Methodenartikel

3D-beeldvorming van de extracellulaire levermatrix in een muismodel van niet-alcoholische steatohepatitis

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63106

⸱

25 februari 2022

 ,  ,  , 
1Gastroenterology and Hepatology, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.

Samenvatting

Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is de meest voorkomende chronische leverziekte in de Verenigde Staten, die meer dan 70 miljoen Amerikanen treft. NASH kan zich ontwikkelen tot fibrose en uiteindelijk tot cirrose, een belangrijke risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De extracellulaire matrix (ECM) biedt structurele ondersteuning en handhaaft de leverhomeostase via matricellulaire signalen. Leverfibrose is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-remodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige accumulatie van structurele elementen en bijbehorende veranderingen in glycosaminoglycanen. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt "kippengaas" genoemd, dat meestal bestaat uit zone 3 perisinusoïdale / pericellulaire fibrose, gebaseerd op kenmerken waargenomen door Masson's trichrome vlek en Picrosirius Red-vlekken. Deze traditionele dunne tweedimensionale (2D) op weefseldia's gebaseerde beeldvormingstechnieken kunnen echter niet de gedetailleerde driedimensionale (3D) ECM-structurele veranderingen aantonen, waardoor het begrip van de dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose wordt beperkt.

Het huidige werk optimaliseerde een snel en efficiënt protocol om de oorspronkelijke ECM-structuur in de lever via decellularisatie in beeld te brengen om de bovenstaande uitdagingen aan te pakken. Muizen werden gedurende 14 weken gevoed met chow of fastfooddieet. Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ portale aderperfusie en de twee-foton microscopietechnieken werden toegepast om veranderingen in de inheemse ECM in beeld te brengen en te analyseren. De 3D-beelden van de normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusiedecellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-fotonenmicroscopie bood een praktisch en betrouwbaar platform om de dynamische ECM-remodellering in de lever te visualiseren.

Inleiding

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is de meest voorkomende leverziekte, die 20% -25% van de volwassen bevolking treft. 25% van de NAFLD-patiënten evolueert naar niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), waarbij het risico op cirrose, leverfalen en hepatocellulair carcinoom toeneemt1. In de komende 20 jaar wordt geschat dat NASH verantwoordelijk zal zijn voor 2 miljoen levergerelateerde sterfgevallen in de VS2. Omdat er geen goedgekeurde behandelingen zijn, is er een dringende noodzaak om de mechanismen te ontcijferen die leverfibrose veroorzaken bij NASH-patiënten en een gerichte behandeling te ontwikkelen3.

De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamische, complexe micro-omgeving die bidirectionele communicatie met cellen uitoefent om weefselhomeostase te reguleren4. De lever-ECM is samengesteld uit structurele elementen zoals proteoglycanen, collageen, fibronectine, elastine en andere niet-structurele eiwitten (bijv. Olfactomedine en trombospondine) om fysieke en structurele ondersteuning te bieden4.

Leverfibrose is een chronische wondgenezingsreactie op leverschade van verschillende etiologieën, waaronder NASH3. Het is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-matrixremodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige structurele eiwitten in de gewonde lever4. Fibrogenese is afhankelijk van de dynamische cel-cel communicatie tussen verschillende leverceltypen. Hepatische stellaatcellen (HSC's), wanneer geactiveerd, differentiëren in Smooth Muscle Alpha 2 Actine-expresserende, migrerende en prolifererende myofibroblastachtige cellen en synthetiseren ECM-eiwitten als een wondsluitende actie. Geactiveerde HSC's zijn de centrale collageenproducerende cellen in de lever1.

Het moleculaire mechanisme van ECM-remodellering, patronen van fibrose en hun relatie met cellulaire gebeurtenissen zijn niet duidelijk. Een beter begrip van de driedimensionale (3D) ECM-structuur is nog steeds nodig, hoewel massaspectrometrietechnieken hebben geholpen bij het analyseren van de ECM-eiwitsamenstelling4. Traditioneel zijn Masson's trichrome vlek, Picro Sirius Red vlekken en tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming uitgevoerd op tweedimensionale (2D) dunne leversecties. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt "kippengaas" genoemd, dat zich uitstrekt tot zone 3 en perisinusoïdale / pericellulaire fibrose 5,6 is. Er is echter een gebrek aan studies die zich richten op de 3D-structuur van de inheemse lever, met name die waarbij geen weefselsectie plaatsvindt. Robuuste beeldvormingsbenaderingen om patronen en kenmerken van fibrose te identificeren tijdens dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose zouden het begrip van NASH-mechanismen aanzienlijk versterken en nieuwe therapeutische doelen identificeren.

Om deze uitdagingen aan te gaan, werd een snel en efficiënt protocol geoptimaliseerd om de inheemse lever-ECM in beeld te brengen via decellularisatie7. Decellularisatie van de hele lever is een benadering om de hepatische cellulaire inhoud te verwijderen met behoud van het oorspronkelijke 3D ECM-netwerk door middel van wasmiddelperfusie. Muizen kregen gedurende 14 weken chow of fastfooddieet (FFD). Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ poortaderperfusie met mild reinigingsmiddel en lage stroomsnelheden om triple-spiraalvormige en inheemse fibrillaire collageenstructuren te behouden. Twee-fotonenmicroscopie werd toegepast om veranderingen in collageenstructuren in ECM te analyseren. De 3D-beelden van de oorspronkelijke ECM-structuur in normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusie decellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-foton microscopie biedt een praktisch en betaalbaar platform om de dynamische ECM-remodellering in de lever te visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierproeven worden uitgevoerd volgens de experimentele procedures die zijn goedgekeurd door de institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissies (IACUCs) van Stanford University en het Veterans Affairs Hospital in Palo Alto. 6-8 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen kregen chow of een fastfooddieet aangevuld met 4,2% fructose-glucosestroop (zie tabel met materialen) in drinkwater gedurende 14 weken5. De muizen werden in standaard kooien gehouden bij een 12 uur donker/licht cyclus.

1. Chirurgische voorbereiding en procedures van leverperfusie

  1. Weeg de muis vóór de procedure.
  2. Verdoof de muis door ketamine (90 mg/kg) en Xylazine (10 mg/kg) (zie tabel met materialen) toe te dienen via een intraperitoneale injectie. Zorg ervoor dat de muis volledig wordt verdoofd door teen te knijpen voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    OPMERKING: Isofluraan is hier niet nodig, omdat dit een niet-overlevingsoperatie is.
  3. Scheer het ventrale gebied met een tondeuse en desinfecteer de huid met 70% ethanol. Plaats de muis op zijn rug en immobiliseer de benen op de operatieplaat met tape.
  4. Na het opnieuw bevestigen van de diepte van de anesthesie door een teenknijper, gebruikt u een Mayo-schaar en een Adson-tang (zie tabel met materialen) om een incisie van 3 cm lateraal in de onderbuik te maken en vervolgens een incisie van 5 cm verticaal van de lage buik naar het xiphoid-proces. Pas op dat u de borstholte niet opent.
  5. Na het openen van het peritoneum, plaatst u de darmen voorzichtig naar links van het dier en verhoogt u de rechterkwab van de lever met een rayon-applicator (zie materiaaltabel) om de poortader bloot te leggen.
  6. Catheteriseer de poortader met behulp van een 24 G IV-katheter. Breng de katheter in het distale uiteinde van de poortader. Plaats de katheterpunt voordat de poortader zich vertakt in de leverkwabben.
  7. Trek de naald onmiddellijk terug wanneer de katheter in de ader komt. Controleer of de katheter correct in de ader is geplaatst door de lever te perfuseren met PBS met behulp van een spuit van 1 ml via de katheter.
    OPMERKING: Bij PBS-perfusie moeten alle lobben onmiddellijk blancheren. Als de katheter correct is geplaatst, zal veneus bloed snel door de katheter stromen.
  8. Gebruik Dumont microtang, een Castroviejo micronaaldhouder en 4-0 hechtdraad (zie Materiaaltabel) om een steek onder de vertakking van de poortader te plaatsen en een tweede steek 1 cm onder om de katheter vast te zetten.

2. Weefseldecellularisatie

  1. Sluit de katheter aan op een siliconen slang (~ 1 m lengte, 3 mm binnendiameter en 4,1 mm buitendiameter) met een Luer-connector. Sluit de siliconenslang aan op een peristaltische pomp en een reservoir met gedeïoniseerd water (zie materiaaltabel).
  2. Verwijder voorzichtig de luchtbellen in de buis en vermijd het genereren van nieuwe bellen tijdens de perfusie. Stel de peristaltische pomp in op een debiet van 0,2 ml/min (d.w.z. 288 ml/24 uur).
  3. Breng eerst onder met gedeïoniseerd water (~50 ml/muis) gedurende 2 uur. De kleur van de lever zal veranderen van rood naar geel tijdens perfusie.
    OPMERKING: Het dier vervalt na 10 minuten perfusie.
  4. Schakel de perfusieoplossing over naar 0,5% (wt/vol) natriumdeoxycholaat (DOC, zie materiaaltabel) en ga 's nachts verder (18 uur, ~250 ml/muis). De lever wordt wit aan het einde van de perfusie (figuur 1).
  5. Schakel de perfusieoplossing over op gedeïoniseerd water (~ 50 ml / muis) en laat gedurende 2 uur doordrenken.
  6. Gebruik Dumont microtang en microveerschaar (zie Materiaaltabel) om de gedecellulariseerde lever op te vangen en voorzichtig te wassen in een petrischaaltje met PBS.
  7. Snijd het gedecellulariseerde weefsel in kleine stukjes voor onmiddellijke beeldvorming of bevries bij -80 °C voor verdere biochemische analyse zoals tandem massaspectrometrie, ELISA of western blot.

3. Diavoorbereiding voor beeldvorming (met een multifoton/confocale fluorescentiemicroscoop)

  1. Breng een klein stukje gedecellulariseerde lever (<3 x 3 x 3 mm) over op een microscoopglaasje en plaats het weefsel in het midden.
  2. Voeg 10 μL antifade montagemedium (zie tabel met materialen) toe aan het weefsel met een pipet om uitdroging van het weefsel te voorkomen.
  3. Bedek de tissue met een dekglas en oefen een kleine kracht uit om het monster plat te maken. Sluit de randen van het afdekglas af met kleurloze en transparante nagellak (figuur 2).
    OPMERKING: Vanwege de instelling van het rechtopstaande twee-foton door de microscoop, werd een dekglas op het monster gebruikt. Monsters kunnen echter anders worden geplaatst als een omgekeerde microscoop wordt gebruikt.

4. Beeldacquisitie

  1. Plaats een druppel dompelolie op de bovenkant van het afdekglas en plaats de dia op de microscoopglaashouder. Laat de 20x olieobjectieflens zakken totdat deze in contact komt met de dompelolie.
  2. Schakel over naar het violette kanaal (405 nm), schakel de sluiter in en stel scherp op het monster. Navigeer en positioneer het interessegebied voor beeldvorming. Schakel de sluiter uit voordat u naar beeldacquisitie gaat met behulp van laserlicht.
  3. Schakel over naar de computerbesturing en start de twee-fotonenlaser. Schakel eerst de laser met twee fotonen in (figuur 3A) en schakel vervolgens de lasercontroller met twee fotonen (zie materiaaltabel) en de sluiter (figuur 3B, C) in. Zorg ervoor dat het uitgangsvermogen hoger is dan 2,5 W.
    Verminder het laservermogen om fluorescentie-blussen te voorkomen. Selecteer en pas detectoren (zowel fotomultipliers als de hybride) aan de gekozen fluoroforen aan.
    OPMERKING: Beeldvorming van twee fotonen werd uitgevoerd bij een excitatiegolflengte van 860 nm. Twee kanalen werden geselecteerd voor respectievelijk collageen SHG en twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) beelden. Eén kanaal dat overeenkomt met het golflengtebereik van 415-445 nm detecteerde de gedetailleerde structuur van collageen uit SHG-signalen. Een ander kanaal bestreek het bereik van 465-669 nm om TPEF-signalen te verzamelen.
  4. Kies gelijktijdige of opeenvolgende beeldacquisities. Stel het gaatje in op de hoogste waarde. Pas lasergolflengten, versterking, vermogen en offset aan. Pas de verblijftijd van de pixel, de pixelgrootte, de gemiddelde en de zoom aan (figuur 4A).
  5. Blader door de z-controller van de computer en stel de z-dimensies in, definieer het begin- en eindpunt en kies het aantal afbeeldingen binnen een volume (z-stack). Verkrijg afbeeldingen.
    OPMERKING: Hier is gekozen voor een volume van 20 μm Z en een Z-stapgrootte van 1 μm (figuur 4B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De collageenvezels werden gedetecteerd met tweede harmonische generatie en twee-fotonenmicroscopie. Het signaal is afkomstig van de frangible triple-helical en native fibrillaire collageenstructuren. Specifieke antilichamen werden niet gebruikt om collageensubtypen te analyseren; Dit zou echter kunnen worden toegevoegd aan de beeldvormingstechniek.

Wanneer het leverweefsel wordt bestudeerd zonder decellularisatie, is het een uitdaging om beelden met hoge resolutie van het collageennetwerk te k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol toont aan dat decellularisatie door middel van een lage stroomsnelheid DOC in situ perfusie de frangible triple-helical en native fibrillaire collageenstructuren behoudt, waardoor een betrouwbaar en kosteneffectief platform wordt geboden om dynamische ECM-remodellering in NASH-leverfibrose vast te leggen. Hoewel decellularisatie werd uitgevoerd in normale en fibrotische levers voordat ECM-componenten werden geïdentificeerd of biologische scaffolds voor celkweek werden gegenereerd, is de dyna...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot dit artikel.

Dankbetuigingen

We bedanken Hyesuk Park voor de technische hulp. Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, naar NJT), het National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, naar NJT). We zijn dankbaar voor Jon Mulholland en Kitty Lee van de Cell Sciences Imaging Facility in het Beckman Center voor technische assistentie bij de beeldvorming met twee fotonenmicroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3MONOCRYLY494G
4-0 suturefisher scientific10-000-649https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (xylazine)AnaSedNDC 59399-110-20Dit medicijn mag alleen worden gebruikt door of in opdracht van een erkende dierenarts.
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER MET BC TECHNOLOGIEBD382612
Chow-voerEnvigo# 2918Controlevoer. Een vaste formule, niet-autoclaveerbare voeding gemaakt met hoogwaardige ingrediënten en ontworpen om de draagtijd, lactatie en groei van knaagdieren te ondersteunen.
Fast-food dieet (AIN76A Westers dieet)Test Diet1810060https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoxyline en Eosine Stain KitvectorlabsH-3502https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Rat Surgical Kitfisher scientific13-005-205https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTIEVloeistofVedcoNDC 50989-996-06 - 10 mL - fles.KetaVed is klinisch onderzocht bij niet-menselijke primaten naast de soorten die worden vermeld onder Toediening en Dosering.
Leica SP5 rechtopstaande Confocal, multi-fotonLeicaSP5
Luer-connector (Driewegstopkraan met SPIN-LOCK®)bbraunD300https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Rood Stain KitPolysciences, Inc.24901https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon gesneden applicatorpuritan25-806 1PR
NatriumdeoxycholaatsigmaaldrichD6750-100G
Stroopwww.target.com24 fl ozhttps://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Variabele snelheid peristaltiekpompINTLLABBT100https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade MontagemediumvectorlabsH-1000-10https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html

Referenties

  1. Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
  2. Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
  3. Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
  4. Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).
  5. Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
  6. Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
  7. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
  8. Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83(2019).
  9. Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398(2016).
  10. Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
  11. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
  12. Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).
  13. Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
  14. Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
  15. Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079(2015).
  16. Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).
  17. Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ECM remodelleringleverfibrosedecellularisatieprotocoltweefotonmicroscopiecollageenvezelsbeeldvorming van muizenleversPicrosirius roodkleuringperfusie van de poortader

Gerelateerde artikelen