt vervolgens een 'optimale' elektroporatiepuls bepaald. Vervolgens wordt een 'high-throughput'-modus geïmplementeerd waarbij de bepaling van de celmembraanpermeabilisatie teniet wordt gedaan, het debiet wordt verhoogd en de duty cycle van de elektroporatiepuls wordt afgestemd op de transittijd van de cel om één puls per cel in transit tussen de elektroden te garanderen. Dit werk zal uitgebreide details geven over de microfabricagestappen voor de productie van het micro-apparaat, het materiaal / de apparatuur en hun opstelling die nodig is om de experimenten uit te voeren, en de werking / analyse van het apparaat en zijn elektrotransfectie-efficiëntie (eTE).

Figuur 1: Experimentele factoren die van invloed zijn op de uitkomsten van elektroporatie. (Links) Celsuspensie-Belangrijke factoren om te overwegen voorafgaand aan het begin van elektroporatie zijn: Payload (in dit geval pDNA), concentratie, celdichtheid en elektroporatiebuffereigenschappen. Elektroporatiebuffereigenschappen om te overwegen zijn geleidbaarheid, osmolariteit en de exacte moleculaire samenstelling die bijdraagt aan deze waarden. (Midden) Pulstoepassing - Het exacte pulstype (blokgolf versus exponentieel verval) en pulsgolfvorm (enkele puls versus pulstrein) moeten worden geoptimaliseerd om zowel de resulterende levensvatbaarheid van de cel als de efficiëntie van elektrotransfectie te maximaliseren. Gemeenschappelijke pulstreinen die worden geïmplementeerd in elektroporatieprocessen zijn meestal samengesteld uit een reeks hoogspanningspulsen (HV) of een reeks pulsen die roteren tussen HV- en laagspanningspulsen (LV). (Rechts) Cell Recovery-Down-stream verwerkingsstappen, in het bijzonder de recovery cell culture media waar cellen naar worden overgebracht, moeten worden geoptimaliseerd. Niet weergegeven (uiterst links), kunnen extra upstream celverwerkingsstappen worden geïmplementeerd voor algehele elektroporatieprocesoptimalisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Gebruikers moeten alle VIB's controleren op de materialen en benodigdheden die in dit protocol worden gebruikt. Bij elke stap moeten geschikte PBM's worden gedragen en steriele technieken die tijdens experimenten worden gebruikt. In secties 1-7 wordt de fabricage van het apparaat besproken.

1. Fabricage van het apparaat - Maskerontwerp

OPMERKING: Zie figuur 2 voor een illustratie van het microfabricageproces. De microfabricagestappen moeten worden uitgevoerd in een cleanroomomgeving. Extra PBM's zijn nodig (haarnetje, gezichtshaarnetje, masker, cleanroompak, schoenovertrekken).

1. Installeer een CAD-software naar keuze, ontwerp een 2-dimensionaal 'masker' van zowel het microfluïdische kanaal als de elektroden en sla het ontwerp op in het gewenste bestandsformaat (d.w.z. .dxf, .dwg).
   OPMERKING: Raadpleeg Aanvullende figuur 1 voor een voorbeeld van een 2-dimensionaal maskerschema.
2. Stuur naar een leverancier naar keuze om te worden afgedrukt. Zorg ervoor dat de afmetingen van de ontwerpen binnen de resolutiemogelijkheden van de leverancier liggen.

2. Fabricage van apparaten - Fotolithografie

OPMERKING: De meegeleverde microfabricagerecepten zijn overgenomen van de aanbevelingen van de fabrikant van de fotoresisten en mogen alleen als uitgangspunt worden gebruikt³⁴. Exacte waarden voor baktijden, belichtingstijden, enz., Moeten worden geoptimaliseerd voor elk fabricageprotocol. Het wordt aanbevolen om een waferpincet te gebruiken voor het hanteren van zowel siliciumwafers als glazen dia's.

1. Microfluïdische kanaalfabricage
   1. Siliciumwafer en soda-kalkglas schuifreiniging: Volg stappen 2.1.2-2.1.3 om siliciumwafer en 1" × 3" soda-lime glasplaatreiniging uit te voeren (beide aangeduid als 'substraat').
   2. Dompel de substraten onder in een acetonbad, een isopropanol (IPA) bad en een gedeïoniseerd waterbad gedurende elk 10 minuten. Voer deze 3-staps was serieel uit bij kamertemperatuur.
   3. Verwijder en droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron. Plaats de substraten minimaal 30 minuten in een oven van 150 °C om verdamping van het resterende vocht mogelijk te maken.
   4. SU-8 fotolithografie op silicium wafer: Voer fotolithografie uit op de silicium wafer volgens stappen 2.1.5-2.1.14.
      OPMERKING: Om een microfluïdische kanaalhoogte van 20 μm te bereiken, werd SU-8 2000-serie negatieve fotoresist gebruikt. Exacte spinsnelheden variëren afhankelijk van de formulering van SU-8 (d.w.z. 2010, 2015, enz.); de volgende voorwaarden zijn echter voor de SU-8 2010 formulering³⁵.
   5. Haal de siliconen wafer uit de oven van 150 °C en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur (RT).
   6. Bevestig de wafer aan de klauwplaat van de wafer spin coater met behulp van het vacuümsysteem van de spin coater. Programmeer de spinner. Stap 1 - 500 tpm voor 10 s bij een acceleratie van 100 tpm / s, stap 2 - 1000 tpm voor 30 s bij een acceleratie van 300 tpm / s.
   7. Doseer 4 ml SU-8 2010 fotoresist op het midden van de siliciumwafer. Voer het programma uit. Zodra het systeem tot stilstand komt, schakelt u de stofzuiger uit.
   8. Breng met een pincet de SU-8 gecoate siliciumwafer gedurende 4-5 minuten over op een hete plaat bij 95 °C voor zacht bakken. Haal vervolgens de wafer van de hete plaat en laat deze afkoelen tot RT.
      OPMERKING: Volg de juiste opstartprocedure voor de labspecifieke fotolithografische maskeropstelling.
   9. Bevestig het fotomasker met de 2D microfluïdische kanaalontwerpen op de maskerhouder. Plaats de siliciumwafer, met de SU-8-coating naar boven gericht, op de waferhouder.
   10. Stel de belichtingsinstellingen in op 150 mJ/cm² en laat de machine draaien.
       LET OP: Kijk niet direct naar de UV-lichtbron om mogelijke oogbeschadiging te voorkomen.
   11. Plaats de SU-8 gecoate siliciumwafer op een hete plaat bij 95 °C gedurende 4-5 minuten voor het bakken na blootstelling.
   12. Dompel de siliciumwafer gedurende 3-4 minuten onder in de SU-8 developer solution (zie Materiaaltabel). Breng zachte agitatie aan. Verwijder de wafer uit de oplossing en spoel het oppervlak af met IPA.
   13. Droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron. Inspecteer de functies onder een microscoop met behulp van een UV-filter en zorg ervoor dat er geen duidelijke defecten in de microfluïdische kanalen zijn.
   14. Zet de siliciumwafel minimaal 30 min in een oven van 150 °C voor een harde bak.
   15. Laat afkoelen tot RT en gebruik stylus profilometrie om de exacte hoogte en helling van de zijwanden van het kanaal te meten.
2. Fotolithografie op glasdia's
   OPMERKING: Hexamethyldisilazane (HMDS) wordt gebruikt als adhesiebevorderaar voor de S1818 positieve fotoresist³⁶.
   1. Haal de glasschuif uit de oven van 150 °C en laat deze afkoelen tot RT.
   2. Bevestig de glazen schuif met behulp van vacuüm aan de klauwplaat van de spinner en programmeer de spinner. Stap 1 - 500 tpm gedurende 10 s bij een acceleratie van 100 tpm / s. Stap 2 - 3000 tpm voor 30 zat een versnelling van 300 rpm / s.
   3. Doseer 3-4 druppels HMDS over het oppervlak van de glasplaat. Voer het programma uit.
      OPMERKING: Om een oppervlaktecoating van ~ 3 μm te bereiken, moet S1800 positieve fotoresist-serie worden gebruikt. Exacte spinsnelheden variëren afhankelijk van de formulering; de onderstaande aanbevelingen zijn voor de S1818-formulering³⁴.
   4. Doseer 1 ml fotoresist op het oppervlak van de glasplaat. Zorg voor voldoende om het oppervlak te bedekken.
   5. Voer het programma uit. Zodra het systeem tot stilstand komt, schakelt u het vacuüm uit en verwijdert u de glazen schuif.
   6. Plaats de S1818 gecoate glasschuif op een hete plaat op 120 °C gedurende 4 minuten voor een zachte bakbeurt. Verwijderen en laten komen naar RT.
   7. Bevestig het fotomasker met de 2D-elektrodeontwerpen op de maskerhouder.
   8. Plaats en lijn de glasschuif, met de S1818-coating naar boven gericht, op de waferhouder. Stel de belichtingsinstellingen in op 250 mJ/cm² en laat de machine draaien.
      OPMERKING: Verschillende contact alignermodellen kunnen min of meer geschikt zijn voor niet-cirkelvormige substraten van verschillende dikte.
   9. Dompel de glazen schuif onder in de MF-319 developer-oplossing gedurende 2 minuten. Breng zachte agitatie aan. Spoel het oppervlak van de glasplaat af met gedeïoniseerd water.
   10. Droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron en observeer de kenmerken onder een microscoop met behulp van een UV-filter. Zorg ervoor dat er geen duidelijke defecten zijn in de lithografische patronen.
   11. Plaats de glasglaas in de oven van 150 °C en zorg ervoor dat het substraatoppervlak naar boven is gericht, gedurende minimaal 30 minuten voor een harde bakbeurt. Haal uit de oven en bescherm tegen licht.

3. Fabricage van het apparaat: Fluorwaterstofzuur (HF) ets

LET OP: Deze stap omvat de behandeling en verwijdering van fluorwaterstofzuur (HF), dat diepe, pijnlijke chemische brandwonden kan veroorzaken. Extra PBM's moeten worden gebruikt om de handler te beschermen (gezichtsscherm, chemisch resistente handschoenen over ellebooglengte, chemisch resistent schort met mouwen). Calciumgluconaatzuur neutralisator en huidgel moeten in de buurt van de laboratoriumbank worden gehouden. Deze stap mag niet alleen worden uitgevoerd. HF mag nooit worden opgeslagen in of afgegeven in glazen containers, omdat de container door het zuur wordt geëtst.

OPMERKING: De HF etst het blootgestelde glas (d.w.z. het elektrodeontwerp) gelijkmatig om een uitsparing in het glas te vormen, waardoor een betere randresolutie van het elektrodepatroon na metaalafzetting mogelijk is (sectie 4).

1. Dompel de glasschuif gedurende 1 minuut onder in een 10:1 gebufferde HF-oplossing in een polytetrafluorethyleencontainer. Breng de glasglijbanen over en was ze in gedeïoniseerd water. Herhaal de wasstap 3 keer.
2. Droog het oppervlak met behulp van een stikstof onder druk of gefilterde luchtgasbron. Plaats glazen substraten een nacht in een oven van 65 °C om eventueel achtergebleven vocht te verwijderen. Bedek de substraten tegen licht.

4. Fabricage van het apparaat: fysieke dampafzetting

OPMERKING: Deze stap omvat de metaalafzetting op de glasschrastraten om de elektrodepatronen te definiëren. Veelgebruikte metaalelektroden zijn chroom/goud en titanium/platina. Goud en platina hechten zich niet aan het glazen substraat, dus een zaadhechtingslaag van respectievelijk chroom of titanium is vereist om adhesie³⁷ te bevorderen.

1. Volg het cleanroom-specifieke protocol om het interne PVD-systeem te bedienen. Dit werk maakt gebruik van een DC sputtersysteem en sputter met 100 SCCM Argon gas bij een druk van ~8 mTorr en 200 W vermogen.
2. Sputter titanium gedurende 8 minuten met een snelheid van ~100 Å/min. Sputter platina gedurende 10 minuten met een snelheid van ~200 Å/min. Verwijder de substraten uit de PVD-kamer.

5. Fabricage van het apparaat: Photoresist lift-off

OPMERKING: Deze stap omvat het oplossen van de fotoresistlaag in een acetonbad, waardoor de gehechte platina-elektroden op de glazen dia's worden achtergelaten.

1. Dompel de met metaal beklede glasglijbanen gedurende ~ 10 minuten onder in een acetonbad.
2. Soniceer het bad om agitatie te introduceren om de niet-geherdeed metalen film te breken. Gebruik een met aceton doordrenkt doekje om eventuele resten indien nodig te verwijderen.
3. Zodra alle fotoresist/metaal is verwijderd, wast u de elektrodepatronen met gedeïoniseerd water en plaatst u ze 's nachts in een oven van 65 °C om het resterende oppervlaktevocht te verwijderen.
4. Gebruik stylusproilometrie om het profiel van de patroonelektroden te meten.

6. Fabricage van het apparaat: zachte lithografie

OPMERKING: Deze stap omvat het replicagieten van het microfluïdische kanaal op de SU-8 masterreliëfstructuur met behulp van een elastomeer, polydimethylsiloxaan (PDMS).

1. Silicium wafer silanisatie
   OPMERKING: Dit is een optionele stap; het zal echter de levensduur van de SU-8-reliëfstructuur die in subsectie 2.1 is vervaardigd, verlengen. Deze stap moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.
   1. Bevestig de wafel aan de bodem van een petrischaal en plaats de petrischaal in een exsiccator.
   2. Omring de omtrek van de siliciumwafer met ongeveer 50 μL trichlooriso (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan. Sluit vacuüm (vacuümpomp of huisvacuümleiding) aan en laat 20 minuten draaien.
2. PDMS replica molding
   1. Meng in een wegwerpcontainer (bijv. weegboot, plastic beker) PDMS-elastomeerbasis tot verharder met een gewichtsverhouding van 10: 1 bovenop een elektronische balans. Giet de PDMS-oplossing over de siliciumwafer en plaats het mengsel onder een vacuüm om alle luchtbellen te verwijderen.
   2. Uitharden bij 65 °C gedurende minimaal 4 uur waardoor het PDMS kan stollen. Snijd met behulp van de punt van een scheermesje het gegoten PDMS uit en schil uit de siliciumwafer.
   3. Verwijder met behulp van een geslepen biopsiepunch PDMS uit de in- / uitlaten van het apparaat. Voor dit apparaat werden respectievelijk 0,75 mm en 3 mm biopsieponsen gebruikt voor de inlaten en de uitlaten.
      OPMERKING: De gebruikte biopsiepons moet een iets kleinere diameter hebben dan de buitendiameter van de onderling verbonden buis om een strakke afdichting van buizen in de reservoirs te garanderen.
3. Sonicatie reiniging van PDMS
   1. Dompel de PDMS-apparaten onder in IPA en plaats ze gedurende 30-45 minuten in een sonicator om PDMS-vuil van de inlaat / uitgangen te verwijderen. PDMS kan opzwellen in de IPA-oplossing.
   2. Spoel af met gedeïoniseerd water en plaats een nacht in een oven van 65 °C om het PDMS weer te laten opzwellen tot de normale grootte.
      OPMERKING: Eventuele restjes kunnen het apparaat tijdens het experimenteren verstoppen. Grote stukken puin kunnen van het PDMS-oppervlak worden verwijderd met behulp van een stuk plakband voorafgaand aan ultrasoonapparaat.

7. Fabricage van het apparaat: PDMS-binding / draadbevestiging

OPMERKING: Deze stap omvat het behandelen van het oppervlak van het PDMS en het glazen substraat met een zuurstofplasma om een onomkeerbare binding te vormen tussen het PDMS en glas³⁸. Het kan nodig zijn om het verstrekte recept aan te passen aan het exacte systeem dat in het laboratorium wordt gebruikt.

1. Snijd de apparaten op maat en zorg ervoor dat het oppervlak van het PDMS-apparaat schoon is. Als u niet opnieuw reinigt, volgt u de stappen in subsectie 6.3.
2. Programmeer de plasmagenerator. Stel vermogen in op 70 W, tijd op 35 s, druk op 325 mTorr, stroomsnelheid van zuurstofgas op 60 SCCM. Plaats PDMS en elektrode glas schuif in het systeem met de functies naar boven gericht en voer het programma uit.
3. Verwijder de apparaten en lijn snel kanaalfuncties uit op de elektroden met behulp van een stereoscoop. Oefen stevig druk uit vanuit het midden van het PDMS naar de zijkanten om ongewenste luchtbellen op de verlijmingsinterface te verwijderen.
4. Plaats op een hete plaats bij 95 °C gedurende ten minste 2 minuten om de hechtingsprocedure af te ronden en laat het apparaat afkoelen bij RT.
5. Knip 2 stukken 22-G massieve draad op ~ 6 "lengtes en strip de isolator van beide uiteinden.
6. Verlijm de draden aan elektrodepads met behulp van zilvergeleidende epoxy. Plaats de afgewerkte apparaten 's nachts in een oven van 65 °C.

Figuur 2: Fabricage van microdevice. (A) Microfluïdische kanaalfabricage- Belangrijkste stappen: siliciumwaferreiniging (stappen 2.1.1-2.1.3), fotoresistcoating en zachte bak (stappen 2.1.7-2.1.8), UV-blootstelling (stap 2.1.10), ontwikkeling (stap 2.1.12) en PDMS-gieten (subsectie 6.2). (B) Elektrodefabricage-Belangrijkste stappen: glasglijden reinigen (stappen 2.1.1-2.1.3), HMDS-coating en fotoresistcoating (stappen 2.2.3-2.2.4), UV-blootstelling (stap 2.2.8), ontwikkeling (stap 2.2.9), HF-ets (sectie 3), fysieke dampafzetting (sectie 4) en fotoresist lift-off (sectie 5). (C) Stappen voor apparaatafrondingssleutel: toegang tot inlaat-/uitlaatopening en ultrasoonapparaat (stap 6.2.3 en paragraaf 6.3), PDMS-binding en draadbevestiging (sectie 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Celkweek en oogst

OPMERKING: Standaard celkweek en steriele behandelingsprocedures moeten worden gebruikt. Volg het celtypespecifieke protocol voor celkweek.

1. Celkweek
   1. Celpassage: Kweek en passeer de cellen volgens de stappen 8.1.2-8.1.5.
   2. Kweek HEK293-cellen in complete DMEM-oplossing (88% DMEM, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% L-glutamine, 1% penicilline-streptomycine) in een T25-kolf in een couveuse bij 37 °C, 95% O2, 5% CO2. Passagecellen op schema bij het bereiken van ~80% samenvloeiing.
   3. Ontlucht de media met behulp van een pipet of vacuümsysteem en incubeer de cellen in 0,25% trypsine-EDTA (2 ml-T25 kolf) gedurende 2 minuten bij 37 °C. Neutraliseer trypsine met tweemaal het volume van cultuurmedia.
   4. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer HEK293-cellen bij 770 x g gedurende 2 minuten. Aspirateer het supernatant met behulp van een pipet of vacuümsysteem
   5. Resuspend HEK293 cellen in 1 ml voorverwarmde DMEM.
   6. Cell plating: Plaats de cellen volgens de stappen 8.1.7-8.1.8
   7. Plaats de cellen in een verdunning van 10:1 tot 20:1 in een T25-kolf (5 ml DMEM) om de kweek voort te zetten.
   8. Plaats de cellen op een verdunning van 5:1 tot 20:1 in een 6-well plaat (2 ml DMEM per put) die moet worden geoogst voor elektroporatie-experimenten.
      OPMERKING: HEK293-cellen verguld 24 uur voorafgaand aan elektroporatie-experimenten om ~ 70% confluentie te bereiken bij celoogst (subsectie 8.3). Een inconsistent oogstschema kan leiden tot variabiliteit in elektroporatieresultaten.
2. Elektroporatiebuffer
   1. Elektroporatiebuffer voorbereiden
      OPMERKING: Raadpleeg Sherba et al. voor details over het elektroporatiebufferpreparaat⁸. De buffersamenstelling was 285 mM Sucrose, 0,7 mM MgCl₂, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolaliteit: 310 mOsm, geleidbaarheid: 500 μS/cm). De elektroporatiebuffer moet steriel worden geformuleerd en bij 4 °C worden bewaard gedurende een houdbaarheid van ~1 maand. De formulering van de elektroporatiebuffer moet per celtype worden geoptimaliseerd.
3. Celoogst en pDNA-toevoeging
   1. Volg dezelfde stappen als celpassage (8.1.2-8.1.4).
   2. Was de cellen in steriele 1x PBS, transfer-cel suspensie in een conische buis van 15 ml en centrifugeer cellen op 770 x g gedurende 2 min.
   3. Was HEK293 cel pellet in de elektroporatie buffer en centrifuge op 770 x g gedurende 2 min. Resuspendeer de cellen in de elektroporatiebuffer op ~ 5 miljoen cellen / ml.
      OPMERKING: De celdichtheid moet per celtype worden geoptimaliseerd.
   4. Voeg pDNA-codering voor groen fluorescerend eiwit (GFP) toe aan een eindconcentratie van 20 μg/ml. Meng voorzichtig de pDNA/celsuspensie en breng de suspensie over in een spuit van 1 cc om te experimenteren.

9. Hardware/experimentele installatie

OPMERKING: Voordat u cellen oogst voor experimenten, moet u ervoor zorgen dat de experimentele opstelling is voltooid om de hoeveelheid tijd dat de cellen in de elektroporatiebuffer zijn opgehangen te minimaliseren. Schakel elektronica 20-30 minuten voorafgaand aan experimenten in om op te warmen. Zie figuur 3 voor een schema van de experimentele opstelling voor de werking van de eencellige detectiemodule.

OPMERKING: Een op maat gemaakt PA90 Op-Amp-circuit is ontwikkeld om tegemoet te komen aan zowel de gevoeligheid die nodig is voor eencellige niveaudetectie met behulp van de lock-in versterker als de hoge spanningen die nodig zijn om voldoende sterke elektroporatiepulsen toe te passen. Raadpleeg het GEGEVENSBLAD PA90 voor specificaties over aanbevolen circuits³⁹.

1. Initialiseer de lock-in versterker met de huidige voorversterkerinstellingen en stel deze in via het algoritme. Raadpleeg Zheng et al. voor meer informatie over de lock-in instellingen³².
2. Voedingen, functiegenerator en versterker
   1. Voeding 1: Stel in op -15 V om het negatieve uiteinde van het circuit van stroom te voorzien.
   2. Voeding 2 (functiegenerator): Stel in op het dc-signaal en stel de amplitude in op 2 V. Sluit aan op 50x versterkeringang.
   3. Programma Electroporation Pulse Generator voor de blokgolf: Stel de gewenste pulsbreedte (duty cycle) en gewenste pulsamplitude (Volt) in.
   4. Stel de uitvoer in op de triggermodus (1 puls). Sluit de uitgang aan op de ingang van de 50x versterker.
      OPMERKING: Onthoud de 50x versterking bij het programmeren van de pulsamplitude. D.w.z. om een elektrische veldsterkte van 1 kV/cm te bereiken, is in totaal 30 V vereist, 30 V/300 μm (afstand tussen elektroden), daarom moet de uitgang van de functiegenerator worden ingesteld op 30/50 of 600 mV.
   5. Controleer de uitgangen van de 50x-versterker met behulp van een oscilloscoop. Uitgang 1-100 V van voeding 2 (9.2.2). Uitgang 2-Variabele amplitude voor de elektroporatiepuls (9.2.4).
   6. Sluit een 10x-sonde aan op een oscilloscoopkanaal en op het voltooide micro-apparaat (apparaat in test, DUT) in stap 7.6 waar de elektroporatiepuls wordt toegepast. Bewaak het systeem tijdens het experimenteren om ervoor te zorgen dat pulsen worden toegepast.
   7. Zorg ervoor dat lock-in USB is aangesloten en geregistreerd. Controleer alle lock-in-instellingen in de algoritmecode (vooral de uitgangsfrequentie van de lock-in).
3. Microscoop/CCD camera
   1. Plaats het micro-apparaat op het podium van de microscoop via een diahouder. Schakel de CCD-camera in en breng het microfluïdische kanaal in beeld. Gebruik een 4x of 10x objectief.

Figuur 3: Experimenteel installatieschema-Detectie van één cel. De krachtige op-amp (PA-90) maakt de superpositie van de hoogspanningselektroporatiepuls op het lock-in Output AC-signaal mogelijk dat nodig is voor de detectie van één cel. Dit excitatiesignaal passeert het micro-elektroporatieapparaat (Device Under Test, DUT) waar de stroom vervolgens wordt versterkt door de huidige voorversterker en in het algoritme wordt ingevoerd. Het systeem controleert continu op de celdetectiegebeurtenis. Bij binnenkomst van de cel wordt een digitaal signaal gegenereerd door de lock-in versterker om de toepassing van de elektroporatiepuls op de cel (en) in transit te activeren. Legenda: PA-90 (high power op amp), DUT (apparaat onder test), DIO (digitale input/output), FG-EP (functie generator / elektroporatiepuls), 50X (50X versterker), PS-V- (voeding / negatieve spanning voor PA 90), FG-V+ (Function Generator, positieve spanning voor PA 90). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

10. Experimentele werking

1. Microfluïdische kanaalaanzuigen
   1. Verwijder alle luchtbellen uit de spuit met cellading. Bevestig een naald van 30 G aan de spuit met cellading.
   2. Schuif met behulp van een pincet de tygonbuizen over de lengte van de naald naar beneden. Vul het uitlaatreservoir vooraf met herstelmedia (hetzelfde als stap 8.1.2 zonder de antibiotica), ~40-50 μL.
   3. Oefen met de duim voorzichtig druk uit op de zuiger, zodat de vloeistof langzaam het einde van de buislijn bereikt.
   4. Bevestig de spuit aan de spuitpomp. Zet de pomp van de spuit aan en zorg ervoor dat deze is ingesteld op forward perfusie.
   5. Programmeer de pomp voor de juiste diameter van de spuit om ervoor te zorgen dat de stroomsnelheden nauwkeurig zijn. Raadpleeg de handleiding van de pomp voor meer informatie over spuitdiameters.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat cellen zich in de spuit nestelen, bevestigt u de spuitpomp op een klemstandaard zodat deze in een verticale positie kan werken met het uiteinde van de spuit naar beneden gericht.
   6. Stel het debiet van de spuitpomp in, ~10-20 μL/min, en laat de pomp draaien totdat de vloeistof het einde van de slanglijn bereikt. Bevestig de slang aan het microfluïdische apparaat.
   7. Verlaag het debiet van de spuitpomp, ~ 5-10 μL / min, en laat de pomp draaien totdat alle lucht uit het microfluïdische apparaat is verdreven en cellen naar de uitlaat van het apparaat gaan.
   8. Verwijder de cellen uit de uitlaat via pipetaspiratie. Vul het uitlaatreservoir opnieuw met herstelmedia (hetzelfde als stap 8.1.2 zonder de antibiotica), ~40-50 μL.
2. Single-cell electroporation-cell membraanpermeabilisatie mapping
   OPMERKING: Zie figuur 4 en figuur 5 voor een beter begrip van de elektrische gegevens die respectievelijk wijzen op celmembraanpermeabilisatie en de celmembraanpermeabilisatiemapping.
   1. Stel het debiet van de spuitpomp in op ~0,1-0,3 μL/min om een stroom van afzonderlijke cellen door de elektrodeset te garanderen. De celdoorgangstijd tussen de elektroden moet ~250 ms zijn.
   2. Start het computerprogramma door op Uitvoeren te klikken. Zorg ervoor dat het systeem de elektrische gegevens opslaat.
   3. Zorg ervoor dat het systeem op betrouwbare wijze cellen detecteert om de computergestuurde pulstoepassingen te activeren. Pas de detectiedrempel dienovereenkomstig aan.
   4. Stel de pulsparameters in voor de initiële elektroporatiepuls met de laagste elektrische energie. Raadpleeg tabel 1 voor elektroporatiepulsparameters in dit onderzoek.
   5. Schakel het uitgangskanaal voor de elektroporatiepulsgenerator in (stap 9.2.3.).
   6. Volg een vooraf bepaald aantal celdetectie-/pulstoepassingen (n =100). Aan het einde van elke geteste toestand ademt u cellen uit de microdevice-uitgang en vult u de uitlaat aan met herstelmedia.
   7. Herhaal naar de volgende elektroporatiepulstoestand. Herhaal dit totdat alle elektroporatiepulscondities zijn getest.
   8. Bepaal de mate van celmembraanpermeabilisatie voor elke geteste pulstoepassing. (Validatie na het proces wordt beschreven in subsectie 11.1). Genereer de celmembraanpermeabilisatiekaart (figuur 5).
   9. Bepaal de elektroporatiepulsparameters voor populatiegebaseerde feedback met hoge doorvoer.
   10. Schakel de spuitpomp uit, verwijder cellen uit het uitlaatreservoir en vul de uitlaat aan met herstelmedia.
3. Populatiegebaseerde feedbackgestuurde elektroporatie - hoge doorvoer
   OPMERKING: Raadpleeg figuur 6 voor een schema dat het op populatie gebaseerde feedbackproces illustreert.
   1. Stel het debiet van de spuitpomp in op ~1-3 μL/min om een stroom van afzonderlijke cellen door de elektrodenset te garanderen. De celdoorgangstijd tussen de elektroden moet ~25 ms zijn.
   2. Stel de pulsamplitude in op de 'geoptimaliseerde' toestand (10.2.9), schakel de triggermodus uit en stel de pulsbreedte in op de transittijd van de cel.
   3. Stel de taakcyclus zo in dat de AAN-tijd van de puls overeenkomt met de 'geoptimaliseerde' toestand. Zie tabel 1.
   4. Stel de uitgangskanaalfunctiegenerator in op AAN, schakel de spuitpomp in en laat het systeem draaien totdat het gewenste aantal cellen is geëlektropoeerd.
   5. Als u klaar bent, schakelt u zowel de spuitpomp als de functiegenerator uit.
   6. Breng de cellen van het uitlaatreservoir over in de celkweekkolf/-plaat van de juiste grootte gevuld met voorverwarmde herstelmedia en breng de kweekkolf/-plaat over in de incubator.

11. Analyse

1. Detectie van membraanpermeabilisatie op eencellig niveau
   OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de 'optimale' puls werd gebruikt tijdens de module met hoge doorvoer, moet een analyse na het experiment worden uitgevoerd om de elektrische gegevens te verifiëren die uit subsectie 10.2 zijn geëxporteerd. Zie figuur 4 voor een grafische weergave van het elektrische signaal dat representatief is voor membraanpermeabilisatie als gevolg van elektroporatie.
   1. Laad gegevens in een analysesoftware (MATLAB, Python, enz.). Genereer een plot van Huidig versus Tijd voor elke pulserende toestand.
   2. Bepaal handmatig de mate van celmembraanpermeabilisatie (ΔI_P / ΔI_C). Zie figuur 4. Genereer de celmembraanpermeabilisatiekaart (ΔI_P / ΔI_C versus elektrische energie, figuur 5) over alle geteste pulsomstandigheden. Controleer de 'optimale' pulserende toestand.
2. elektrotransfectie-efficiëntie (eTE)
   1. Verwijder na de incubatietijd van 24 uur de geëlektropoeerde cellen uit de incubator.
   2. Voer een live celvlek uit. Verdun DRAQ5 1:1000 tot een eindconcentratie van 5 μM in het celkweekvat. Meng de cellen/kleuringsoplossing voorzichtig en incubeer bij 37 °C gedurende 5-30 minuten.
      OPMERKING: In deze stap kan een andere vlek worden geïmplementeerd. Zorg ervoor dat de fluorescerende eigenschappen niet overlappen met de fluorescerende marker die een succesvolle elektrotransfectie aangeeft (d.w.z. GFP bevindt zich in de groene golflengte en DRAQ5 is verrood).
   3. Schakel een epifluorescente microscoop, lamp en camera's in (zie Materiaaltabel).
   4. Verwijder de cellen uit de couveuse en breng ze in beeld op de microscoop.
   5. Leg een fasecontrastafbeelding (brightfield) van het geselecteerde veld vast.
   6. Leg epifluorescente beelden van hetzelfde veld vast met FITC (GFP) en Far-Red (DRAQ5) filters. Analyseer de beeldsets handmatig of via een algoritme.
      OPMERKING: Raadpleeg figuur 7 voor representatieve afbeeldingen.
   7. Tel het totale aantal GFP-positieve cellen in alle afbeeldingen. Tel het totale aantal DRAQ5-gekleurde cellen in alle afbeeldingen. Bereken eTE (verhouding van GFP-positieve cellen tot DRAQ5-gekleurde cellen).

Resultaten

Figuur 4 belicht de werkingsprincipes achter de membraanpermeabilisatiedetectie op één celniveau voor een enkele pulsamplitude. Na de start van het elektroporatie-experiment bepaalt het celdetectiealgoritme een optimale drempel voor celdetectie via een puntsgewijze, op helling gebaseerde detectiemethode. Het systeem controleert vervolgens continu (1) op een significante negatieve verandering in de gemeten elektrische stroom, die indicatief is voor het binnendringen van een cel. Dit komt door...

Discussie

De methodologie die in dit protocol wordt gepresenteerd, richt zich voornamelijk op de microfabricage van een microfluïdisch apparaat dat vervolgens wordt geïntegreerd in een gespecialiseerde elektroporatie-experimentele opstelling. De term 'recept', die vaak wordt gebruikt bij het beschrijven van de specifieke kenmerken van het microfabricageproces, wijst op het belang van het volgen / optimaliseren van elke stap om een werkend apparaat met succes te fabriceren. Bepaalde kritieke stappen binnen het proces, wanneer ze ni...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
150-mm diameter petri dishes	VWR	25384-326	stap 6.1.1 om wafer te beveiligen
24-well tissue culture plates	VWR	10062-896	stap 10.3.6 om geëlektroporeerde cellen te plateren
33220A Waveform/Function generator	Agilent		stap 9.2.3 elektroporeringspulsgenerator
4'' Si-wafers	University Wafer		subsectie 2.1 voor microfluïdische kanaalfabricage
6-well tissue culture plates	VWR	10062-892	stap 8.1.8 om cellen te plateren
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	stap 2.1.2 voor reiniging en  stap 5.1 fotoresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter		stappen 8.1.4, 8.3.2. en 8.3.3. om cellen te laten bezinken
AutoCAD 2018	Autodesk		subsectie 1.1. om transparantiemaskers te ontwerpen
Buffered oxide etchant 10:1	VWR	901621-1L	subsectie 3.1 voor HF-etsen
CCD Monochrome microscope camera	Hamamatsu	Orca 285 C4742-96-12G04	stap 11.2.3. voor beeldvorming
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP	PCO		subsectie 9.3 deel van de experimentele opstelling
Conductive Epoxy	CircuitWorks	CW2400	subsectie 7.6. voor draadaansluiting
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C	stap 8.1.4. voor cellen centrifugeren
Dektak 3ST Surface Profilometer	Veeco (Sloan/Dektak)		stap 2.1.15 en 5.4 voor oppervlakteprofielmeting
Disposable biopsy punch, 0.75 mm	Robbins Instruments	RBP075	stap 6.2.3 voor ingangstoegang
Disposable biopsy punch, 3 mm	Robbins Instruments	RBP30P	stap 6.2.3 voor uitgangstoegang
DRAQ5	abcam	ab108410	stap 11.2.2. voor levende celkleuring
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	ThermoFisher Scientific	11885084	stap 8.1.2. deel van mediasamenstelling
E3631A Bipolar Triple DC power supply	Agilent		stap 9.2.1.-9.2.2.deel van de experimentele opstelling
Eclipse TE2000-U Inverted  Microscope	Nikon		subsectie 9.3. deel van de experimentele opstelling
EVG620 UV Lithography System	EVG		stap 2.1.9. en 2.2.7. voor UV-belichting
Fetal Bovine Serum	Neuromics	FBS001	stap 8.1.2. deel van mediasamenstelling
FS20 Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific		subsectie 5.1. voor fotoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mL	Fisher Scientific	FB800100	stap 8.2.1. voor bufferopslag
Glass Media Bottle with Cap, 500mL	Fisher Scientific	FB800500	stap 8.1.2.voor mediaopslag
HEK-293 cell line	ATCC	CRL-1573	subsectie 8.1 voor celkweek
HEPES buffer solution	Sigma Aldrich	83264-100ML-F	stap 8.2.1 deel van elektroporeringsbuffersamenstelling
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	379212-25ML	stap 2.2.3 adhesieve promotor
HF2LI Lock-in Amplifier	Zurich Instruments		subsectie 9.2 deel van de experimentele opstelling
HF2TA Current amplifier	Zurich Instruments		subsectie 9.2 deel van de experimentele opstelling
Isopropyl Alcohol	Fisher Scientific	A459-1	stap 2.1.2 voor reiniging, stap 2.1.14 voor het spoelen van de wafer na SU-8-ontwikkeling, en stap 6.3.1 voor het reinigen van PDMS
IX81 fluorescence microscope	Olympus		stap 11.2.3 voor beeldvorming
L-Glutamine Solution	Sigma Aldrich	G7513-20ML	stap 8.1.2. deel van mediasamenstelling
M16878/1BFA 22 gauge wire	AWC	B22-1	subsectie 7.5 voor apparaatfabriek
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	208337-100G	stap 8.1.2 deel van elektroporeringsbuffersamenstelling
MF 319 Developer	Kayaku Advanced Materials	10018042	stap 2.2.9. fotoresistontwikkelaar
Microposit S1818 photoresist	Kayaku Advanced Materials	1136925	stap 2.2.4 positieve fotoresist voor elektrodepatrooning
Microscope slides, 75 x 25 mm	VWR	16004-422	stap 2.2.1 elektrode soda-kalkglassubstraat
Model 2350 High voltage amplifier	TEGAM	2350	stap 9.2.5. deel van de experimentele opstelling
National Instruments LabVIEW	National Instruments		dataverwerving
Needle, 30G x 1 in	BD Scientific	305128	stap 10.1.1. deel van het systeem primen
PA90 IC OPAMP Power circuit	Digi-key	598-1330-ND	Onderdeel van de aangepaste circuit
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458-20ML	stap 8.1.2. deel van mediasamenstelling
Plasmid pMAX-GFP	Lonza	VCA-1003	stap 8.3.4. voor intracellulaire levering
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030"	VWR	89404-300	stap 10.1.2. voor systeem primen
Platinum targets	Kurt J. Lesker