Methodenartikel

Heuristische mijnbouw van hiërarchische genotypen en accessoire genoom loci in bacteriële populaties

DOI:

10.3791/63115

⸱

7 december 2021

 ,  , 
1Department of Computer Science and Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln, 3Nebraska Food for Health Center, University of Nebraska-Lincoln

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit analytische computationele platform biedt praktische richtlijnen voor microbiologen, ecologen en epidemiologen die geïnteresseerd zijn in bacteriële populatiegenomica. In het bijzonder demonstreerde het hier gepresenteerde werk hoe uit te voeren: i) fylogenie-geleide mapping van hiërarchische genotypen; ii) op frequentie gebaseerde analyse van genotypen; iii) verwantschaps- en klonaliteitsanalyses; iv) identificatie van afstammingsonderscheidende accessoire loci.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Routinematig en systematisch gebruik van bacteriële whole-genome sequencing (WGS) verbetert de nauwkeurigheid en oplossing van epidemiologisch onderzoek uitgevoerd door volksgezondheidslaboratoria en regelgevende instanties. Grote hoeveelheden openbaar beschikbare WGS-gegevens kunnen worden gebruikt om pathogene populaties op grote schaal te bestuderen. Onlangs werd een vrij beschikbaar computationeel platform genaamd ProkEvo gepubliceerd om reproduceerbare, geautomatiseerde en schaalbare hiërarchische populatie-genomische analyses mogelijk te maken met behulp van bacteriële WGS-gegevens. Deze implementatie van ProkEvo toonde het belang aan van het combineren van standaard genotypische mapping van populaties met mijnbouw van accessoire genomische inhoud voor ecologische gevolgtrekking. In het bijzonder gebruikte het hier belichte werk ProkEvo-afgeleide outputs voor hiërarchische analyses op populatieschaal met behulp van de R-programmeertaal. Het belangrijkste doel was om microbiologen, ecologen en epidemiologen een praktische gids te bieden door te laten zien hoe: i) een fylogenie-geleide mapping van hiërarchische genotypen kan worden gebruikt; ii) frequentieverdelingen van genotypen te beoordelen als een proxy voor ecologische fitheid; iii) verwantschapsrelaties en genetische diversiteit te bepalen met behulp van specifieke genotypische classificaties; en iv) kaartlijn differentiërende accessoire loci. Om de reproduceerbaarheid en draagbaarheid te verbeteren, werden R-afwaarderingsbestanden gebruikt om de volledige analytische benadering te demonstreren. De voorbeelddataset bevatte genomische gegevens van 2.365 isolaten van de zoönotische voedselpathogeen Salmonella Newport. Fylogenie-verankerde mapping van hiërarchische genotypen (Serovar -> BAPS1 -> ST -> cgMLST) onthulde de populatiegenetische structuur, waarbij sequentietypen (ST's) werden benadrukt als de hoeksteen die het genotype onderscheidt. Over de drie meest dominante afstammingslijnen deelden ST5 en ST118 recenter een gemeenschappelijke voorouder dan met het zeer klonale ST45-fylogenylotype. Op ST gebaseerde verschillen werden verder benadrukt door de verdeling van accessoire antimicrobiële resistentie (AMR) loci. Ten slotte werd een fylogenie-verankerde visualisatie gebruikt om hiërarchische genotypen en AMR-inhoud te combineren om de verwantschapsstructuur en afstammingsspecifieke genomische handtekeningen te onthullen. Gecombineerd biedt deze analytische benadering enkele richtlijnen voor het uitvoeren van heuristische bacteriële populatie genomische analyses met behulp van pan-genomische informatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het toenemende gebruik van bacteriële whole-genome sequencing (WGS) als basis voor routinematige surveillance en epidemiologisch onderzoek door volksgezondheidslaboratoria en regelgevende instanties heeft het onderzoek naar het uitbreken van pathogenen aanzienlijk verbeterd 1,2,3,4. Als gevolg hiervan zijn grote hoeveelheden geanonimiseerde WGS-gegevens nu openbaar beschikbaar en kunnen ze worden gebruikt om aspecten van de populatiebiologie van pathogene soorten op een ongekende schaal te bestuderen, inclusief studies op basis van: populatiestructuren, genotypefrequenties en gen / allelfrequenties in meerdere reservoirs, geografische regio's en soorten omgevingen5 . De meest gebruikte WGS-geleide epidemiologische onderzoeken zijn gebaseerd op analyses met alleen de gedeelde kern-genomische inhoud, waarbij de gedeelde (geconserveerde) inhoud alleen wordt gebruikt voor genotypische classificatie (bijv. Variant calling), en deze varianten worden de basis voor epidemiologische analyse en tracering 1,2,6,7 . Typisch, bacteriële kern-genoom-gebaseerde genotypering wordt uitgevoerd met multi-locus sequence typing (MLST) benaderingen met behulp van zeven tot een paar duizend loci 8,9,10. Deze MLST-gebaseerde strategieën omvatten het in kaart brengen van voorgeassembleerde of geassembleerde genomische sequenties op sterk samengestelde databases, waardoor allelische informatie wordt gecombineerd tot reproduceerbare genotypische eenheden voor epidemiologische en ecologische analyse11,12. Deze MLST-gebaseerde classificatie kan bijvoorbeeld genotypische informatie genereren op twee resolutieniveaus: sequentietypen op een lager niveau (ST's) of ST-afstammingslijnen (7 loci) en mlst-varianten (cgMLST) op een hoger niveau (~ 300-3.000 loci)10.

MLST-gebaseerde genotypische classificatie is computationeel draagbaar en zeer reproduceerbaar tussen laboratoria, waardoor het algemeen wordt geaccepteerd als een nauwkeurige subtyperingsbenadering onder het bacteriesoortniveau13,14. Bacteriële populaties zijn echter gestructureerd met soortspecifieke verschillende gradaties van klonaliteit (d.w.z. genotypische homogeniteit), complexe patronen van hiërarchische verwantschap tussen genotypen 15,16,17 en een breed scala aan variatie in de verdeling van accessoire genomische inhoud 18,19 . Een meer holistische benadering gaat dus verder dan discrete classificaties in MLST-genotypen en omvat de hiërarchische relaties van genotypen op verschillende resolutieschalen, samen met het in kaart brengen van accessoire genomische inhoud op genotypische classificaties, wat populatiegebaseerde gevolgtrekkingen 18,20,21 vergemakkelijkt . Bovendien kunnen analyses zich ook richten op gedeelde patronen van overerving van accessoire genomische loci bij zelfs ver verwante genotypen 21,22. Over het algemeen maakt de gecombineerde aanpak agnostische ondervraging mogelijk van relaties tussen populatiestructuur en de verdeling van specifieke genomische samenstellingen (bijv. Loci) over geospatiale of omgevingsgradiënten. Een dergelijke benadering kan zowel fundamentele als praktische informatie opleveren over de ecologische kenmerken van specifieke populaties die op hun beurt hun tropisme en verspreidingspatronen over reservoirs, zoals voedseldieren of mensen, kunnen verklaren.

Deze op systemen gebaseerde hiërarchische populatiegerichte benadering vereist grote hoeveelheden WGS-gegevens voor voldoende statistische kracht om onderscheidbare genomische handtekeningen te voorspellen. Bijgevolg vereist de aanpak een computationeel platform dat in staat is om vele duizenden bacteriële genomen tegelijk te verwerken. Onlangs is ProkEvo ontwikkeld en is het een vrij beschikbaar, geautomatiseerd, draagbaar en schaalbaar bioinformaticaplatform dat integratieve hiërarchische bacteriële populatieanalyses mogelijk maakt, inclusief pan-genomische mapping20. ProkEvo maakt de studie van matige tot grootschalige bacteriële datasets mogelijk en biedt tegelijkertijd een kader om testbare en afleidbare epidemiologische en ecologische hypothesen en fenotypische voorspellingen te genereren die door de gebruiker kunnen worden aangepast. Dit werk vormt een aanvulling op die pijplijn door een gids te bieden voor het gebruik van prokevo-afgeleide outputbestanden als input voor analyses en interpretatie van hiërarchische populatieclassificaties en accessoire genomische mijnbouw. De hier gepresenteerde casestudy maakte gebruik van de populatie van Salmonella enterica-afstamming I zoönotische serovar S. Newport als voorbeeld en was specifiek gericht op het verstrekken van praktische richtlijnen voor microbiologen, ecologen en epidemiologen over hoe: i) een geautomatiseerde fylogenie-afhankelijke benadering te gebruiken om hiërarchische genotypen in kaart te brengen; ii) de frequentieverdeling van genotypen te beoordelen als een proxy voor het evalueren van ecologische fitheid; iii) afstammingsspecifieke graden van klonaliteit te bepalen met behulp van onafhankelijke statistische benaderingen; en iv) amr-loci in kaart te brengen als een voorbeeld van hoe accessoire genomische inhoud kan worden ontginnen in de context van de populatiestructuur. Meer in het algemeen biedt deze analytische benadering een generaliseerbaar kader om een populatiegebaseerde genomische analyse uit te voeren op een schaal die kan worden gebruikt om evolutionaire en ecologische patronen af te leiden, ongeacht de beoogde soort.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid invoerbestanden voor

OPMERKING: Het protocol is hier beschikbaar - https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code. Het protocol gaat ervan uit dat de onderzoeker specifiek ProkEvo (of een vergelijkbare pijplijn) heeft gebruikt om de benodigde uitvoer beschikbaar te krijgen in deze Figshare-repository (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503 - inloggegevens zijn vereist - De gebruiker moet een gratis account aanmaken om toegang tot bestanden te hebben!). Van belang is dat ProkEvo automatisch genomische sequenties downloadt uit de NCBI-SRA-repository en alleen een .txt bestand nodig heeft met een lijst met genoomidentificaties als input20, en degene die voor dit werk op S wordt gebruikt. Newport USA isolaten wordt hier verstrekt (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025729).  Gedetailleerde informatie over het installeren en gebruiken van dit bacteriële genomics-platform is hier beschikbaar (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/2.-Quick-start)20

  1. Genereer kerngenoom fylogenie met FastTree23 zoals eerder beschreven20, dat geen deel uitmaakt van het bioinformaticaplatform20. FastTree vereist de Roary24 core-genome alignment als invoerbestand. Het fylogeniebestand heeft de naam newport_phylogeny.tree (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025690).
  2. Genereer SISTR25-uitvoer met de informatie over serovarsclassificaties voor Salmonella en cgMLST-variant aanroepgegevens (sistr_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025699).
  3. Genereer EEN BAPS-bestand door fastbaps26,27 met de BAPS-niveaus 1-6 classificatie van genomen in subgroepen of haplotypen (fastbaps_partition_baps_prior_l6.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025684).
  4. Genereer MLST-gebaseerde classificatie van genomen in ST's met behulp van het MLST-programma (https://github.com/tseemann/mlst)28 (salmonellast_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025696).
  5. Genereer ABRicate (https://github.com/tseemann/abricate)29-uitvoer als een .csv bestand met AMR-loci in kaart gebracht per genoom (sabricate_resfinder_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025693).
    OPMERKING: De gebruiker kan specifieke delen van de ProkEvo bioinformatica pijplijn uitschakelen (kijk hier voor meer informatie - https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.2.-Remove-existing-bioinformatics-tool-from-ProkEvo). De hier gepresenteerde analytische benadering biedt richtlijnen voor het uitvoeren van een populatiegebaseerde analyse nadat de bioinformatica-pijplijn is uitgevoerd.

2. Download en installeer de statistische software en de IDE-applicatie (Integrated Development Environment)

  1. Download de meest up-to-date gratis beschikbare versie van de R-software voor Linux, Mac of PC30. Volg de standaardinstallatiestappen.
  2. Download hier de meest up-to-date vrij beschikbare versie van de RStudio desktop IDE31. Volg de standaardstappen voor de installatie.
    OPMERKING: De volgende stappen zijn opgenomen in het beschikbare script, inclusief gedetailleerde informatie over het codegebruik, en moeten sequentieel worden uitgevoerd om de uitvoer en cijfers te genereren die in dit werk worden gepresenteerd (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd). De gebruiker kan besluiten om een andere programmeertaal te gebruiken om deze analytische / statistische analyse uit te voeren, zoals Python. Gebruik in dat geval de stappen in de scripts als raamwerk om de analyse uit te voeren.

3. Installeer en activeer data science libraries

  1. Installeer alle data science libraries in één keer als eerste stap in de analyse. Vermijd het installeren van de bibliotheken telkens wanneer het script opnieuw moet worden uitgevoerd. Gebruik de functie install.packages() voor de installatie van de bibliotheek. Als alternatief kan de gebruiker op het tabblad Pakketten in de IDE klikken en de pakketten automatisch installeren. De code die wordt gebruikt om alle benodigde bibliotheken te installeren, wordt hier gepresenteerd:
    # Installeer Tidyverse
    install.packages("tidyverse")
    # Installeer skimr
    install.packages("skimr")
    # Installeer vegan
    install.packages("vegan")
    # Installeer forcats
    install.packages("forcats")
    # Installeer naniar
    install.packages("naniar")
    # Installeer ggpubr
    install.packages("ggpubr")
    # Installeer ggrepel
    install.packages("ggrepel")
    # Installeer reshape2
    install.packages("reshape2")
    # Installeer RColorBrewer
    install.packages("RColorBrewer")
    # Installeer ggtree
    if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
    BiocManager::install("ggtree")
    # Installatie van ggtree zal een vraag over de installatie vragen - antwoord is "a" om alle afhankelijkheden te installeren / bij te werken
  2. Activeer alle bibliotheken of pakketten met de functie library() aan het begin van het script, direct na de installatie. Hier is een demonstratie over het activeren van alle benodigde pakketten:
    # Activeer de bibliotheken en pakketten
    bibliotheek(tidyverse)
    bibliotheek(skimr)
    bibliotheek(vegan)
    bibliotheek(forcats)
    bibliotheek(naniar)
    bibliotheek(ggtree)
    bibliotheek(ggpubr)
    bibliotheek(ggrepel)
    bibliotheek(reshape2)
    bibliotheek(RColorBrewer)
  3. Onderdruk het uitvoeren van de code die wordt gebruikt voor de installatie en activering van de bibliotheek en het pakket met {r, include = FALSE} in de code chuck, als volgt:
    ''' {r, include = ONWAAR}
    # Installeer Tidyverse
    install.packages("tidyverse")
    ```
    OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar voorkomt dat er stukjes onnodige code worden weergegeven in het uiteindelijke html-, doc- of pdf-rapport.
  4. Voor een korte beschrijving van de specifieke functies van alle bibliotheken, samen met enkele nuttige links om meer informatie te verzamelen, raadpleegt u stap 3.4.1-3.4.11.
    1. Tidyverse - gebruik deze verzameling pakketten die worden gebruikt voor data science, waaronder gegevensinvoer, visualisatie, parsing en aggregatie en statistische modellering. Typisch, ggplot2 (data visualisatie) en dplyr (data wrangling en modeling) zijn praktische pakketten aanwezig in deze bibliotheek32.
    2. skimr - gebruik dit pakket voor het genereren van samenvattende statistieken van gegevensframes, inclusief identificatie van ontbrekende waarden33.
    3. vegan - gebruik dit pakket voor statistische analyses van gemeenschapsecologie, zoals het berekenen van op diversiteit gebaseerde statistieken (bijv. Alfa- en bètadiversiteit)34.
    4. forcats - gebruik dit pakket om te werken met categorische variabelen zoals het opnieuw ordenen van classificaties. Dit pakket is onderdeel van de Tidyverse library32.
    5. naniar - gebruik dit pakket om de verdeling van ontbrekende waarden over variabelen in een gegevensframe te visualiseren met behulp van de viss_miss() functie35.
    6. ggtree - gebruik dit pakket voor de visualisatie van fylogenetische bomen36.
    7. ggpubr - gebruik dit pakket om de kwaliteit van ggplot2-gebaseerde visualisaties37 te verbeteren.
    8. ggrepel - gebruik dit pakket voor tekstetikettering in grafieken38.
    9. reshape2 - gebruik de functie melt() uit dit pakket voor de transformatie van gegevensframes van breed naar lang formaat39.
    10. RColorBrewer - gebruik dit pakket om kleuren te beheren in ggplot2-gebaseerde visualisaties40.
    11. Gebruik de volgende basisfuncties voor verkennende gegevensanalyse: head() om de eerste waarnemingen in een gegevensframe te controleren, tail() om de laatste waarnemingen van een gegevensframe te controleren, is.na() om het aantal rijen met ontbrekende waarden in een gegevensframe te tellen, dim() om het aantal rijen en kolommen in een gegevensset te controleren, table() om waarnemingen over een variabele te tellen, en sum() om het totale aantal waarnemingen of instanties te tellen.

4. Gegevensinvoer en -analyse

OPMERKING: Gedetailleerde informatie over elke stap van deze analyse is te vinden in het beschikbare script (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd). Hier zijn echter enkele belangrijke punten waarmee rekening moet worden gehouden:

  1. Voer alle genomische gegevens in, inclusief alle genotypische classificaties (serovar, BAPS, ST en cgMLST) met de functie read_csv().
  2. Wijzig de naam, maak nieuwe variabelen en selecteer interessante kolommen uit elke gegevensset voordat u meerdere gegevenssets aggregatiet.
  3. Verwijder ontbrekende waarden niet uit een onafhankelijke gegevensset. Wacht totdat alle gegevenssets zijn samengevoegd om ontbrekende waarden te wijzigen of uit te sluiten. Als er voor elke gegevensset nieuwe variabelen worden gemaakt, worden ontbrekende waarden standaard gecategoriseerd in een van de nieuw gegenereerde classificaties.
  4. Controleer op foutieve tekens zoals koppeltekens of ondervragingstekens en vervang deze door NA (niet van toepassing). Doe hetzelfde voor ontbrekende waarden.
  5. Geaggregeerde gegevens op basis van de hiërarchische volgorde van genotypen (serovar -> BAPS1 -> ST -> cgMLST), en door groepering op basis van de individuele genoomidentificaties.
  6. Controleer op ontbrekende waarden met behulp van meerdere strategieën en behandel dergelijke inconsistenties expliciet. Verwijder alleen een genoom of isoleer uit de gegevens als de classificatie onbetrouwbaar is. Overweeg anders dat de analyse wordt uitgevoerd en verwijder NA's per geval.
    OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om een strategie op te stellen om a priori met dergelijke waarden om te gaan. Vermijd het verwijderen van alle genomen of isolaten met ontbrekende waarden voor variabelen. Een genoom kan bijvoorbeeld ST-classificatie hebben zonder cgMLST-variantnummer te hebben. In dat geval kan het genoom nog steeds worden gebruikt voor de op ST gebaseerde analyse.
  7. Zodra alle datasets zijn samengevoegd, wijst u ze toe aan een gegevensframenaam of -object dat op meerdere locaties kan worden gebruikt in de vervolganalyse, om te voorkomen dat u voor elke figuur in de paper hetzelfde metadatabestand moet genereren.

5. Voer analyses uit en genereer visualisaties

OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving van elke stap die nodig is om alle analyses en visualisaties te produceren, is te vinden in het afwaarderingsbestand voor dit artikel (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code). Code voor elke figuur wordt in stukjes gescheiden en het hele script moet sequentieel worden uitgevoerd. Bovendien wordt de code voor elk hoofd- en aanvullend cijfer als een afzonderlijk bestand verstrekt (zie Aanvullend dossier 1 en Aanvullend dossier 2). Hier zijn enkele essentiële punten (met codefragmenten) waarmee rekening moet worden gehouden bij het genereren van hoofd- en aanvullende cijfers.

  1. Gebruik ggtree om een fylogenetische boom samen met genotypische informatie te plotten (figuur 1).
    1. Optimaliseer de ggtree-figuurgrootte, inclusief diameter en breedte van ringen, door de numerieke waarden in respectievelijk de functies xlim() en gheatmap(width = ) te wijzigen (zie onderstaande voorbeeldcode).
      tree_plot <- ggtree(boom, lay-out = "cirkelvormig") + xlim(-250, NA)
      figure_1 <- gheatmap(tree_plot, d4, offset=.0, width=20, colnames = FALSE)
      OPMERKING: Voor een meer gedetailleerde vergelijking van programma's die kunnen worden gebruikt voor fylogenetische plotting, controleert u dit werk20. Het werk benadrukte een poging om strategieën te identificeren om op ggtree gebaseerde visualisaties te verbeteren, zoals het verkleinen van de datasetgrootte, maar taklengtes en boomtopologie waren niet zo duidelijk discriminerend in vergelijking met phandango41.
    2. Verzamel alle metagegevens in zo min mogelijk categorieën om de keuze van het kleurpaneel te vergemakkelijken bij het plotten van meerdere gegevenslagen met de fylogenetische boom (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_1.Rmd). Voer de gegevensaggregatie uit op basis van de vraag naar interesse en domeinkennis.
  2. Gebruik een staafdiagram om relatieve frequenties te beoordelen (figuur 2).
    1. Verzamel gegevens voor zowel ST-afstammingslijnen als cgMLST-varianten om visualisaties te vergemakkelijken. Kies een empirische of statistische drempel die wordt gebruikt voor gegevensaggregatie, terwijl u de vraag overweegt die wordt gesteld.
    2. Voor een voorbeeldcode die kan worden gebruikt om de frequentieverdeling van ST-afstammingslijnen te inspecteren om de afsnijding te bepalen, zie hieronder:
      st_dist <- d2 %>% group_by(ST) %>% # groep volgens de ST kolom
      count() %>% # tel het aantal waarnemingen
      arrange(desc(n)) # rangschik de tellingen in afnemende volgorde
    3. Voor een voorbeeldcode die laat zien hoe kleine (laagfrequente) ST's kunnen worden samengevoegd, raadpleegt u hieronder. Zoals hieronder wordt aangetoond, worden ST's die niet zijn genummerd als 5, 31, 45, 46, 118, 132 of 350, gegroepeerd als "Andere ST's". Gebruik een vergelijkbare code voor cgMLST-varianten (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_2.Rmd).
      d2$st <- ifelse(d2$ST == 5, "ST5", # maak een nieuwe ST-kolom waarvoor kleine S T's worden samengevoegd als Anderen
      ifelse(d2$ST == 31, "ST31",
      ifelse(d2$ST == 45, "ST45",
      ifelse(d2$ST == 46, "ST46",
      ifelse(d2$ST == 118, "ST118",
      ifelse(d2$ST == 132, "ST132", ifelse(d2$ST == 350, "ST350", "Andere ST's")))))))
  3. Gebruik een geneste benadering om het aandeel van elke ST-afstamming binnen elke BAPS1-subgroep te berekenen om ST's te identificeren die voorouderlijk gerelateerd zijn (behoren tot dezelfde BAPS1-subgroep) (figuur 3). De onderstaande code illustreert hoe de op ST gebaseerde verhouding kan worden berekend over BAPS1-subgroepen (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_3.Rmd):
    baps <- d2b %>% filter(serovar == "Newport") %>% # filter Newport serovars
    select(baps_1, ST) %>% # selecteer baps_1 en ST kolommen
    mutate(ST = as.numeric(ST)) %>% # verander ST kolom in numeriek
    drop_na(baps_1, ST) %>% # drop NA's
    group_by(baps_1, ST) %>% # groep op baps_1 en ST
    sum(n = n()) %>% # aantal waarnemingen
    mutate(prop = n/sum(n)*100) # verhoudingen berekenen
  4. Plot de verdeling van AMR-loci over ST-afstammingslijnen met behulp van de op Resfinder gebaseerde genannotatieresultaten (figuur 4).
    OPMERKING: Resfinder is op grote schaal gebruikt in ecologische en epidemiologische studies42. Annotatie van eiwitcoderende genen kan variëren, afhankelijk van hoe vaak databases worden samengesteld en bijgewerkt. Als de voorgestelde bioinformatica-pijplijn wordt gebruikt, kan de onderzoeker op AMR gebaseerde loci-classificaties in verschillende databases vergelijken20. Controleer welke databases voortdurend worden bijgewerkt. Gebruik geen verouderde of slecht beheerde databases om miscalls te voorkomen.
    1. Gebruik een empirische of statistische drempel om de belangrijkste AMR-loci eruit te filteren om visualisaties te vergemakkelijken. Geef een onbewerkt .csv bestand op met de berekende verhoudingen van alle AMR-loci over alle ST-afstammingslijnen, zoals hier weergegeven (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025687).
    2. Bereken de AMR-verhouding voor elke ST met behulp van de volgende code (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_4.Rmd):
      # Berekeningen voor ST45
      d2c <- data6 %>% filter(st == "ST45") # filter EERST ST45-gegevens
      # voor ST45, bereken het aandeel AMR loci en houd alleen een aandeel groter dan 10%
      d3c <- d2c %>% select(id, gen) %>% # select kolommen
      group_by(id, gen) %>% # groep op id en gen
      summarize(count = n()) %>% # aantal waarnemingen
      mutate(count = replace(count, count == 2, 1)) %>% # replace counts gelijk aan 2 met 1 om slechts één kopie van elk gen te overwegen (duplicaties zijn mogelijk niet betrouwbaar), maar de onderzoeker kan besluiten om ze uit te sluiten of te behouden. Als de onderzoeker ze wil uitsluiten, gebruik dan de filter(count != 2) functie of laat zoals het is
      filter(aantal <= 1) # filteraantallen onder of gelijk aan 1
      d4c <- d3c %>% group_by(gen) %>% # groep per gen
      summarize(value = n()) %>% # aantal waarnemingen
      mutate(total = table(data1$st)[6]) %>% # get the total counts of st mutate(prop = (value/total)*100) # calculate proportions
      d5c <- d4c %>% mutate(st = "ST45") # maak een st kolom en voeg ST informatie toe
    3. Nadat de berekeningen voor alle ST's zijn uitgevoerd, combineert u gegevenssets als één gegevensframe met behulp van de volgende code:
      # Combineer datasets
      d6 <- rbind(d5a, d5b, d5c, d5d, d5e, d5f, d5g, d5h) # row bind datasets
    4. Als u het .csv bestand met de berekende verhoudingen wilt exporteren, gebruikt u de code:
      # Exporteer gegevenstabel met ST- en AMR-loci-informatie
      abx_newport_st <- d6 write.csv(abx_newport_st,"abx_newport_st.csv", row.names = FALSE)
    5. Voordat u de op AMR gebaseerde verdeling over ST-afstammingslijnen plot, filtert u de gegevens op basis van een drempelwaarde om visualisaties te vergemakkelijken, zoals hieronder wordt weergegeven:
      # Filter AMR loci met een verhouding hoger dan of gelijk aan 10%
      d7 <- d6 %>% filter(prop >= 10) # bepaal de drempel empirisch of statistisch
  5. Plot de kern-genoom fylogenie samen met de hiërarchische genotypische classificaties en AMR-gegevens in een enkele plot met behulp van ggtree (figuur 5).
    1. Optimaliseer de figuurgrootte in ggtree met behulp van de bovengenoemde parameters (zie stap 5.1.1.).
    2. Optimaliseer visualisaties door variabelen samen te voegen of binaire classificatie te gebruiken, zoals de aan- of afwezigheid van genen. Hoe meer functies aan de plot worden toegevoegd, hoe moeilijker het kleurselectieproces wordt (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_5.Rmd).
      OPMERKING: Aanvullende cijfers - gedetailleerde beschrijving van de volledige code vindt u hier (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd).
  6. Gebruik een scatterplot in ggplot2, zonder gegevensaggregatie, om de verdeling van ST-afstammingslijnen of cgMLST-varianten weer te geven en tegelijkertijd de meest voorkomende genotypen te markeren (aanvullende figuur 1) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s1.Rmd).
  7. Voer een geneste analyse uit om de samenstelling van ST-afstammingslijnen te beoordelen aan de hand van het aandeel cgMLST-varianten om een glimp op te vangen van de op ST gebaseerde genetische diversiteit, terwijl de meest voorkomende varianten en hun genetische relaties worden geïdentificeerd (d.w.z. cgMLST-varianten die tot dezelfde ST behoren, deelden een voorouder recenter dan die van verschillende ST's) (aanvullende figuur 2 ) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s2.Rmd).
  8. Gebruik de gemeenschapsecologiemetrie, namelijk Simpson's D-index van diversiteit, om de mate van klonaliteit of genotypische diversiteit van elk van de belangrijkste ST-afstammingslijnen43 te meten (aanvullende figuur 3).
    1. Bereken de index van diversiteit tussen ST-afstammingslijnen op verschillende niveaus van genotypische resolutie, waaronder BAPS-niveau 1 tot en met 6 en cgMLST. Hieronder vindt u het codevoorbeeld over hoe u deze berekening uitvoert op BAPS-niveau 1 (BAPS1) van genotypische resolutie:
      # BAPS niveau 1 (BAPS1)
      # laat de ST's en BAPS1 vallen met NA's, groepeer op ST en BAPS1 en bereken vervolgens de simpsonsindex
      baps1 <- data6 %>%
      select(st, BAPS1) %>% # select kolommen
      drop_na(st, BAPS1) %>% # drop NA's
      group_by(st, BAPS1) %>% # groeperen op kolommen
      sum(n = n()) %>% # aantal waarnemingen
      mutate(simpson = diversity(n, "simpson")) %>% # bereken diversiteit
      group_by(st) %>% # groep per kolom
      summarise(simpson = mean(simpson)) %>% # bereken het gemiddelde van de index
      melt(id.vars=c("st"), measure.vars="simpson",
      variable.name="index", value.name="waarde") %>% # verborgen in lang formaat
      mutate(strat = "BAPS1") # create a strat column
      OPMERKING: Een meer genetisch diverse populatie (d.w.z. meer varianten op verschillende lagen van genotypische resolutie) heeft een hogere index op cgMLST-niveau en produceert een toenemende indexgebaseerde waarden gaande van BAPS-niveau 2 tot 6 (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s3.Rmd).
  9. Onderzoek de mate van genotypische diversiteit van ST-afstammingslijnen door de relatieve frequentie van BAPS-subgroepen op alle resolutieniveaus uit te zetten (BAPS1-6) (aanvullende figuur 4). Hoe diverser de populatie is, hoe spaarzamer de verdeling van BAPS-subgroepen (haplotypes) wordt van BAPS1 (lager resolutieniveau) naar BAPS6 (hoger resolutieniveau) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s4.Rmd).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door gebruik te maken van het computationele platform ProkEvo voor populatiegenomics-analyses, bestaat de eerste stap in bacteriële WGS-datamining uit het onderzoeken van de hiërarchische populatiestructuur in de context van een kerngenoomfylogenie (figuur 1). In het geval van S. enterica afstamming I, zoals geïllustreerd door de S. Newport dataset, is de populatie hiërarchisch gestructureerd als volgt: serovar (laagste resolutieniveau), BAPS1-subgroepen of haplot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van een systeemgebaseerde heuristische en hiërarchische populatiestructuuranalyse biedt een kader om nieuwe genomische handtekeningen in bacteriële datasets te identificeren die het potentieel hebben om unieke ecologische en epidemiologische patronen te verklaren20. Bovendien kan het in kaart brengen van accessoire genoomgegevens op de populatiestructuur worden gebruikt om voorouderlijk verworven en / of recent afgeleide eigenschappen af te leiden die de verspreiding van ST-afstammings...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door financiering door de UNL-IANR Agricultural Research Division en het National Institute for Antimicrobial Resistance Research and Education en door het Nebraska Food for Health Center van de Food Science and Technology Department (UNL). Dit onderzoek kon alleen worden voltooid door gebruik te maken van het Holland Computing Center (HCC) bij UNL, dat steun krijgt van het Nebraska Research Initiative. We zijn ook dankbaar dat we via de HCC toegang hebben tot middelen die worden geleverd door het Open Science Grid (OSG), dat wordt ondersteund door de National Science Foundation en het Office of Science van het Amerikaanse ministerie van Energie. Dit werk maakte gebruik van de Pegasus Workflow Management Software die wordt gefinancierd door de National Science Foundation (grant #1664162).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
amr_data_filteredhttps://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28758762
amr_data_rawhttps://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547994
baps_outputhttps://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548003
Core-genome phylogenyhttps://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548006
genome_srahttps://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28639209
Linux, Mac, of PCelke hoge-prestatie platform
mlst_outputhttps://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547997
sistr_outputhttps://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548000
figshare inloggegevens zijn vereist voor inloggen en toegang tot de bestanden

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grad, Y. H., et al. Genomic epidemiology of the Escherichia coli O104:H4 outbreaks in Europe, 2011. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (8), 3065-3070 (2012).
  2. Worby, C. J., Chang, H. -H., Hanage, W. P., Lipsitch, M. The distribution of pairwise genetic distances: a tool for investigating disease transmission. Genetics. 198 (4), 1395-1404 (2014).
  3. Leekitcharoenphon, P., et al. Global genomic epidemiology of Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104. Applied and Environmental Microbiology. 82 (8), 2516-2526 (2016).
  4. Alba, P., et al. Molecular epidemiology of Salmonella Infantis in Europe: insights into the success of the bacterial host and its parasitic pESI-like megaplasmid. Microbial Genomics. 6 (5), (2020).
  5. Zhou, Z., Alikhan, N. -F., Mohamed, K., Fan, Y. the Agama Study Group, Achtman, M. The EnteroBase user's guide, with case studies on Salmonella transmissions, Yersinia pestis phylogeny, and Escherichia core genomic diversity. Genome Research. 30 (1), 138-152 (2020).
  6. Azarian, T., et al. Global emergence and population dynamics of divergent serotype 3 CC180 pneumococci. PLOS Pathogens. 14 (11), 1007438(2018).
  7. Saltykova, A., et al. Comparison of SNP-based subtyping workflows for bacterial isolates using WGS data, applied to Salmonella enterica serotype Typhimurium and serotype 1,4,[5],12:i. PLOS ONE. 13 (2), 0192504(2018).
  8. Achtman, M., et al. Multi-locus sequence typing as a replacement for serotyping in Salmonella enterica. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002776(2012).
  9. Maiden, M. C. J., et al. Multi-locus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 3140-3145 (1998).
  10. Alikhan, N. -F., Zhou, Z., Sergeant, M. J., Achtman, M. A genomic overview of the population structure of Salmonella. PLOS Genetics. 14 (4), 1007261(2018).
  11. Gupta, A., Jordan, I. K., Rishishwar, L. stringMLST: a fast k-mer based tool for multi-locus sequence typing. Bioinformatics. 33 (1), 119-121 (2017).
  12. Jolley, K. A., Maiden, M. C. BIGSdb: Scalable analysis of bacterial genome variation at the population level. BMC Bioinformatics. 11 (1), 595(2010).
  13. Maiden, M. C. J., et al. MLST revisited: the gene-by-gene approach to bacterial genomics. Nature Reviews Microbiology. 11 (10), 728-736 (2013).
  14. Maiden, M. C. J. Multilocus sequence typing of bacteria. Annual Review of Microbiology. 60 (1), 561-588 (2006).
  15. Shapiro, B. J., Polz, M. F. Ordering microbial diversity into ecologically and genetically cohesive units. Trends in Microbiology. 22 (5), 235-247 (2014).
  16. Cordero, O. X., Polz, M. F. Explaining microbial genomic diversity in light of evolutionary ecology. Nature Reviews Microbiology. 12 (4), 263-273 (2014).
  17. Achtman, M., Wagner, M. Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nature Reviews Microbiology. 6 (6), 431-440 (2008).
  18. Abudahab, K., et al. PANINI: Pangenome neighbour identification for bacterial populations. Microbial Genomics. 5 (4), (2019).
  19. Laing, C. R., Whiteside, M. D., Gannon, V. P. J. Pan-genome analyses of the species Salmonella enterica, and identification of genomic markers predictive for species, subspecies, and serovar. Frontiers in Microbiology. 8, 1345(2017).
  20. Pavlovikj, N., Gomes-Neto, J. C., Deogun, J. S., Benson, A. K. ProkEvo: an automated, reproducible, and scalable framework for high-throughput bacterial population genomics analyses. PeerJ. 9, 11376(2021).
  21. McNally, A., et al. Combined analysis of variation in core, accessory and regulatory genome regions provides a super-resolution view into the evolution of bacterial populations. PLOS Genetics. 12 (9), 1006280(2016).
  22. Langridge, G. C., et al. Patterns of genome evolution that have accompanied host adaptation in Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 863-868 (2015).
  23. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PLoS ONE. 5 (3), 9490(2010).
  24. Page, A. J., et al. Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis. Bioinformatics. 31 (22), 3691-3693 (2015).
  25. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In silico typing resource (SISTR): An open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLOS ONE. 11 (1), 0147101(2016).
  26. Cheng, L., Connor, T. R., Siren, J., Aanensen, D. M., Corander, J. Hierarchical and spatially explicit clustering of DNA sequences with BAPS software. Molecular Biology and Evolution. 30 (5), 1224-1228 (2013).
  27. Tonkin-Hill, G., Lees, J. A., Bentley, S. D., Frost, S. D. W., Corander, J. Fast hierarchical Bayesian analysis of population structure. Nucleic Acids Research. 47 (11), 5539-5549 (2019).
  28. Seemann, T. MLST. GitHub. , Available from: https://github.com/tseemann/mist (2020).
  29. Seemann, T. ABRicate. GitHub. , Available from: https://github.com/tseemann/abricate (2020).
  30. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. at. Available from: https://cran.r-project.org (2021).
  31. Studio Team. RStudio: Integrated Development for R. Studio, PBC. , Boston, MA. Available from: http://www.rstudio.com (2020).
  32. Wickham, H., et al. Welcome to the Tidyverse. Journal of Open Source Software. 4 (43), 1686(2019).
  33. rOpenSci: The skimr package. GitHub. , Berkeley, CA. Available from: https://github.com/ropensci/skimr/ (2021).
  34. Oksanen, J., et al. vegan: Community ecology package. R package version 2.5-5. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=vegan (2019).
  35. Tierney, N. J., Cook, D. H. Expanding tidy data principles to facilitate missing data exploration, visualization and assessment of imputations. arXiv. , Available from: http://arxiv.org/abs/1809.02264 (2020).
  36. Yu, G. Using ggtree to visualize data on tree-like structures. Current Protocols in Bioinformatics. 69 (1), (2020).
  37. Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" Based Publication Ready Plots. R package version 0.4.0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
  38. Slowikowski, K. ggrepel: Automatically Position Non-Overlapping Text Labels with "ggplot2”. R package version 0.9.1. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggrepel (2021).
  39. Wickham, H. Reshaping Data with the reshape Package. Journal of Statistical Software. 21 (12), (2007).
  40. Neuwirth, E. RColorBrewer: ColorBrewer Palettes. R package version 1.1-2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=RColorBrewer (2014).
  41. Hadfield, J., Croucher, N. J., Goater, R. J., Abudahab, K., Aanensen, D. M., Harris, S. R. Phandango: an interactive viewer for bacterial population genomics. Bioinformatics. 34 (2), 292-293 (2018).
  42. Perron, G. G., et al. Functional characterization of bacteria isolated from ancient arctic soil exposes diverse resistance mechanisms to modern antibiotics. PLOS ONE. 10 (3), 0069533(2015).
  43. Mitchell, P. K., et al. Population genomics of pneumococcal carriage in Massachusetts children following introduction of PCV-13. Microbial Genomics. 5 (2), (2019).
  44. Klemm, E. J., et al. Emergence of host-adapted Salmonella Enteritidis through rapid evolution in an immunocompromised host. Nature Microbiology. 1 (3), 15023(2016).
  45. Břinda, K., et al. Rapid inference of antibiotic resistance and susceptibility by genomic neighbour typing. Nature Microbiology. 5 (3), 455-464 (2020).
  46. MacFadden, D. R., et al. Using genetic distance from archived samples for the prediction of antibiotic resistance in Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), (2020).
  47. Mageiros, L., et al. Genome evolution and the emergence of pathogenicity in avian Escherichia coli. Nature Communications. 12 (1), 765(2021).
  48. Yahara, K., et al. Genome-wide association of functional traits linked with Campylobacter jejuni survival from farm to fork. Environmental Microbiology. 19 (1), 361-380 (2017).
  49. Walter, J., Maldonado-Gómez, M. X., Martínez, I. To engraft or not to engraft: an ecological framework for gut microbiome modulation with live microbes. Current Opinion in Biotechnology. 49, 129-139 (2018).
  50. Maldonado-Gómez, M. X., et al. Stable engraftment of Bifidobacterium longum AH1206 in the human gut depends on individualized features of the resident microbiome. Cell Host & Microbe. 20 (4), 515-526 (2016).
  51. Zhao, S., et al. Adaptive evolution within gut microbiomes of healthy people. Cell Host & Microbe. 25 (5), 656-667 (2019).
  52. Treangen, T. J., Ondov, B. D., Koren, S., Phillippy, A. M. The Harvest suite for rapid core-genome alignment and visualization of thousands of intraspecific microbial genomes. Genome Biology. 15 (11), 524(2014).
  53. Letunic, I., Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation. Nucleic Acids Research. 49, 293-296 (2021).
  54. Croucher, N. J., et al. Rapid phylogenetic analysis of large samples of recombinant bacterial whole genome sequences using Gubbins. Nucleic Acids Research. 43 (3), 15(2015).
  55. Fenske, G. J., Thachil, A., McDonough, P. L., Glaser, A., Scaria, J. Geography shapes the population genomics of Salmonella enterica Dublin. Genome Biology and Evolution. 11 (8), 2220-2231 (2019).
  56. Lees, J. A., et al. Fast and flexible bacterial genomic epidemiology with PopPUNK. Genome Research. 29 (2), 304-316 (2019).
  57. Cohan, F. M. Towards a conceptual and operational union of bacterial systematics, ecology, and evolution. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 361 (1475), 1985-1996 (2006).
  58. Cohan, F. M., Koeppel, A. F. The origins of ecological diversity in prokaryotes. Current Biology. 18 (21), 1024-1034 (2008).
  59. Cohan, F. M. Transmission in the origins of bacterial diversity, from ecotypes to phyla. Microbial Transmission. 5 (5), 311-343 (2019).
  60. Davis, J. J., et al. The PATRIC bioinformatics resource center: expanding data and analysis capabilities. Nucleic Acids Research. 48, 606-612 (2019).
  61. Feng, Y., Zou, S., Chen, H., Yu, Y., Ruan, Z. BacWGSTdb 2.0: a one-stop repository for bacterial whole-genome sequence typing and source tracking. Nucleic Acids Research. 49, 644-650 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bacteri le populatiegenomicaWhole Genome SequencingProkEvo platformloci voor antimicrobi le resistentiefylogenie gestuurde mappingsequence type afstammingslijnencore genoomfylogeniegenotypische classificatie

Gerelateerde artikelen